מחקר זה נתמך בחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF 1,227,359), תכנית WVU EPSCoR מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (EPS-1,003,907), המשרד מראש WVU בחסות הקרן הלאומי למדע (1,007,978), וWVU PSCoR, בהתאמה. עבודת microfabrication נעשתה במתקני WVU משותפים מחקר (מתקני חדר נקיים) ומחקר נייד אינטגרטיבית Microfluidic במעבדת צ&#39;יפ (שבב מעבדה) באוניברסיטת וירג&#39;יניה המערבית. ההדמיה confocal נעשתה במתקן ההדמיה מיקרוסקופ WVU.

1. ייצור photolithography של עובש מאסטר Photoresist הפרוטוקול הבא מציג את התהליך לפברק את microchannels עם קטרים ​​בין 30-60 מיקרומטר. כדי לקבל microchannel בקוטר קטן (פחות מ 30 מיקרומטר), ציפוי ספין יחיד של photoresist יש צורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר photoresist הזרמה מחדש מהמקרר ב 4 מעלות צלזיוס לחדר הנקיה 24 שעות לפני השימוש ולאפשר לו להתחמם לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לנקות את פרוסות סיליקון ולאפות אותו במשך שעה אחת בכל 150 ° C כדי לאפשר לו להתייבש. ההתייבשות תסייע להידבקות photoresist מצע סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מעיל השכבה הראשונה של photoresist באמצעות המתכון הבא: </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שלב </td><td> זמן (שניות) </td><td> מהירות (סל&quot;ד) </td><td> ההאצה </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 &lt;/ P&gt; <td> 300 </td><td> הגבוה ביותר </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 3 </td><td> 300 </td><td> הגבוה ביותר </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 60 </td><td> 600 </td><td> הגבוה ביותר </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 10 </td><td> 500 </td><td> הגבוה ביותר </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 600 </td><td> הגבוה ביותר </td></tr></tbody></table><ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, לאפות את רקיק על פלטה חמה עם טמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר לאפות הרכה בעובי של photoresist יהיה 20-30 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין מעיל שכבה שנייה של photoresist בעקבות אותו המתכון המשמש לשכבה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפות רך רקיק שוב על ידי הצבתו על פלטה חמה עם טמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר לאפות רך זה העובי של photoresist יהיה 40-60 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור דפוסי אב חיוביים על ידי חשיפת photoresist לאור UV עם מינון חשיפה של 14,500 mJ / 2 ס&quot;מ באמצעות מסכת סרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את היזם עם מים (DI) deionized (1:2 (V / V)). שוטפים את פרוסות שוב ושוב בפתרון עד שהדפוס הוא מפותח. לאחר מכן לשטוף עם מים די רקיק ולייבש אותו באמצעות גז חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרמה מחדש: הנח את פרוסות על פלטה חמה עם טמפרטורה של 120 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות ומכסים בצלחת פטרי זכוכית כדי למנוע אידוי ממס. הסר את רקיק מהפלטה החמה ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת חדר. עובי photoresist לאחר הזרמה מחדש יהיה 50-60 מיקרומטר. </li></ol> 2. ייצור יתוגרפיה רך של רשת microchannel PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון polydimethylsiloxane (PDMS) במשקל היחס של 10:1 (בסיס: סוכן ריפוי) ולערבב אותו ביסודיות בעזרת מערבל צנטריפוגלי פלנטרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטיל את פתרון PDMS על תבנית המאסטר photoresist הוזרם מחדש. הנח את PDMS casted בייבוש למשך 15 דקות לדגה. השתמש בגז חנקן כדי להסיר כל בועות שנותרו במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים בתנור PDMS בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות כדי לאפשר לו לרפא. ואז להסיר את שכבת PDMS נרפא מעובש האב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אגרופן חידד ליצור חורי כניסה / יציאה על ידי ניקוב חורים ברשת הערוץ. נקה את פני השטח של PDMS שימוש בגז חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול בשתי שכבות PDMS עם פלזמה חמצן במשך 30 שניות בתוך שואב פלזמה בלחץ הפעלה של טור 4.5 x 10 -2 וקצב זרימת חמצן של 3.5 רגל 3 / דקה. לאחר מכן, ליישר את פני השטח של PDMS ידני תחת מיקרוסקופ אופטי. השתמש בטיפת מים במידת צורך לשליטה טובה יותר ביישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופים את המכשיר בתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להשיג מליטה קבועה. </li></ol> 3. תרבות HUVEC וזריעה בצ&#39;יפ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות HUVECs עם מדיום התרבות עם L-גלוטמין בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS). עבור הקטעי ניסוי דואר בין 2 ל 5 היו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהם HUVECs מחוברות, לספור את התאים ולקצור אותם על ידי השטיפה הראשונה את התאים עם HEPES נאגר תמיסת מלח (HEPES-BSS), ולאחר מכן טיפול בתאים עם טריפסין / EDTA דגירה של 2-6 דקות על 37 ° C. לאחר trypsinization הושלם, לנטרל את טריפסין / EDTA עם פתרון נטרול טריפסין. צנטריפוגה ולהשעות את התאים במדיום התרבות עם 8% dextran כדי לאסוף אותם. Dextran שימש כדי להגדיל את הצמיגות בינונית כדי לסייע בזריעת תאים טובה יותר וקובץ מצורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את המכשיר עם פלזמה חמצן במשך 5 דקות עם לחץ הפעלה של 10 -2 טור x 4.5 וקצב זרימת חמצן של 3.5 רגל 3 / דקה. ואז לטעון את המכשיר עם מים די ולטפל עם אור UV במשך 8 שעות בבטיחות ביולוגית ברדס למינרית לעיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני שהתאים מוכנים, לשטוף את המכשיר עם 1x בופר פוספט (1x PBS) ולאחר מכן עם מעיל פיברונקטין (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל, דילuted עם 1x PBS) ודגירה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ציפוי פיברונקטין, לשטוף את המכשיר עם 1x PBS לאחר מכן לטעון עם מדיום לתרבות. דגירה את המכשיר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון את תאי HUVEC ב8% מדיום תרבות dextran עם ריכוז תא של 3-4 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. מקום טיפת μl 20 של תאים בכניסה לאחד את המכשיר ולהטות אותו כדי להציג את התאים לתוך ערוץ microfluidic. לאחר 15-20 דקות התאים יתחילו לצרף את הקירות הצדדיים של הערוצים. לסובב את המכשיר כל 15 דקות כדי ליצור התפלגות אחידה יותר של תאים. במידת צורך, ניתן לבצע טעינה נוספת. </li></ol> 4. התקנת זלוף לטווח ארוך לאחר 5-6 שעות של תרבות סטטי, את HUVECs המצורף יתחיל להתפזר באופן מלא. הגדר זלוף באמצעות מערכת משאבת מזרק נשלט מרחוק עם זרם קבוע של 10 μl / שעה. זלוף יכול להיות מותאם Fאו שיעור גבוה יותר זרימה, ויכול להימשך פרק זמן שבין 4 ימים לשבועות 2. 5. מכתים תא ואפיון מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים מגיעים למפגש בתוך המכשיר, ראשית, לשטוף את המכשיר עם 1x PBS להסיר את המדיום באופן יסודי. ואז לטעון את המכשיר עם צבע אדום מדוללים עם מדלל (4 μl-1 מ&quot;ל). טען את הצבע הדומה להליך טוען תא. דגירה את המכשיר בחושך במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף את המכשיר עם התרבות בינונית כדי לעצור את הכתמים. דגירה ארוכה של הצבע יכולה לגרום לרעילות וdisadhesion סלולריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את המכשיר בצבע כחול מדוללים עם 1x PBS (2 טיפות לכל מ&quot;ל). דגירה בחושך במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר ולאחר מכן לשטוף ביסודיות את המכשיר עם 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את מכתים התא תחת מיקרוסקופ אופטי הפוך. אם הכתמים היו טובים, לטעון את microchannels עם מדיום קיבוע (3.5% בדילול paraformaldehyde עם 1x PBS), ואז לצלולהמכשיר בתיקון בינוני ולכסות אותו לחלוטין עם רדיד אלומיניום. אחסן את המכשיר במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע את המכשיר מהתייבשות וphotobleaching. המכשיר הקבוע מוכן כעת להדמית confocal, אשר יכול להיעשות על ידי סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal. </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

<html> 1. ייצור עובש מאסטר אחד העקרונות המנחים את עיצוב ולmorphometry כלי דם ידוע כדין של מוריי 16, שבו נקבע כי חלוקת קטרי כלי ברחבי הרשת נשלטת על ידי שיקול מינימום אנרגיה. גם הוא קובע כי הקובייה של הקטרים ​​של כלי הורה בהסתעפות שווה לסכ...

Microvessels, כחלק ממערכת מחזור הדם, לתווך האינטראקציות בין דם וברקמות, תומך בפעילות המטבולית, להגדיר microenvironment רקמות, ולשחק תפקיד קריטי במצבים פתולוגיים רבות ובריאות. שחזור של microvessels תפקודי במבחנה יכול לספק פלטפורמה למחקר של תופעות כלי דם מורכבות. עם זאת, מקובל במבחני microvessel מבחנה, כגון מבחני נדידת תאי אנדותל, מבחני היווצרות צינור אנדותל, מבחני טבעת אבי העורקים חולדה ועכבר, לא מצליחין לשחזר את in vivo microvessels ביחס לגיאומטריה (3D) תלת ממדים ובקרת זרימה רציפה 1-8. מחקרים של microvessels באמצעות מודלים של בעלי חיים ובמבחני vivo, כגון assay אנגיוגנזה בקרנית, assay אנגיוגנזה קרום chorioallantoic אפרוח, וassay תקע Matrigel, הם יותר גוזלים זמן, גבוהים בעלות, מאתגרים ביחס להתבוננות וquantifications, ולהעלות סוגיות אתיות 1, 9-13. התקדמות בmicromanufacturing וטכנולוגיות שבב microfluidic אפשרה מגוון של תובנות המדעים ביו תוך צמצום העלויות והמורכבויות הניסיוניות הגבוהות הקשורות בבעלי חיים ובvivo 14 מחקרים, כגון תנאים ביולוגיים לשלוט בקלות ובאופן הדוק וסביבות fluidic דינמיות, שלא היה היה אפשרי עם טכניקות macroscale קונבנציונליות. כאן, אנו מציגים גישה לבנות endothelialized microchannels-on-a-chip אשר מחקה את הגיאומטריה 3D של in vivo microvessels ופועל תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת על ידי שימוש בשילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent/Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflow Photoresist</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZP4620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developer</td>
			<td>AZ Electronic Materials</td>
			<td>AZ 400K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 131 Culture Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10372-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NacBlue Nuclei Staining</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKH Red Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MINI26 and PKH26GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffered Saline Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Neutralizing Solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Curing Agent</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diluent C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CGLDIL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst33342</td>
			<td>Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td>R37605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner</td>
			<td>Laurell Technologies Corporation</td>
			<td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>BelArt Products</td>
			<td>999320237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump System</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Biosafety Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary Centrifugal Mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-246-516GAQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Invertoskop 40C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne Cimarec</td>
			<td>SP131635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

procedure for the development of multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip

מאמצים כבר התמקדו בפיתוח במבחני חוץ גופית ללימוד microvessels משום in vivo מחקרים בבעלי החיים נמצאים זמן רב יותר, יקר, ותצפית וכימות הם מאוד מאתגרים. עם זאת, יש לי קונבנציונלי במבחני microvessel מבחנה מגבלות כאשר מייצגים in vivo microvessels ביחס לגיאומטריה תלת ממדי (3D) ומתן זרימת נוזל רציף. באמצעות שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה, פיתחנו endothelialized חתך עגול רב מעמיק microchannels-on-a-chip, אשר מחקה את הגיאומטריה 3D של in vivo microvessels ופועל תחת זלוף הרציף המבוקר זרימה. Photoresist reflowable חיובי שימש לפברק עובש הורים עם רשת microchannel חתך חצי עגולה. על ידי היישור והמליטה של ​​שני polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated מעובש האב, רשת microchannel גלילית נוצרה. בקטרים ​​של microchannels יכולים להיות מבוקרים היטב. בנוסף לכך, תאים ראשוניים אדם טבור וריד אנדותל (HUVECs) נזרעו בתוך השבב הראו כי התאים מרופדים משטח הפנימי של microchannels תחת זלוף המבוקר שנמשך פרק זמן בין 4 ימים ועד 2 שבועות.

הגישה שלנו לפברק רשת microchannel רב מעמיקה מחקה את גיאומטריות 3D המורכבות של in vivo microvessels, שבו יש לי microchannels מעוגל חתכים 15. בנוסף, בקטרים ​​של ערוצי הסתעפות הוריים ובת הערוצים כ לציית לחוק של מוריי לשמירה על זרימת הנוזל ברמה נדרשת, כך שהתנגדות הערוץ הכללית היא נמו?...

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip at JoVE.com

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת, ויכולה להיות מיושמת למחקר כלי הדם.

הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

procedure-for-development-multi-depth-circular-cross-sectional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.8K Views.  West Virginia University.  פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמ...

Video: Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

נוהל הנדסה ריאות

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based whole organ decellularization has recently gained interest in the field of tissue engineering as a means to create site-specific extracellular matrix scaffolds, while largely preserving the native architecture of the scaffold. To date, this approach has been utilized in a variety of organ systems, including the heart, lung, and liver 1-5. Previous decellularization methods for tissues without an easily accessible vascular network have relied upon prolonged exposure of tissue to solutions of detergents, acids, or enzymatic treatments as a means to remove the cellular and nuclear components from the surrounding extracellular environment6-8. However, the effectiveness of these methods hinged upon the ability of the solutions to permeate the tissue via diffusion. In contrast, perfusion of organs through the natural vascular system effectively reduced the diffusion distance and facilitated transport of decellularization agents into the tissue and cellular components out of the tissue. Herein, we describe a method to fully decellularize an intact porcine heart through coronary retrograde perfusion. The protocol yielded a fully decellularized cardiac extracellular matrix (c-ECM) scaffold with the three-dimensional structure of the heart intact. Our method used a series of enzymes, detergents, and acids coupled with hypertonic and hypotonic rinses to aid in the lysis and removal of cells. The protocol used a Trypsin solution to detach cells from the matrix followed by Triton X-100 and sodium deoxycholate solutions to aid in removal of cellular material. The described protocol also uses perfusion speeds of greater than 2 L/min for extended periods of time. The high flow rate, coupled with solution changes allowed transport of agents to the tissue without contamination of cellular debris and ensured effective rinsing of the tissue. The described method removed all nuclear material from native porcine cardiac tissue, creating a site-specific cardiac ECM scaffold that can be used for a variety of applications.

A method to rapidly and completely remove cellular components from an intact porcine heart through retrograde perfusion is described. This method yields a site specific cardiac extracellular matrix scaffold which has the potential for use in multiple clinical applications.

נוהל Decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

שיטות לאפיון Co-הפיתוח של Biofilm ובית גידול הטרוגניות

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

מוצקים שומנים חלקיקים (SLNs) אפליקציות לתאיות מיקוד

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

אפיון איכותי של השבר מימית מ הידרותרמיות עיבוי של אצות באמצעות גז כרומטוגרפיה 2D עם זמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Standard Test Method ASTM D 7998-19 for the Cohesive Strength Development of Wood Adhesives

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the adhesive cure, and the effect of adhesive penetration on the wood interphase; thus, normal testing of a neat adhesive film is generally not useful. Most tests of wood adhesive bond strength are slow, laborious, can be strongly influenced by the wood and do not provide information on the kinetics of cure. Test method ASTM D 7998-19, however, can be used for fast evaluation of the strength of wood bonds. The use of a smooth, uniform, and strong wood surface, like maple face-veneer, and sufficient bonding pressure reduces the adhesion and wood strength effects on bond strength. This method has three main applications. The first is to provide consistent data on bond strength development. The second is to measure the dry and wet strengths of bonded lap shear samples. The third is to better understand the adhesive heat resistance by quickly evaluating thermal sensitivity and distinguishing between thermal softening and thermal degradation.

We present a procedure, ASTM D7998-19, for a rapid and more consistent evaluation of both dry and wet strength of adhesive bonds on wood. The method can also be used to provide information on strength development as a function of temperature and time or strength retention up to 250 &#176;C.

שיטת בדיקה סטנדרטית ASTM D 7998-19 לפיתוח חוזק מלוכד של דבקי עץ

The properties of cured wood adhesives are difficult to study because of the loss of water and other components to the wood, the influence of wood on the ...

Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and size distribution of nanoparticles is of utmost importance for various applications. The size range is also important, as it defines the most &#8220;active&#8221; component of a nanoparticle dose.
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation (AF4) is a powerful technique for sizing of particles in suspension in the size range of approximately 1&#8211;1000 nm. There are several ways to derive size information from an AF4 experiment. Besides coupling AF4 online with size-sensitive detectors based on the principles of Multi-Angle Light Scattering or Dynamic Light Scattering, there is also the possibility to correlate the size of a sample with its retention time using a well-established theoretical approach (FFF theory) or by comparing it with the retention times of well-defined particle size standards (external size calibration).
We here describe the development and in-house validation of a standard operating procedure (SOP) for sizing of an unknown gold nanoparticle sample by AF4 coupled with UV-vis detection using external size calibration with gold nanoparticle standards in the size range of 20&#8211;100 nm. This procedure provides a detailed description of the developed workflow including sample preparation, AF4 instrument setup and qualification, AF4 method development and fractionation of the unknown gold nanoparticle sample, as well as the correlation of the obtained results with the established external size calibration. The SOP described here was eventually successfully validated in the frame of an interlaboratory comparison study highlighting the excellent robustness and reliability of AF4 for sizing of nanoparticulate samples in suspension.

This protocol describes the use of Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation coupled with UV-vis detection for the determination of the size of an unknown gold nanoparticle sample.

שבר זרימה א-סימטרי שדה זרימה לשינוי גודל של חלקיקי זהב בהשעיה

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...