מחקר שפורסם בפרסום זה נתמכה על ידי העין הלאומית של המכון הלאומי לבריאות במספרי הפרס: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) וP30EY014104. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. תמיכה נוספת מסופק על ידי מסצ&#39;וסטס אריות חקר העין הקרן (KMC) וScholar פרס מיוחד ממחקר למניעת עיוורון (למועצת הקיבוץ המאוחדת).

כל הניסויים בבעלי חיים יטופלו בהתאם לעמותה למחקר בהצהרת חזון ורפואת עיניים לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון, ואת ההנחיות והתקנות שנקבעו על ידי Eye מסצ&#39;וסטס ואוזן ועדת טיפול בבעלי חיים מרפאת. היום לפני הניסוי: 1. הכנת Tubing ללשכת תזרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את צד הצוואר, להתחבר 1 סנטימטר PE10 צינורות פוליאתילן לצינורות סיליקון 6 סנטימטר ואחרי צינורות פוליאתילן 5 סנטימטר. לצד הראש, להכין באופן דומה לצד הצוואר עם התוספת של T-צינור בתוך צינור סיליקון 6 סנטימטר על 1.5 סנטימטרים מצינורות פוליאתילן 1 סנטימטר (איור 1 א &#39;, ב&#39;). על מנת להכניס את T-הצינור, להרחיב את צינור סיליקון באמצעות מלקחיים עדינים במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קצה אחד של 10 סנטימטרים של צינורות סיליקון למתמר הלחץ לאחר מכן הכנס את הסוף של T של התרדמהIDE T-צינור לתוך הקצה השני. ודא חיבור אתרים הדוקים ולדלוף חופשיים. החל חתיכה מלבנית קטנה של parafilm על שם צינורות משתלבים יחד, במידת צורך, כדי למנוע דליפה (איור 1 ג). </li></ol> 2. ציפוי הקאמרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חלבון ציפוי פני השטח אנדותל (למשל, selectin P, הידבקות אינטר מולקולה-1 (ICAM-1), חלבון-1 כלי דם הידבקות תא (VCAM-1)) בBSA 0.1%. כקו מנחה, 1 מיקרוגרם של חלבון ב200 μl BSA הוא מספיק כדי מעיל 4-5 תאים. באמצעות מזרק 1 מיליליטר מחובר למחט 25 G, להחדיר בכל תא (0.04 x 0.4 x 50 מ&quot;מ) עם חלבון ציפוי פני השטח האנדותל. אחסן את התאים המצופים בצינור 15 מיליליטר ב 4 ° C למשך לילה. </li></ol> היום של הניסוי: 3. הכנה הקאמרית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התאים המצופים מ4 ° C ולחבר את צינורות הצוואר וצוואר לכל צד. לאטום את connectiתוספות על ידי מתיחת חתיכה מלבנית קטנה של parafilm על שם צינורות עומדים בחדר בזהירות. באמצעות מזרק, למלא את התא וצינורות עם BSA 0.1% (לבדוק דליפה). דגירה של 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת פטרי 35 מ&quot;מ להחזיק את התא על ידי חיתוך חריצים בכל צד של המנה. לייצב את התא בחריצים; לאחר מכן השתמשתי בטיפה קטנה של סיליקון לצרף את התא לצלחת באתר מחורצים. ודא שהתא הוא ברמה ע&quot;י הסתכלות תחת המיקרוסקופ. לאפשר לסיליקון להתייבש במשך לפחות 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק נעילת 60 מיליליטר עם הפרין ולהתחבר למתמר הלחץ. חבר את מתמר הלחץ בצינור הראשי בצו הבא: מתמר, צינורות סיליקון, ו- T-צינור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש PE50 1 סנטימטר בין צינורות סיליקון מחוברים למתמר וT-הצינור לאבטחת החיבור. להעביר את צינורות סיליקון העורק הראשי דרך מהדק הלחץ (1D איור). הפעל 100USP הפרין throאיכס צינורות וקאמריים עד שאין בועות אוויר. </li></ol></li></ol> 4. הגדרת התוכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את התוכנה, הפעל את המחשב, מיקרוסקופ, ומכשיר מעבדה פתוח. לחץ לחיצה כפולה על חבילת Leica היישום (LAS) (או שווה ערך) ולהכין תיקייה כדי לשמור את הווידאו: לגלוש → לרכוש → סרט → להגדיר רצף של קטעים (קטעים = 15 זמן הקלטה, = 30 שניות, ו= 15 שניות במרווחים) לאחר מכן לחץ על הסימן &quot;+&quot; כדי לאשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקליט את לחץ הזרימה לפתוח את LabChart (או שווה ערך) קובץ ולתאם את שם הקובץ לתיקיית ההקלטה בשלב 4.1, לעיל. </li></ol> 5. נוהל כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר 8-10 שבועות בן באמצעות שילוב של קטמין (60 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (6 מ&quot;ג / קילוגרם) מוזרק תוך-peritoneally (IP). ודא שהרגעה עמוקה מושגת תוך 5-10 דקות על ידי אובדן של רפלקס נסיגת דוושה. במידת הצורך, isofluraneיישלח באמצעות מסיכת פנים יכולים להינתן בהתאם לצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד בהרדמה, למקם כרית חימום מתחת לכלוב ומוגדר 37 ° C כדי לשמור על טמפרטורת גוף. לאחר הרדמה נכונה הוא אישר, מניח את העכבר בעמדה ומעיל הגחון העיניים עם משחת הבסיטרצין כדי למנוע יובש עיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לגלח את השיער באתר החתך באמצעות סכין גילוח ולנקות ביסודיות את האתר עם אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהרדמה מלא לאבטח את החיה עם קלטת שמירת העכבר בעמדת הגחון. לחשוף את אזור הצוואר במספריים ולהסיר את בלוטת התריס לחשוף (איור 2 א) קנה הנשימה וכלי דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את עורק התרדמה עד שהוא נחשף במלוא נזהר שלא לפגוע בעצב התועה (איור 2). מקפלים פיסת התפר ולהעביר את העיקול מתחת לעורק הראשי ואז לחתוך בעיקול אז עכשיו יש 2 חתיכות של תפר מתחת לראש. לולאה כל תפר ומסתבך (לא להדקקשר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך כדי לחשוף את וריד הצוואר השמאלי (איור 2 ג), מכין את התפרים באותו אופן (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את הצינור לכלי הדם בעכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Heparinize העכבר על ידי הזרקת 1 מיליליטר של IP הפרין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדק את התפר העליון על העורק הראשי. הנח את מהדק הכלי הנמוך כמו זה יכול ללכת על עורק התרדמה (איור 3 א). שימוש במלקחיים כדי להחזיק את העורק על ידי התפר העליון ולעשות חתך קטן, על 1/8 של ההיקף של העורק, באמצעות microscissors (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את צינורות העורק הראשי דרך הקשר השני בתפר העליון ולתוך החתך שנעשה בעורק. לקשור את התפר התחתון, כך שהעורק אטום סביב הצינור (כמה קשרים צריכים להיעשות כדי להבטיח חותם חזק; איור 3 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו תהליך החדרת צינורות וריד הצוואר (הכלימהדק אין צורך לצד הצוואר; איור 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הזרימה על ידי שחרור מהדק הכלי. אם אין דליפות להזיז את העכבר למיקרוסקופ ולחבר את הצינור הראשי ווריד הצוואר לצינורות קאמריים (ראה וידאו מצורף להפגנה של הליך כירורגי). </li></ol></li></ol> 6. ההקלטה רולינג Velocity <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מהדק התרדמה כדי למלא את החדר, מה שהופך את מעגל עם מערכת דם עכבר. לאפשר לדם לזרום במשך 3-5 דקות, כך שתנאי הזרימה לייצב. בתקופת ההמתנה של 3-5 דקות, להתאים את הבמה מיקרוסקופ כדי שהתא הוא ברמה מקצה אחד לקצה השני במטרה מיקרוסקופ והקצה שלה הוא מקביל לחלון וידאו הקלטה על המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צלחת פטרי שונה המכילה את תא הזכוכית עם מים ואז להנמיך את מטרת הטבילה במי 10X לתוך הצלחת כך שהתאים זורמים דרך התא גלויים.עוצמת האור יכולה להיות מותאמת לצפייה נאותה של התאים. בדרך כלל בעוצמה נמוכה יותר היא טובה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המהדק על צינורות כך שמתמר קורא 30 מ&quot;מ כספית יציב, מקשר ללחץ זרימה פיסיולוגי בינוני, או לפי צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;התחל&quot; כדי להתחיל להקליט הן וידאו ולחץ עם לשגות הפעם הראשונה קרוב לסוף הצוואר ונע נגד הזרם לקראת סוף התרדמה עד לסיומה. הערה: תנאי ציפוי כמה באמצעות מולקולות הדבקה שונות ניתן ללמוד באותו העכבר באמצעות תאים מרובים. רק תא אחד נרשם בכל פעם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ההקלטה סיימה, לסגור את הברז באתר הקלט, לעצור את זרימת הדם. הסר את התא ולהתאים קאמרי חדש (מצופה במולקולת הידבקות שונה) למעגל באמצעות מלקחיים עדינים ביד אחת ומלקחיים מחורצים ביד השנייה. לחדש את ההקלטה לתא החדש כפי שתואר בשלבים6.1-6.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את כל העכברים על ידי CO 2 מחנק ואחריו נקע בחוט השדרה בסוף הניסוי. הליך מסוף, ולכן, העכברים מורדמים על ידי נקע בחוט השדרה בסוף הניסוי. </li></ol> 7. לפרש את התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את הנתונים שנרשמו להשתמש בתוסף &quot;M TrackJ&quot; לתוכנת ImageJ 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר את הקובץ לגוונים אפורים על ידי AVI → היבוא בחר → קובץ → להמיר לגוונים אפורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקנן את מסגרות תמונה על ידי בחירת → → → הרכוש להיכנס למרווחי המסגרת (i) → הגלובלי. לחשב את מרווחי מסגרת על ידי חלוקת משך וידאו הכולל (בדרך כלל 30 שניות) במספר המסגרות בוידאו אחד (שמוצג בפינה העליונה של תמונת חלון וידאו J). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הזרימה של כל ויקוציטים על ידי תוסף בחר → M TrackJ → להוסיף מסלולי → לבחור ויקוציטים→ לעקוב אחר זה עם כל מסגרת 15 - מיזוג → 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 7.4 עבור כל כדוריות הדם לבנות בתצוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הממוצע מתגלגל המהירות של כדוריות הדם לבנות במידה בחר → שתי עמודות מופיעות → העתק כל TrakJ M: מסלולים לגיליון אלקטרוני. הטור שכותרתו &quot;אומר V&quot; הוא גלגול ויקוציטים נמדד בפיקסלים / שני. להמיר מיקרומטר / sec ידי חלוקה 2/3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את נתוני שיא לחץ ויצוא לגיליון אלקטרוני ולבצע את החישוב הבא: ΔP (מ&quot;מ כספית) וt (דִין / 2 סנטימטר) להשוואה בין כל קבוצת ניסוי. ברגע שמחושב, להעתיק את הנתונים לתוכנת פריזמה לגרפים. </li></ol>

<ol>
	<li>Barreiro, O., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+leukocyte-endothelium+interactions+during+the+inflammatory+response.">Molecular basis of leukocyte-endothelium interactions during the inflammatory response.</a> Revista Espanola de Cardiologia. 62, 552-562 (2009).</li><li>Muller, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial-cell+interactions+in+leukocyte+transmigration+and+the+inflammatory+response.">Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response.</a> Trends in Immunology. 24, 327-334 (2003).</li><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20, 525-532 (2008).</li><li>Mehta, P., Cummings, R. D., McEver, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+P-selectin+binding+to+P-selectin+glycoprotein+ligand-1.">Affinity and kinetic analysis of P-selectin binding to P-selectin glycoprotein ligand-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 32506-32513 (1998).</li><li>Nicholson, M. W., Barclay, A. N., Singer, M. S., Rosen, S. D., vander Merwe, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+and+kinetic+analysis+of+L-selectin+(CD62L)+binding+to+glycosylation-dependent+cell-adhesion+molecule-1.">Affinity and kinetic analysis of L-selectin (CD62L) binding to glycosylation-dependent cell-adhesion molecule-1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 763-770 (1998).</li><li>Sandig, M., Negrou, E., Rogers, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+distribution+of+LFA-1,+catenins,+and+F-actin+during+transendothelial+migration+of+monocytes+in+culture.">Changes in the distribution of LFA-1, catenins, and F-actin during transendothelial migration of monocytes in culture.</a> Journal of Cell Science. 110 (22), 2807-2818 (1997).</li><li>Shaw, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+redistribution+of+leukocyte+LFA-1+and+endothelial+cell+ICAM-1+accompany+neutrophil+transmigration.">Coordinated redistribution of leukocyte LFA-1 and endothelial cell ICAM-1 accompany neutrophil transmigration.</a> The Journal of Experimental Medicine. 200, 1571-1580 (2004).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAM-A+mediates+neutrophil+transmigration+in+a+stimulus-specific+manner+in+vivo:+evidence+for+sequential+roles+for+JAM-A+and+PECAM-1+in+neutrophil+transmigration.">JAM-A mediates neutrophil transmigration in a stimulus-specific manner in vivo: evidence for sequential roles for JAM-A and PECAM-1 in neutrophil transmigration.</a> Blood. 110, 1848-1856 (2007).</li><li>Blankenberg, S., Barbaux, S., Tiret, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+atherosclerosis.">Adhesion molecules and atherosclerosis.</a> Atherosclerosis. 170, 191-203 (2003).</li><li>Parmeggiani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inflammation+in+age-related+macular+degeneration.">Mechanism of inflammation in age-related macular degeneration.</a> Mediators of Inflammation. 2012, 546786 (2012).</li><li>Ding, X., Patel, M., Chan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathology+of+age-related+macular+degeneration.">Molecular pathology of age-related macular degeneration.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 1-18 (2009).</li><li>Xu, H., Chen, M., Forrester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Para-inflammation+in+the+aging+retina.">Para-inflammation in the aging retina.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 28, 348-368 (2009).</li><li>Peterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Class+Review:+Nonsteroidal+Antiinflammatory+Drugs+(NSAIDs):+Final+Update+4+Report.">Drug Class Review: Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs (NSAIDs): Final Update 4 Report.</a> Drug Class Reviews. , (2010).</li><li>Ulbrich, H., Eriksson, E. E., Lindbom, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+and+endothelial+cell+adhesion+molecules+as+targets+for+therapeutic+interventions+in+inflammatory+disease.">Leukocyte and endothelial cell adhesion molecules as targets for therapeutic interventions in inflammatory disease.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 24, 640-647 (2003).</li><li>Stamper, H. B., Woodruff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+homing+into+lymph+nodes:+in+vitro+demonstration+of+the+selective+affinity+of+recirculating+lymphocytes+for+high-endothelial+venules.">Lymphocyte homing into lymph nodes: in vitro demonstration of the selective affinity of recirculating lymphocytes for high-endothelial venules.</a> The Journal of Experimental Medicine. 144, 828-833 (1976).</li><li>Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+flow+on+polymorphonuclear+leukocyte/endothelial+cell+adhesion.">Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion.</a> Blood. 70, 1284-1290 (1987).</li><li>Abbitt, K. B., Nash, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+leucocyte+adhesion+directly+observed+in+flowing+whole+blood+in+vitro.">Characteristics of leucocyte adhesion directly observed in flowing whole blood in vitro.</a> British Journal of Haematology. 112, 55-63 (2001).</li><li>Smith, M. L., Sperandio, M., Galkina, E. V., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoperfused+mouse+flow+chamber+reveals+synergistic+neutrophil+accumulation+through+P-selectin+and+E-selectin.">Autoperfused mouse flow chamber reveals synergistic neutrophil accumulation through P-selectin and E-selectin.</a> Journal of Leukocyte Biology. 76, 985-993 (2004).</li><li>Yuan, J., Melder, R. J., Jain, R. K., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+view+flow+system+for+studies+of+cell+adhesion+and+deformation+under+flow+conditions.">Lateral view flow system for studies of cell adhesion and deformation under flow conditions.</a> BioTechniques. 30, 388-394 (2001).</li><li>Moalem, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+T+cells+protect+neurons+from+secondary+degeneration+after+central+nervous+system+axotomy.">Autoimmune T cells protect neurons from secondary degeneration after central nervous system axotomy.</a> Nature Medicine. 5, 49-55 (1999).</li><li>Hafezi-Moghadam, A., Thomas, K. L., Cornelssen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse-driven+ex+vivo+flow+chamber+for+the+study+of+leukocyte+and+platelet+function.">A novel mouse-driven ex vivo flow chamber for the study of leukocyte and platelet function.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286, 876-892 (2004).</li><li>Almulki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surprising+up-regulation+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+(PSGL-1)+in+endotoxin-induced+uveitis.">Surprising up-regulation of P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) in endotoxin-induced uveitis.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 929-939 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Rapalino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+of+stimulated+homologous+macrophages+results+in+partial+recovery+of+paraplegic+rats.">Implantation of stimulated homologous macrophages results in partial recovery of paraplegic rats.</a> Nature Medicine. 4, 814-821 (1998).</li><li>Yoles, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+autoimmunity+is+a+physiological+response+to+CNS+trauma.">Protective autoimmunity is a physiological response to CNS trauma.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 3740-3748 (2001).</li><li>Buchanan, M. R., Vazquez, M. J., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arachidonic+acid+metabolism+and+the+adhesion+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+to+cultured+vascular+endothelial+cells.">Arachidonic acid metabolism and the adhesion of human polymorphonuclear leukocytes to cultured vascular endothelial cells.</a> Blood. 62, 889-895 (1983).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manganese+superoxide+dismutase+enhances+the+invasive+and+migratory+activity+of+tumor+cells.">Manganese superoxide dismutase enhances the invasive and migratory activity of tumor cells.</a> Cancer Res. 67, 10260-10267 (2007).</li></ol>

The authors (L.M., H.S., and K.M.C.) have no competing financial interests to disclose.

תהליך הגיוס לויקוציטים הוא צעד חיוני בתגובה הדלקתית; זה כרוך בהגירה של לויקוציטים ממערכת הדם לכיוון רקמות יעד, שבו הם יכולים להפעיל פונקצית מפעיל שלהם. גיוס לויקוציטים הוא חלק בלתי נפרד במגוון רחב של מצבים דלקתיים כגון פלאק טרשת עורקים, אוטם שריר לב, איסכמיה / reperfusion, וניתוח השתלה 1, כמו גם תנאי נוירו-הדלקתי של מערכת העצבים המרכזית הקשורים מרובים 10-12,20,24,25. בהתחשב במגוון של תנאי המחלה שתוחלת גיוס לויקוציטים, קאמרי microflow autoperfused מספקת כלי הכרחי המאפשר לחוקר את היכולת ללמוד דינמיקת הגירה לויקוציטים. במהלך העשורים האחרונים, מגוון רחב של מבחני במבחנה פותחו כדי ללמוד את הדינמיקה של הידבקות תא ויקוציטים 26. למרבה הצער, כל אלה מבחני דורשים החילוץ שלכדוריות הדם לבנות מהדם, מציגים הפעלה מכאנית. כדי להתקרב לסביבת in vivo, עיבודים נעשו כדי לאסוף דגימות דם שלמות ולשלוט על זרימת hemodynamic תנאי 16,17. כאן, אנו מרחיבים את ההתקדמות הקודמת בתחום על ידי קישור קאמרי מצופה למערכת הדם של עכבר. אנו מסוגלים לווסת את זרימת הדם לטווח פיסיולוגי וללמוד את הדינמיקה של גלגול ויקוציטים. התא המצופה נותן לנו את היכולת ללמוד אינטראקציות ויקוציטים עם מולקולות הדבקה ספציפיות. מאחר שהרשת פועלת כיחידה המופעלת על ידי עכבר חי, היא מחקה באופן הדוק יותר על הסביבה הטבעית, ומאפשרת לנו ללמוד אינטראקציות יקוציט-האנדותל במגוון רחב של דגמי עכבר חיסוניים. בנוסף, מערכת זו מאפשרת לנו לנצל את המודלים של העכברים הגנטיים המרובים הזמינים. בזמן שהמערכת לא לשכפל את הסביבה בvivo לחלוטין, הוא מספק פלטפורמה ללמוד ספציפיאלמנטים של ג לויקוציטים בתנאים פיסיולוגיים, הישג שלא היה אפשרי בעבר. למרות שזה לוקח אותנו צעד אחד קרוב יותר לסביבה פיזיולוגית יותר יש מגבלות למערכת. זה לא לשכפל לחלוטין מטריצת 3D המורכבת של כלי דם ולכן אנחנו יכולים רק להעריך אלמנטים מסוימים של אינטראקציות ויקוציטים שמוגבלות לציפוי קאמרי. בנוסף, יש לנקוט זהירות רבה על מנת להבטיח מערכת סגורה למחזור העכבר על ידי ביצוע כל השלבים שהוזכרו בפרוטוקול. כניסתה של בועות אוויר תשפיע באופן משמעותי את הדיוק ואת שחזור של הניסויים. בעוד אנו מתארים את השימוש של חדר Autoperfused Microflow להערכת דינמיקה מתגלגל לויקוציטים ההליך יש את הפוטנציאל להיות מותאמים אישית על ידי חוקרים ללמוד מגוון רחב של מחלות. לדוגמא, תאים סרטניים לשלוח גרורות בהבעת רבות של integrins המשותף של כדוריות דם לבנות. ת&#39;מחקרg דינמיקת גלגולם בסביבה המחקה באופן הדוק יותר סביבת in vivo יכול לעזור בידע שלנו, ואולי החיזוי, של הטבע פולשנית של תאי סרטן מסוימים. גישה אפשרית אחת יכולה להיות לשלב טכניקת תיוג לתאים הסרטניים, כגון 27 GFP, יחד עם assay תא זרימה כדי לעקוב אחר דינמיקת גלגול של התאים הסרטניים המבטאים GFP. בהתחשב בגמישות של ציפוי קאמרי עם מגוון רחב של חומרים וחיבור תאים מרובים לאותו העכבר יהיה מעניין לראות איך הליך זה הוא שונה לשימוש במעבדות אחרות בשילוב עם עכברים מהונדסים גנטי ומודלי מחלה. הטכניקה שאנו מתארים כאן רק נוגעת בפוטנציאל יישום רחב הרבה יותר, כי הוא מוגבל רק על ידי היצירתיות של החוקר.

דלקת היא התגובה האוניברסלית של הגוף לפציעה והיא צעד חיוני בשני תפקוד המערכת החיסונית המולדת ובעלי כושר הסתגלות. בתגובה לפציעה ו / או גירויים דלקתיים, תאי האנדותל upregulate מולקולות הדבקה ספציפיות; זה מוביל לויקוציטים extravasation דרך האנדותל כלי הדם, בעיקר בvenules נימי פוסט. תהליך זה מתחיל עם קשירה של לויקוציטים זרימה החופשי בזרם הדם על האנדותל. גלגול יציב והידבקות חברה של לויקוציטים, אשר בתורו מוביל לגלגול ואת ההפרשה של חומרים ציטוטוקסיים, בצע את זה קשירת 1,2. Selectins ידוע לתווך שלבים המוקדמים של המפל 3-5; integrins אחראי לצעדים מאוחר יותר של הידבקות חברה וגלגול 1,6-8. גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כדוריות דם לבנות ומולקולות דבקות אנדותל יש תפקידים חיוניים במודלים של בעלי חיים של פגיעת reperfusion איסכמיה, אסטמה, פסוריאזיס, טרשת נפוצה, וניוון מקולרים הקשור לגיל 9-12. בתנאים אלה, התגובה הדלקתית היא הטעתה לתקוף גוף של האדם עצמו, וכתוצאה מכך ההתמוטטות של רקמה בריאה. סוכנים קיימים אנטי דלקתיים (כגון תרופות לא-סטרואידיות נוגדות דלקת, סטרואידים, או תרופות כימותרפיות אחרות) לשאת את הסיכון לתופעות לוואי חמור עם שימוש ארוך טווח 13. לכן, זה עניין רב ליש את הכלים המתאימים עם היכולת לזהות מולקולות ספציפיות למחלה, אשר בסופו יכול להיות ממוקדת ליש השפעה אנטי דלקתית הרצויה תוך שמירה על 14 שאינם רעילים. קיימים בשיטות מבחנה כגון assay ההידבקות לויקוציטים סטטי שמשו כתחילה גם 1976 15. תא הזרימה המקביל היה בשימוש לראשונה במבחנה בשינה 1987 כדי לחקור אינטראקציות יקוציט-האנדותל תחת תנאי זרימה. בניסויים אלה, מגורה הומאn leukocytes polymorphonuclear (PMNs) מהדם ורידים היו perfused מעל monolayer של תאים ראשוניים אנושיים וריד טבור אנדותל (HUVECs). כדי לשלוט על זרימת hemodynamic תנאים, משאבת מזרק Apparatus הרווארד הועסקה 16. לחלופין, כדי למנוע בידוד leukocytes מלאכותי, כל הדם היה בשימוש בשילוב עם תא הזכוכית מצופה במולקולות הדבקה משותקות 17. כדי להימנע מגירוי לויקוציטים וללמוד באופן מכניסטי האינטראקציה שלהם עם מולקולות ההידבקות בתנאים פיסיולוגיים משוערים, לשעבר vivo autoperfused, extracorporal, מעגל arteriovenous פותח 16. במעגל זה, הדם זורם בין עורק התרדמה המשותף תקין ווריד הצוואר חיצוני השמאלי של עכבר חי בהרדמה, המאפשר אינטראקציה של PBLs ילידים בתוך תא microflow זכוכית מצופה מולקולות הידבקות בודדות או-משותק במשותף. יתרון גדול לתוכנה לזהמ &#39;היא היכולת להעסיק עכברים מהונדסים גנטי, שבו מסלולים דלקתיים באופן ישיר או עקיף מניפולציות. בנוסף, יש את היכולת לאתר את התרומה בודדת של מולקולות הידבקות לויקוציטים לדלקת, ללא הפעלה חיצונית, תחת תנאי זרימה. היישום של זרימת רגולטור בנקודת תא זרימת הקלט מספק מגוון רחב של וריאציות ניסיוניות של כוחות הגזירה לחקות או עורקים או ורידי מערכות 18-22. כאן אנו מתארים בפירוט רב בפרוטוקול הנוגע לעריכה ולביצועים של vivo לשעבר autoperfused assay תא microflow.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="792">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:335px;">Material</td>
			<td style="width:220px;">Vendor</td>
			<td style="width:237px;">Part number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro glass chamber 0.4x0.04x50mm</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td>2540-050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 10</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene tubing PE 60</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427416</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Silicone tubing 002</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-189-15A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y tube</td>
			<td>Value Plastics</td>
			<td>Y210-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T tube</td>
			<td>value plastics</td>
			<td>T410-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone gel</td>
			<td>Hardware store - Home Depo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">35mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Parafilm</td>
			<td>Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM996</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11253-25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Tube holder</td>
			<td>FST</td>
			<td>00608-11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Clamp applicator</td>
			<td>FST</td>
			<td>18057-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Vascular clamp</td>
			<td>FST</td>
			<td>18055-04</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-0 silk sutures</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-1215-6/0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25x1G&#160; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305125</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30x1/2G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin 100 USP units/ml</td>
			<td>Hospital pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing leukocyte-endothelial interactions under flow conditions in an ex vivo autoperfused microflow chamber assay

אינטראקציות יקוציט-האנדותל הן אירועים מוקדמים וקריטיים בדלקת אקוטית וכרונית ויכולות, כאשר dysregulated, לתווך פגיעה ברקמות שהובילו לניזק פתולוגי קבוע. מבחני קונבנציונליים קיימים מאפשרים הניתוח של מולקולות הידבקות לויקוציטים רק לאחר המיצוי של לויקוציטים מהדם. זה מחייב את הדם לעבור כמה צעדים לפני leukocytes דם ההיקפית (PBLs) יכולה להיות מוכנה לניתוח, אשר בתורו יכול לעורר PBLs משפיע על ממצאי המחקר. Assay תא זרימת מייקר autoperfused, לעומת זאת, מאפשר למדענים לחקור leukocytes המוקדמת dysregulation התפקודי באמצעות הזרימה המערכתית של עכבר חי בזמן שיש חופש מניפולציה קאמרית מצופה. באמצעות מודל מחלה, הביטוי הפונקציונלי של מולקולות הידבקות לויקוציטים ניתן להעריך ולכמת בתא מיקרו-זכוכית מצופה במולקולות דבקות אנדותל משותקים vivo לשעבר. במודל זה, הדם זורםבין עורק התרדמה המשותף תקין ווריד הצוואר חיצוני השמאלי של עכבר חי בהרדמה, המאפשר האינטראקציה של PBLs ילידים בתא. ניסוי ניתוח בזמן אמת מושגת בסיוע מיקרוסקופ intravital כמו גם מכשיר לחץ הרווארד Apparatus. היישום של זרימת רגולטור בנקודת תא זכוכית הקלט מאפשר זרימת תנאים פיסיולוגיים דומים בין הניסויים. מתגלגל ליקוציט מהירות היא התוצאה העיקרית ונמדדת באמצעות המכון הלאומי לImageJ תוכנת גישה פתוחה בריאות. לסיכום, assay תא זרימת מייקר autoperfused מספק סביבה פיזיולוגית אופטימלית ללמוד leukocytes אינטראקציה אנדותל ומאפשר לחוקרים להסיק מסקנות מדויקות כאשר לומדים דלקת.

<html> במהלך כל אינטראקציה leukocytes רק הקלטה ניכרים על החדר. תוצאות מניסוי נציג שניתן לראות באיור 4. החיצים הלבנים מצביעים על leukocytes בודדת שנתפסו על-ידי מולקולת ההידבקות של ריבית ומתגלגלות לאורך קאמרי בקרב חופשיים זורמים אלה אחרים בזרימת הדם. חפץ משותף מחוץ לחדר שניתן לראות בתחומים אפלים הגדולים בכל התמונות. התחומים הכהים לסייע לקורא להעריך את התנועה לויקוציטים ביחס לנקודה קבועה. לויקוציטים קידום על פני תקופה של 22 שניות ניתן לראות ביחס לתחומים. הגרף באותו איור מציג עלילה סופית של הנתונים שבו TX1 מקטין את מהירות הגלגול (מעבר לשמאל) וTX2 מגביר את המהירות (תזוזה ימינה) בהשוואה לשליטה. 0 &quot;/&gt; איור 1: הכנת צינורות לתא הזרימה. כלים () הנדרשים לצינורות והרכבת תא (תא זכוכית מיקרו 0.4 x 0.04 x 50 מ&quot;מ, PE10 צינורות פוליאתילן, צינורות פוליאתילן PE60, סיליקון צינורות 002, צינור Y, צינור T, 35 מ&quot;מ צלחת פטרי, מלקחיים עדינים, מספריים בסדר, בעל צינור, מהדק כלי דם, 7-0 תפר משי. הכנה (B) של עורק התרדמה וצינורות וריד הצוואר להכוונה מחדש את זרימת הדם בעכבר דרך החדר המצופה. (C) חיבור צינורות העורק הראשי למתמר הלחץ. (ד) להעביר את צינורות ממתמר דרך המהדק כדי להתאים את קצב זרימת הדם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700" /> איור 2:. חשיפת העורק הראשי ווריד הצוואר () לחתוך בזהירות את אזור הצוואר כדי לחשוף את קנה הנשימה (B) נקה את העורק הראשי ימין, כך שפיסת התפר יכול לעבור מתחת לכלי השייט (מנוקד צהוב. קו מתאר את העורק הראשי). (ג) נקה את וריד הצוואר השמאלי כך שפיסת התפר יכול לעבור מתחת לספינה (קו צהוב מנוקד מתאר את וריד הצוואר). (ד) לארגן קשור ברישול תפרים באזורים העליונים ותחתונים של עורק התרדמה ווריד הצוואר (חיצים הצביעו על האזורים העליונים ותחתונים של כלי). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700" /> איור 3: חיבור צינורות לtהוא התרדמה עורקים ועורק הצוואר. () להדק את הקשר העליון על הצוואר ולמקם את המהדק מתחת לקשר נמוך יותר. (ב) שימוש בmicroscissors, לעשות חתך קטן בצוואר, על 1/8 ההיקף (העיגול צהוב מקווקו מציין את החתך). ( C) הכנס את הצינור לתוך התרדמה ובטוחה עם לפחות שני תפרים (קו מקווקו ירוק מראה את הצינור וקו המקווקו הצהוב העורק הראשי). (ד) באופן דומה להכניס צינורות בצוואר (קו מקווקו ירוק מראה את הצינור ו קו מקווקו צהוב וריד הצוואר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700" /> איור 4: כמובן זמן נציג של לויקוציטים מתגלגל בזרימה צ&#39;אםבער (בר = 100 מיקרומטר Scale) (ראשי חץ לבנים להצביע leukocytes מתגלגלת). הגרף מתאר תוצאות נציג לאחר היצוא לתכנית גרפים (TX1 וTX2 הם קבוצות טיפול ניסיוני וCTR הוא קבוצת הביקורת). TX1 מייצג טיפול בי לויקוציטים להאט מוביל לירידה בלויקוציטים מתגלגל מהירות ומשמרת השמאלית של הגרף בהשוואה לקבוצה שלא טופלה (CTR), ואילו TX2 מוביל לשינוי תקין המשקף עלייה בכדוריות דם לבנות מתגלגלות מהירות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ על כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay at JoVE.com

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לחוקר להעריך דינמיקת גיוס לויקוציטים לשעבר vivo על ידי חיבור קאמרי מצופים במולקולות דבקות-נגזר האנדותל למערכת הדם של עכבר. שיטה זו מציעה יתרונות משמעותיים שכן הוא מאפשר להערכה לויקוציטים בתנאים ביולוגיים יחסי.

הערכת אינטראקציות יקוציט-האנדותל תחת תנאי זרימה ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Assay Autoperfused Microflow הקאמרי

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

assessing-leukocyte-endothelial-interactions-under-flow-conditions-an

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

9.5K Views.  Harvard Medical School, Massachusetts Eye & Ear Infirmary.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לחוקר להעריך דינמיקת גיוס לויקוציטים לשעבר vivo על ידי חיבור קאמרי מצופים במולקולות דבקות-נגזר האנדותל למערכת הדם של עכבר. שיטה זו מציעה יתרונות משמעותיים שכן הוא מאפשר להערכה לויקוציטים בתנאים ביולוגיי...

Video: Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דגם זלוף שליה אנושי

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

הנדסת רקמות ידי עצמותי כלי דם בתוך<em&gt; In vivo</em&gt; הנדסת רקמות קאמרית

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

טכניקה כירורגית הרומן כבסיס In Vivo חלקי הכבד הנדסה בעכברוש

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

שיטה אוטומטית לביצוע השימוש בשיטת ההדמיה באמצעות הדמיה רב ספקטקטרלית באמצעות זרימה

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

אין ויטרו מודלים עורקיים בתרבית תאים 3D לחקר פילוח תרופות כלי דם תחת זרימה

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל במהלך דלקת

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical communities. The resolution of results obtained from current methods of measuring certain biomarkers can take several days or weeks to obtain, as they can be limited in resolution both spatially and temporally (e.g., fluid compartment microdialysis of interstitial fluid analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA], high-performance liquid chromatography [HPLC], or mass spectrometry); thus, their guidance of timely diagnosis and treatment is disrupted. In the present study, a unique technique for detecting and measuring peptide transmitters in vivo through the use of a capacitive immunoprobe biosensor (CI probe) is reported. The fabrication protocol and in vitro characterization of these probes are described. Measurements of sympathetic stimulation-evoked neuropeptide Y (NPY) release in vivo are provided. NPY release is correlated to the sympathetic release of norepinephrine for reference. The data demonstrate an approach for the fast and localized measurement of neuropeptides in vivo. Future applications include intraoperative real-time assessment of disease progression and minimally invasive catheter-based deployment of these probes.

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

Established immunochemical methods to measure peptide transmitters in vivo rely on microdialysis or bulk fluid draw to obtain the sample for offline analysis. However, these suffer from spatiotemporal limitations. The present protocol describes the fabrication and application of a capacitive immunoprobe biosensor that overcomes the limitations of the existing techniques.

מדידת In Vivo שנפתרה בזמן של נוירופפטידים דינמיים על ידי אימונופרוב קיבולי בלב חזירי

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

Automation of the Micronucleus Assay Using Imaging Flow Cytometry and Artificial Intelligence

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by scoring MN in once-divided, cytokinesis-blocked binucleated cells or fully divided mononucleated cells. Historically, light microscopy has been the gold standard method to score the assay, but it is laborious and subjective. Flow cytometry has been used in recent years to score the assay, but is limited by the inability to visually confirm key aspects of cellular imagery. Imaging flow cytometry (IFC) combines high-throughput image capture and automated image analysis, and has been successfully applied to rapidly acquire imagery of and score all key events in the MN assay. Recently, it has been demonstrated that artificial intelligence (AI) methods based on convolutional neural networks can be used to score MN assay data acquired by IFC. This paper describes all steps to use AI software to create a deep learning model to score all key events and to apply this model to automatically score additional data. Results from the AI deep learning model compare well to manual microscopy, therefore enabling fully automated scoring of the MN assay by combining IFC and AI.

The micronucleus (MN) assay is a well-established test for quantifying DNA damage. However, scoring the assay using conventional techniques such as manual microscopy or feature-based image analysis is laborious and challenging. This paper describes the methodology to develop an artificial intelligence model to score the MN assay using imaging flow cytometry data.

אוטומציה של בדיקת מיקרוגרעין באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה ובינה מלאכותית

The micronucleus (MN) assay is used worldwide by regulatory bodies to evaluate chemicals for genetic toxicity. The assay can be performed in two ways: by ...