1 משטחים פולימריים שינוי עם recCD47 הערה:. הפרוטוקול מסוכם סכמטי באיור 1 איור 1 א ממחיש דור של משטחים פולימריים תיאול-reactive איור 1 מדגים דור של recCD47 תיאול-reactive.. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון של PDT-BzPh (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ואשלגן ביקרבונט (KHCO 3) (0.7 מ&quot;ג / מ&quot;ל) במים סטריליים. מערבבים לילה ב 4 ° C (להגן מפני אור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים צינורות פולימריים לחתיכות ארוכות 40 סנטימטר (ארוך מספיק כדי להתאים סביב גלגלים מסתובבים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים צינורות בפתרון 0.1% מימיים של hexacylpyridinium ל90 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במכשירי צ&#39;נדלר Loop. יש לשטוף את הצינורות עם 3x מים סטריליים לאחר דקות 90 לספוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך לחומצת הפתרון של PDT-BzPh מיום 1 על ידי הוספת 15% monobasic אשלגן זרחה מימיים (KH 2 </sub&gt; PO 4). הוסף 50 μl KH 2 PO 4 לכל מ&quot;ל של PDT-BzPh, ויצר פתרון micellar מעונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הצינורות בפתרון PDT-BzPh acidified ל40 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במנגנון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצינורות עם חומצה אצטית מהולה (1: 1,000) פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הצינורות לקרינת UV למשך כולל של 60 דקות. סובב צינורות ¼ להפוך כל 15 דקות כדי להקרין את פני השטח כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הצינורות בתמיסה של אשלגן ביקרבונט / מ&quot;ל 20 מ&quot;ג (KHCO 3) ל20 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר או במנגנון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצינורות עם 3x מים סטריליים ולאחסן ב 4 ° C במים סטריליים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 5 מ&quot;ג Sulfo-SMCC ב200 dimethylformamide μl (DMF) (זהירות: בצע במנדף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון Sulfo-SMCC הכין בשלב 1 כדי 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של תמיסת פולי ליזין recCD47, ומערבבים ל60 דקות ב roטמפרטורת אום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך 60 מערבבים דק &#39;, דגת סטרילית בופר פוספט של Dulbecco (DPBS) ומניחים בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר Sulfo-SMCC הגיב recCD47 באמצעות טור 7K משקל מולקולרי חתוך ספין desalting לפי הוראות יצרן. אסוף זרימה דרך סופי (recCD47 תיאול-reactive באיכות גבוהה) ולדלל את נפח דרוש למעייל הפנימי של הצינור עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצינורות מיום 2 עם סטרילי, degassed 3x DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגיב משטח שונה של הצינורות עם פתרון של 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​עם טריס hydrochloride phosphine (2-carboxyethyl) (TCEP) בDPBS degassed פחות מ 2 דקות. יש לשטוף את הצינורות עם 4x DPBS degassed סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את recCD47 הגיב-Sulfo-SMCC לצינורות ודגירת הלילה בשעה 4 ° C על שייקר או במנגנון. </li></ol></li></ol> .2 Immunoassay כימות recCD47 על משטחים השתנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הצינורות שונה כדי לכמת מיום 3 שנינותDPBS 3x h. צינורות חנות אינו משמשים לכימות בDPBS על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בביופסית 4 מ&quot;מ כדי להפוך את דגימות צינור כפולות ומניח את האגרופים ביופסיה בבארות של צלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שליטה שלילית בהיקף של מדגם צינור ללא שינוי לא טופל בנוגדן זיהוי. הכן שליטת נוגדן המורכבת ממדגם צינור ללא שינוי טופל בנוגדן זיהוי. הכן את דגימות בדיקת צינורות שונה שטופלו בנוגדן זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות בלוק עם אלבומין 0.4% בסרום שור (BSA) בDPBS ל60 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חסימה, BSA לשאוב ולשטוף עם שנאגרו מלוח טריס בתוספת 1% 3x (TBST) 20-Tween, 10 דקות כל אחד על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול עבודה של נוגדן בBSA 0.4% בהתאם לדילול המומלץ של היצרן לimmunoassays. לדלל CD47 האנושי נוגדן B6H12-FITC 1: 100 בBSA 0.4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl דילול נוגדן לבארות מתאימות. אינקובטוריםבקרות שליליות te עם BSA 0.4% בלבד. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 60 דקות על שייקר (להגן מפני אור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם TBST 3x, 10 דקות כל אחד על שייקר. לשאוב שטיפת TBST האחרונה ולהוסיף 200 DPBS μl לבארות מדגם צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הזרימה דרך סופית, שהוא CD47 רקומביננטי תיאול-reactive באיכות גבוהה ולדלל את נפח דרוש למעייל הפנימי של צינורות עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו עוצמת אות FITC באמצעות קורא microplate עם עירור FITC (485 ננומטר) ופליטה (538 ננומטר) הגדרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב מחויב recCD47 למשטח פולימרים המבוססים על ערכים סטנדרטיים, והיוו אוטומטי הקרינה ואינה ספציפי מחייב ממדגם שליטת נוגדן. </li></ol> פרוטוקול מכשירים .3 צ&#39;נדלר Loop לחפש מוסדי מועצה לביקורת אישור (IRB) של פרוטוקול איסוף דם וניירת הסכמה מדעת לפני תחילת איסוף דגימות דם של בני אדם. השג מידעrmed הסכמת מתורם דם אדם. הערה: תרשים המתאר את המנגנון מוצג באיור 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא אמבט מים עם מים מזוקקים עד כ 1/2 של הגלגלים בקוטר שקועים. להוסיף מספיק אקונומיקה לאמבטיה המים כדי להפוך את פתרון אקונומיקה 10%. אמבטיה להגדיר מים ל37 מעלות צלזיוס ולאפשר טמפרטורה לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מתאמי מתכת (שמוצגים באיור 1 ב &#39;), צינורות ללא שינוי וצינורות שונה, ולהרכיב סביב גלגלי מנגנון, כפי שמוצג באיור 1 ג. ודא צינורות שמתאים מלבב סביב הגלגל עם מתאם המתכת במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג 30 מ&quot;ל דגימת דם באמצעות פרוטוקול שאושר IRB, בבקבוקון מלא מראש עם 2 מ&quot;ל של ציטראט או נוגדי קרישה אחרים, ומערבבים על ידי היפוך כדי למנוע קרישת פעם אחת את הדגימה שנאספה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כ 10 מ&quot;ל של דם לכל צינור באמצעות שסתום המתכת ומזרק, והשאיר קצת אוויר בצינור. אבטח את כובע השסתום וrסוב ל3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את הדם לתוך מבחנה פסולת שטופלה בתמיסת אקונומיקה 10% (או כפי שנדרש על ידי מדיניות מוסדית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות ולשטוף פנים צינורות עם DPBS כדי להסיר כל העקבות של דם. אסוף זרימה דרך בכוס הפסולת. השלך דם בהתאם למדיניות מוסדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את המכשירים וכל דם מחלקת משטחים באמצעות פתרון אקונומיקה 10% או פי מדיניות מוסדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תהליך למיקרוסקופ אלקטרונים מיקרוסקופי או סריקת ניאון כפי שתתוארנה להלן. </li></ol> .4 פלורסנט מיקרוסקופית וספירה תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון paraformaldehyde 4% (PFA) (זהירות: בצע במנדף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות ב4% פתרון PFA הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה הלילה, להסיר את PFA 4% ולשטוף סרטים מאוד בעדינות עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את צינורות לחלקים על מנת לחשוף את פני השטח לומן לצביעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתםסעיף של הצינור עם כמה טיפות של הרכבה תקשורת עם 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ל30 דקות בטמפרטורת חדר (להגן מפני אור). לאחר צביעה, יש לשטוף את צינורות בעדינות עם DPBS להפחית אות DAPI רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן DAPI ומצלמה דיגיטלית לספור את מספר התאים ב9 שדות בצורה עיוורת שנבחרו להציג תחת הגדלה 200X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשומה התא סופר לכל שדה ראיה ולבצע ניתוחים סטטיסטיים מתאימים כדי לקבוע מובהקות סטטיסטיות של תוצאות. </li></ol> .5 מיקרוסקופית אלקטרונים סורק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2% פתרון glutaraldehyde (זהירות: בצע במנדף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות בפתרון glutaraldehyde 2% בין לילה ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה הלילה, בעדינות לשטוף 3x צינורות עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1% מtetroxide אוסמיום (זהירות: סכנת משאיפת חמורה! השתמש במנדף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות בפתרון 1% מtetroxide אוסמיום 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את 3x צינורות עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרה של ריכוזי אתנול (25%, 50%, 75%, 95%, ו100% אתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את צינורות על ידי דגירה בסדרה של ריכוזי אתנול. דגירה ב25%, 50%, 75%, ו95% אתנול ל20 דקות כל אחד. דגירה ב100% אתנול למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקודה קריטית לייבש את צינורות עם CO 2 דקות 45 כדי להסיר את כל הלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי צינור הר על בדל דגימה עם דבק כסף או גרפיט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי צינור מעיל עם 12.5 ננומטר של זהב-פלדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. </li></ol>

<ol>
	<li>Bruck, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+applications+of+polymeric+materials.">Medical applications of polymeric materials.</a> Med. Prog. Technol. 9 (1), 1-16 (1982).</li><li>Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foreign+body+reaction+to+biomaterials.">Foreign body reaction to biomaterials.</a> Semin. Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).</li><li>Levy, J. H., Tanaka, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+response+to+cardiopulmonary+bypass.">Inflammatory response to cardiopulmonary bypass.</a> Ann. Thorac. Surg. 75, S715-S720 (2003).</li><li>Sperling, C., Maitz, M. F., Talkenberger, S., Gouzy, M. F., Groth, T., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+blood+reactivity+to+hydroxylated+and+non-hydroxylated+polymer+surfaces.">In vitro blood reactivity to hydroxylated and non-hydroxylated polymer surfaces.</a> Biomaterials. 28, 3617-3625 (2007).</li><li>Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+hemocompatibility+of+self-assembled+monolayers+displaying+various+functional+groups.">In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups.</a> Biomaterials. 26, 6547-6457 (2005).</li><li>Vasita, R., Shanmugam, I. K., Katt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+biomaterials+for+tissue+engineering+applications:+surface+modification+of+polymers.">Improved biomaterials for tissue engineering applications: surface modification of polymers.</a> Curr. Top. Med. Chem. 8, 341-353 (2008).</li><li>Subramanian, S., Parthasarathy, R., Sen, S., Boder, E. T., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+cell+type-specific+interactions+between+CD47+and+human+SIRPalpha.">Species- and cell type-specific interactions between CD47 and human SIRPalpha.</a> Blood. 107 (6), 2548-2556 (2006).</li><li>Tsai, R. K., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+'self'+engulfment+through+deactivation+of+myosin-II+at+the+phagocytic+synapse+between+human+cells.">Inhibition of 'self' engulfment through deactivation of myosin-II at the phagocytic synapse between human cells.</a> J Cell Biol. 180 (5), 989-1003 (2008).</li><li>Berg, T. K., vander Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+'self'+recognition:+a+role+for+CD47-SIRPalpha+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation.">Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends Immunol. 29 (5), 203-206 (2008).</li><li>Oldenborg, P. A., Zheleznyak, A., Fang, Y. F., Lagenaur, C. F., Gresham, H. D., Lindberg, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD47+as+a+marker+of+self+on+red+blood+cells.">Role of CD47 as a marker of self on red blood cells.</a> Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).</li><li>Stachelek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+CD47+modified+polymer+surfaces+on+inflammatory+cell+attachment+and+activation.">The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation.</a> Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2001).</li><li>Finley, M. J., Rauva, L., Alferiev, I. S., Weisel, J. W., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+and+activation+of+platelets+and+neutrophils+with+CD47+functionalized+blood+contacting+surfaces.">Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces.</a> Biomaterials. 33, 5803-5811 (2012).</li><li>Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+signaling+mechanisms+associated+with+CD47+modified+surfaces.">Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces.</a> Biomaterials. 34, 8640-8649 (2013).</li><li>Ravetch, J. V., Lanier, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+inhibitory+receptors.">Immune inhibitory receptors.</a> Science. 290, 84-89 (2000).</li><li>Chandler, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+thrombotic+coagulation+of+blood:+a+method+for+producing+a+thrombus.">In vitro thrombotic coagulation of blood: a method for producing a thrombus.</a> Lab Invest. 7, 110-114 (1958).</li><li>Thorsen, T., Klausen, H., Lie, R. T., Holmsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bubble-induced+aggregation+of+platelets:+effects+of+gas+species,+proteins,+and+decompression.">Bubble-induced aggregation of platelets: effects of gas species, proteins, and decompression.</a> Undersea Hyperb Med. 20 (2), 101-119 (1993).</li><li>Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+diagnostic+value+of+leukocyte+and+platlet+accumulations+around+&#8220;air+bubbles&#8221;+in+blood+after+venous+air+embolism.">Genesis and diagnostic value of leukocyte and platlet accumulations around &#8220;air bubbles&#8221; in blood after venous air embolism.</a> Intl J of Legal Med. 111 (1), 22-26 (1998).</li><li>Miller, R., Fainerman, V. B., W&#252;stneck, R., Kr&#228;gel, J., Trukhin, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+initial+period+of+protein+adsorption+by+dynamic+surface+tension+measurements+using+different+drop+techniques.">Characterization of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques.</a> Colloids and Surfaces A. 131 (1-3), 225-230 (1998).</li><li>Oeveren, W. V., Tielliu, I. F., de Hart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+modified+chandler,+roller+pump,+and+ball+valve+circulation+models+for+in+vitro+testing+in+high+blood+flow+conditions:+application+in+thrombogenicity+testing+of+different+materials+for+vascular+applications.">Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications.</a> Int J Biomater. 2012, (2012).</li></ol>

המחקר המדווח בפרסום זה נתמכה על ידי המכון הלאומי ליו הדמיה וההנדסה ביוטכנולוגיה, תחת מספר הפרסים R21 EB015612 (SJS), והלאומי ללב, ריאות ודם מכון, תחת מספר הפרסים T32 HL007915 (JBS וRJL), של הלאומי מכון לבריאות.

הכימיה photoactivation (המסוכמת באיור 1) מאפשרת לשינוי של כל משטח כמעט פולימר שיש פחמימנים מספיק כדי להקל על התקשרות PDT-BzPh וקרינת UV לאחר צילום להפעיל PDT-BzPh. Functionalizing משטח פולימרים עם קבוצות תיאול תגובתי מאפשר לקובץ המצורף שלאחר מכן של מגוון רחב של מולקולות הניתנות לבד...

נהלים רבים קליניים, כגון מעקף לב ודיאליזה, מחייבים את השימוש של צינורות דם פולימרים ולעתים קרובות קשורים לסיבוכים לאחר פרוצדורליים 1. כאשר perfused עם דם, פולימרים אלו לא חוקיים תגובת הגוף הזר (FBR), וכתוצאה מכך הספיחה של חלבוני דם וטסיות דם, הידבקות מונוציטים / מקרופאג, והשחרור של ציטוקינים פרו דלקתיים, כולם תורמים לסיבוכים וכדי שלאחר פרוצדורליים / או 2,3 כשל בהתקן. לפיכך, אסטרטגיות כדי לטפל בבעיה זו תישאר באזור חשוב ומתמשך של מחקר חומרים ביולוגיים. חוקרים ניסו לטפל בבעיה זו על ידי שינוי משטחי דם פנייה עם מולקולות ביו או bioinert 4-6. מחקר במעבדה שלנו התמקד בצירוף CD47 רקומביננטי (recCD47) לחומרים ביולוגיים פולימרים כאסטרטגיה לצמצום FBR ולהגדיל את היעילות של חומרים אלה. CD47 הוא transmembr הביע בכל מקוםחלבון ane עם תפקיד ידוע בהתחמקות חיסונית, מעמד של &quot;עצמי&quot; המקנה לי לבטא בתאים 7-10 ומופעים מבטיח בהענקת התאמה ביולוגית כאשר צורף למשטחים פולימריים 11-13. אות הרגולציה אלפא חלבון (SIRPα), קולטן מאותו המקור לCD47, וחבר במוטיב המבוסס על טירוזין immunoreceptor המעכב (עתים) המכיל משפחה של חלבונים הטרנסממברני, באה לידי ביטוי בתאים ממוצא מיאלואידית 14. אנחנו הוכחנו בעבר כי CD47, באמצעות איתות תא בתיווך SIRPα, למטה מסדיר את התגובות חיסוניות לפוליאוריטן (PU) ופולי ויניל כלוריד (PVC) במבחנה, vivo לשעבר, ובמודלי vivo 11-13. מרכזי לחקירות שלנו היא כימיה יחסית רומן photoactivation, שתתואר בהמשך, שבו קבוצות תיאול כימי תגובתי הן קוולנטית המצורפות לצינורות פולימריים ידי מגיב צינורות עם פולימר רב תכליתי (PDT-BZPh), מורכב מ2-pyridyldithio (PDT), benzophenone photoreactive (BzPh) וpolyallylamine-הותאם carboxy 11-13. צמצום קבוצות PDT המצורף קוולנטית עם טריס (2-carboxyethyl) hydrochloride phosphine (TCEP) 11 מניב משטח thiolated שיכול להיות לאחר מכן הגיב בmoieties הטיפולי. המפורטים כאן ובעבר 12,13, recCD47, הותאם עוד יותר עם ​​התוספת של זנב poly-ליזין C-מסוף 12,13, הוא הגיב עם Sulfosuccinimidyl-4 [N -maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) עבור שעה 1 כדי ליצור קבוצות תיאול-reactive, המאפשר קשר monosulfide היווצרות בין צינורות ו11 recCD47. היכולת אנטי דלקתית של משטחי CD47 פונקציונליות נבדקה, לשעבר יו o, באמצעות מכשירי צ&#39;נדלר Loop עם דם אנושי כולו, שתואר בשנת 1958 במקור כמודל במבחנה של קרישה טרומבוטיים 15. המנגנון מסתמך עלמערכת צינור סגורה באופן חלקי עם אוויר ומנוע סיבובי כדי להפיץ את הדם דרך צינורות 15. מודל ניסיוני זה מספק את ההזדמנות כדי לבחון את ההשפעה של חשיפת דם על משטחים שונה וללא שינוי, כמו גם את ההשפעה של שינויי שטח אלה על הפיסיולוגיה של תאי הדם. יכול יצורף recCD47 למגוון משטחים פולימריים באמצעות כימיה photoactivation זה, והיכולת אנטי דלקתית שלה ניתן להעריך על ידי ניצול מודל ex vivo רלוונטי קליני מחקה זלוף דם על משטחים פולימריים 11,12. צינורות דם קליניים כיתה שונה עם recCD47 להראות פחות באופן משמעותי הטסיות ומצורפת תא דלקתי בהשוואה לפולימרים ללא שינוי כאשר הם נחשפים לדם אדם במנגנון. תיאור צעד אחר צעד של תהליך שינוי זה הנו כמפורט להלן.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:107px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">58906</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">25% Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:175px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">AAA17876-AP&#160;</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">2-pyridyldithio,benzophenone (PDT-BzPH)</td>
			<td style="width:175px;">Synthesized in lab</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Citrate</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">S5770-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:175px;">Leica</td>
			<td style="width:107px;">DC500</td>
			<td>Out of production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dimethylformamide (DMF)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">270547-100ML</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:175px;">Gibco/Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:107px;">TE300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">A38-212</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Human CD47 (B6H12) &#8211; FITC Antibody</td>
			<td style="width:175px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:107px;">SC-12730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:175px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:107px;">197450050</td>
			<td>Caution! Use in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Potassium Bicarbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">237205-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">PVC Tubing (Cardiovascular Procedure Kit)</td>
			<td style="width:175px;">Terumo Cardiovascular Systems</td>
			<td style="width:107px;">60050</td>
			<td>Most clinical-grade tubing will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JSM-T330A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:269px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:269px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:175px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:107px;">Spectramax Gemini EM&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sulfo-SMCC</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">M6035-10MG</td>
			<td>Moisture Sensitive!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP-HCl)</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">20491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:269px;">Tris Base</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>T1503-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:269px;">Tween-20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-6531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Vectashield with DAPI</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">H-1200</td>
			<td>Light sensitive!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Zeba Spin Desalt Columns &#8211; 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">89891</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of the ex vivo chandler loop apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits

תגובת הגוף הזר מתרחשת כאשר משטח סינטטי הוא הציג לגוף. הוא מאופיין על ידי ספיחה של חלבוני דם ואת הקובץ המצורף וההפעלה הבאים של טסיות דם, מונוציטים / הידבקות מקרופאג, ואירועי תא איתות דלקתיים, שמוביל לסיבוכים לאחר פרוצדורליים. מכשירי צ&#39;נדלר Loop הוא מערכת ניסיונית המאפשרת לחוקרים ללמוד את יחסי גומלין המולקולריים ותאיים המתרחשים כאשר כמויות גדולות של דם הן perfused מעל תעלות פולימריים. לשם כך, מנגנון זה שמש כמודל ex vivo המאפשר ההערכה של התכונות אנטי דלקתיות של שינויי משטח פולימרים שונים. המעבדה שלנו הראתה כי תעלות דם, הותאמו קוולנטית באמצעות כימיה photoactivation עם CD47 רקומביננטי, יכולות להעניק biocompatibility למשטחים פולימריים. צירוף CD47 למשטחים פולימריים יכול להיות אמצעי יעיל לקידום היעילות של צינורות דם פולימריים. שלהעין היא מתודולוגיה המפרטת את הכימיה photoactivation נהגה לצרף CD47 רקומביננטי לתעלות רלוונטיות קליני פולימריים דם והשימוש בלולאת צ&#39;נדלר כvivo לשעבר מודל ניסיוני לבחינת אינטראקציות דם עם תעלות CD47 שונה ושליטה.

יצירת משטחים פולימריים תיאול-reactive באמצעות PDT-BzPh וTCEP יחד עם תיאול-reactive פולי ליזין recCD47 באמצעות SMCC מאפשרת החיבור של recCD47 למשטחים פולימריים. תהליך השינוי הוא סיכם באופן סכמטי באיור 1. הנוחות של תהליך השינוי הזה היא שהוא יכול להיות מיושם על חלבונים רבים ושונים ומש...

Watch this Scientific Journal Video about The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits at JoVE.com

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits.

השימוש ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; מכשירי צ&#39;נדלר Loop להערכת Biocompatibility של צינורות דם פולימרית השתנה

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

the-use-ex-vivo-chandler-loop-apparatus-to-assess-biocompatibility

Research

JoVE Journal

Bioengineering

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

11.5K Views.  The Children's Hospital of Philadelphia. Blood exposure to polymeric blood conduits initiates the foreign body reaction that has been implicated in clinical complications. Here, the Chandler Loop Apparatus, an experimental tool mimicking blood perfusion through these conduits, is described. Appendage of recombinant CD47 results in decreased evidence of the foreign body reaction on these conduits. 

Video: The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דגם זלוף שליה אנושי

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Transfection גן לתאי ספרואיד על צלחות micropatterned תרבות להשתלת תאים גנטיות-שונה

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential to establish an ex vivo model that can evaluate SIM performance accurately, for developing high-performance SIMs. In our previous study, we developed a new ex vivo model that can be used to evaluate the performance of various SIMs in detail by applying constant tension to the specimen&#39;s ends. We also confirmed that the proposed new ex vivo model allows accurate submucosal elevation height (SEH) measurement under uniform conditions and detailed comparisons of the performances of various types of SIMs. Here, we describe the new ex vivo model and explain the detailed setup methodology of this model. Since all parts of the new model were easy to obtain, the setup of the new model could be completed quickly. SEH of various SIMs could be measured more accurately by using the new model. The critical factor that determines SIM performance can be identified using the new model. SIM development speed will drastically increase after the factor has been identified.

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

We developed a new ex vivo model that applies constant tension to the porcine gastric specimen. This development made it possible to evaluate the performance (the height and duration of the submucosal elevation) of various SIMs accurately.&#160; The detailed setup methodology of this new model is explained.

מודל לשעבר Vivo חדש על ההערכה של ביצועי חומרים הזרקה Submucosal אנדוסקופי

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

מהצד הפנים-לב-אש קטטר אור עבור ניטור מטבוליזם הסלולר באמצעות בליעה בספיגת העבר של הלבבות המגברים

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...

Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler modes, it has several limits. Firstly, a finely tuned signal filtering operation is needed to distinguish blood flows from surrounding moving tissues. Secondly, the operator must choose between localizing the blood flows or quantifying them. In the last two decades, ultrasound imaging has undergone a paradigm shift with the emergence of ultrafast ultrasound using unfocused waves. In addition to a hundredfold increase in framerate (up to 10000 Hz), this new technique also breaks the conventional quantification/localization trade-off, offering a complete blood flow mapping of the field of view and a simultaneous access to fine velocities measurements at the single-pixel level (down to 50 &#181;m). This data continuity in both spatial and temporal dimensions strongly improves the tissue/blood filtering process, which results in an increase sensitivity to small blood flow velocities (down to 1 mm/s). In this method paper, we aim to introduce the concept of ultrafast Doppler as well as its main parameters. Firstly, we summarize the physical principles of unfocused wave imaging. Then, we present the Doppler signal processing main steps. Particularly, we explain the practical implementation of the critical tissue/blood flow separation algorithms and on the extraction of velocities from these filtered data. This theoretical description is supplemented by in vitro experiences. A tissue phantom embedding a canal with flowing blood-mimicking fluid is imaged with a research programmable ultrasound system. A blood flow image is obtained and the flow characteristics are displayed for several pixels in the canal. Finally, a review of in vivo applications is proposed, showing examples in several organs such as carotids, kidney, thyroid, brain and heart.

This protocol shows how to apply ultrafast ultrasound Doppler imaging to quantify blood flows. After a 1 s long acquisition, the experimenter has access to a movie of the full field of view with axial velocity values for each pixel every &#8776;0.3 ms (depending on the ultrasound time of flight).

הדמיית זרימת דם עם דופלר אולטרה מהיר

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

&quot;Avatar&quot;- Optimized Ex Vivo Work Loop Experiment to Emulate In Vivo Muscle Force

"Avatar", a Modified Ex vivo Work Loop Experiments Using In vivo Strain and Activation

Movement behaviors are emergent features of dynamic systems that result from muscle force production and work output. The interplay between neural and mechanical systems occurs at all levels of biological organization concurrently, from the tuning of leg muscle properties while running to the dynamics of the limbs interacting with the ground. Understanding the conditions under which animals shift their neural control strategies toward intrinsic muscle mechanics (&#39;preflexes&#39;) in the control hierarchy would allow muscle models to predict in vivo muscle force and work more accurately. To understand in vivo muscle mechanics, ex vivo investigation of muscle force and work under dynamically varying strain and loading conditions similar to in vivo locomotion is required. In vivo strain trajectories typically exhibit abrupt changes (i.e., strain and velocity transients) that arise from interactions among neural activation, musculoskeletal kinematics, and loads applied by the environment. The principal goal of our &#34;avatar&#34; technique is to investigate how muscles function during abrupt changes in strain rate and loading when the contribution of intrinsic mechanical properties to muscle force production may be highest. In the &#34;avatar&#34; technique, the traditional work-loop approach is modified using measured in vivo strain trajectories and electromyographic (EMG) signals from animals during dynamic movements to drive ex vivo muscles through multiple stretch-shortening cycles. This approach is similar to the work-loop technique, except that in vivo strain trajectories are scaled appropriately and imposed on ex vivo mouse muscles attached to a servo motor. This technique allows one to: (1) emulate in vivo strain, activation, stride frequency, and work-loop patterns; (2) vary these patterns to match in vivo force responses most accurately; and (3) vary specific features of strain and/or activation in controlled combinations to test mechanistic hypotheses.

Author Spotlight: Bridging the Gap Between In Vivo and Ex Vivo Studies with the &quot;Avatar&quot; Technique to Advance Muscle Mechanics Research 

This article details the methodology for emulating in vivo muscle force production during ex vivo work loop experiments using an "avatar" muscle from a laboratory rodent to assess the contributions of strain transients and activation to the muscle force response.

Movement behaviors are emergent features of dynamic systems that result from muscle force production and work output. The interplay between neural and ...

Preparation of Cardiomyocytes and Setting-Up the Apparatus for the Slow Injection Method

Prepare the 10%gelatin stock solution by weighing and dissolving the gelatin in the ADS buffer, and autoclaving the solution. Rewarm the 10%gelatin stock at 37 degrees Celsius, until it becomes liquid. Then dilute the gelatin stock, using a prewarmed ADS buffer, to obtain the final injectable 5%gelatin solution.Suspend 96 cardiomyocyte balls in 100 microliters of prewarmed injection solution. Load the cardiomyocyte ball suspension into the cell injection syringe without aspirating the excess air. Next, hold the syringe vertically, with the needle facing upward, and tap the syringe to collect the bubbles at the upper ridge of the syringe.Also, observe the cardiomyocyte balls gradually settling onto the rubber seal of the plunger. Maintain the vertical position of the syringe, and slowly push the plunger to discard the bubbles and excess cell suspension solution, until 20 microliters of the cell suspension remain in the syringe, and the cardiomyocyte ball remains resting on the rubber seal of the plunger. Once done, immerse the capped syringe in an ice bath for five minutes, and fix the injection syringe apparatus on the animal stage before activating the main syringe pump during percutaneous cell transplantation in an anesthetized rat.

הכנת קרדיומיוציטים והגדרת המנגנון לשיטת ההזרקה האיטית

ניתוח מודלים של מחסום דם-מוח באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

מחבר זרקור: קידום השימוש בטכנולוגיית שבבי רקמות לחקר רקמות אנושיות 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...