אנו מודים לורי Destroismaisons ושרה Peyrard לתמיכה טכנית יוצאת מן הכלל וDr.Alexandre פרת לגישה לcytometer הזרימה. אנחנו רוצים גם להודות ד&quot;ר טימותי מילר על תרומתו בעניין הסרת המיאלין מההכנות. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) Neuromuscular מחקר שותפות, קרן הקנדית לחדשנות, חברת ALS של קנדה, הקרן פריק לחקר ALS, צ&#39;אם קרן וFonds דה לה המשוכלל והנדיר en סנטה du קוויבק (CVV). CVV וNA שניהם מחקר חוקרים של Fonds דה לה משוכלל ונדיר en סנטה du קוויבק וCIHR חדשים חוקרים. SP נתמך על ידי טים הנואלים Studentship מהחברה ALS של קנדה.

בעלי חיים המשמשים במחקר זה, טופלו לפי קפדן לפרוטוקול (N08001CVsr) שאושר על ידי de l&#39;אוניברסיטת מונטריאול ועדת מרכז דה המשוכללת והנדירה מרכז du Hospitalier (CRCHUM) המוסדית להגנה על בעלי חיים העוקב תקנים לאומיים כפי שתואר על ידי הקנדי מועצה על טיפול בבעלי חיים (CCAC). הכן את כל חומרים כימיים הנדרשים לביצוע פרוטוקול זה (טבלת 1). ניתן למצוא את כל הפרטים נוספים בנוגע לציוד, אספקה ​​וספקים ברשימה של חומרים. <img alt="טבלת 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> טבלת 1 יצירות הצפת. 1 אוסף של חוט השדרה עכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק לטשטש את העכברוש (ספראג Dawley) עם isoflorane 4%. ודא הרדמה על ידי היעדר רפלקס על צביטה של ​​הבכפו דואר. להרדים את העכברוש על ידי עריפת ראש באמצעות הגיליוטינה. שיטה זו של המתת חסד עדיפה על פני שעלול לעוות את חוט השדרה, אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור של הגב לחשוף את עמוד השדרה. חותך את עמוד השדרה במספריים עצם בדיוק מעל עצם האגן. דמיין את הפתיחה של עמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מזרק 10 מ&quot;ל, עם טיפ 200 μl פיפטה (מצורף באמצעות המסת מעט מעל להבה), מלא בופר פוספט (PBS), לעמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את חוט השדרה על ידי מריחת כמות בינונית של לחץ לבוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כל דם נמצא על חוט השדרה, לשטוף עם PBS לפני שתמשיך לשלב הבא. הערה: שיטה זו גם אומתה למוח ובכבד. אם כולל רקמות אלה, לאסוף מחצית המוח מהחולדה מורדמים וחתיכת כבד במשקל שווה לחוט השדרה. כל הצעדים אחרים יישארו זהים. </li></ol> .2 בידוד של חוט השדרה Mitochondria (מעובד מתוך אל ונדת ולד ואח. 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל חוט השדרה שלם ומקום בhomogenizer זכוכית 5 מ&quot;ל עם 5 כרכים (~ 3.25 מ&quot;ל) Homogenization חוצץ (HB). להתאוששות אופטימלית של המיטוכונדריה המבודדת, לבצע את כל הצעדים על קרח או בחדר קר. Homogenize רקמה ביד עד שלא חתיכות גדולות של רקמה תישאר, שמונה כ שבץ. הנח homogenate בשני (2 מ&quot;ל) או שלושה (1.7 מ&quot;ל) microcentrifuge צינורות. צנטריפוגה XG 1,300 10 דקות ב 4 ° C בmicrocentrifuge המעבדתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאושש supernatant ומקום בצינור ultracentrifuge 5 מ&quot;ל. הוספת HB 750 μl (~ 0.5 כרכים) לצינור microcentrifuge המכיל גלולה ובעדינות resuspend גלולה. צנטריפוגה וresuspension חזור על השלבים עוד פעמיים. בריכה כל supernatants (S1A וS1b) לתוך צינור ultracentrifuge 5 מ&quot;ל מעל. צעד זה משמש להסרת קטנה פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה נקוותה S1 באמצעות ultracentrifuge מצויד בריקבון דלי מתנדנדאו ו צנטריפוגות ב XG 17,000 עבור 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור supernatant (S2) לעיבוד נוסף אם חלק cytosolic הוא עניין (לדוגמא לניתוח כתם מערבי). Resuspend גלולה (P2), את החלק היחסי של המיטוכונדריה הגולמי, בHB מ&quot;ל 4 + 50 מ&quot;מ KCl. צנטריפוגה XG 17,000 עבור 15 דקות ב 4 ° C בהרוטור דלי מתנדנד. בטל supernatant ועדינות resuspend גלולה (P3) ב800 HB μl. הערה: המיטוכונדריה נשטפים עם HB + 50 מ&quot;מ KCl כדי להסיר כל מזהמי mitochondrially הקשורים שאינם ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור ultracentrifuge 5 מ&quot;ל חדש, להוסיף μl בדיוק 800 של גלולה מושעה (P3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצינור הזה להוסיף, 200 μl של iodixanol (בינוני שיפוע צפיפות), ובכך ליצור ריכוז סופי של 12% iodixanol. מערבבים את התוכן של הצינור בעדינות, אך ביסודיות באמצעות pipetting עם P1000. תוספת של iodixanol הראשון, ולאחר מכן גלולה resuspended (P3) עשויות להיות עדיפות כדי להקל על ערבוב יסודי. צנטריפוגה בultracentrifuge מצויד בהרוטור דלי מתנדנד ב17,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: הכבד אינו מכיל מיאלין ולכן בשלב זה הוא לא הכרחי אם רק הכבד נמצא בתהליך עיבוד. עם זאת, אם כבד נמצא בתהליך עיבוד במקביל למיטוכונדריה CNS, מומלץ לטפל בכל הרקמות באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את שכבת המיאלין בחלק העליון של הצינור ובזהירות להסיר ולסלק supernatant. גלולה עשויה להיות רופפת. Resuspend גלולה ב4 HB מ&quot;ל. צנטריפוגה שוב ב17,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant וresuspend גלולה ב4 HB מ&quot;ל. חזור על צנטריפוגה ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה הסופי (P7) ב100-200 HB μl ולהעביר לצינור 1.7 מ&quot;ל microcentrifuge. מדגם זה מכיל מיטוכונדריה המבודדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לכימות חלבון. לדלל דגימות והעקומה סטנדרטית ב2% סולפט dodecyl נתרן (SDS), כדי להבטיח solubilization נאות של duri מיטוכונדריהכימות חלבון ng. </li></ol> .3 Immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת לcytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תערובת כתמים להיבדק, פיפטה 25 מיקרוגרם של מיטוכונדריה המבודדת לתוך צינור 1.7 מ&quot;ל microcentrifuge. כולל מדגם בלא כתם בכל ניסוי; ועבור כל נוגדן, הקפד לכלול מדגם לשליטת אלוטיפ המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 17,000 עבור 2 דקות ב 4 ° C בmicrocentrifuge ספסל העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant וresuspend מיטוכונדריה המבודדת ב50 μl המיטוכונדריה חוצץ (M Buffer) בתוספת 10% BSA חופשי חומצות שומן ל15 דקות ב 4 ° C (צעד חסימה). הערה: במהלך תיוג, לבצע incubations במקרר ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדן ראשוני (ארנב נגד Mfn2, 20 מיקרוגרם למ&quot;ל) לצינור ודגירה של 30 דקות ב 4 ° C.. הערה: קביעת ריכוז אופטימלי של כל נוגדן באופן אמפירי על ידי טיטרציה. בשל שונות בריכוז ו / או purity, הרבה שונה של אותו הנוגדן מאותו היצרן עלול להוביל לתוצאות שונות; לכן טיטרציה נחוצה לכל מגרש חדש של נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הנוגדן מאוגד עיקרי: צנטריפוגה ב 17,000 XG למשך 2 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ועדינות resuspend גלולה ב200 μl M הצפת. צנטריפוגה ב XG 17,000 עבור 2 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant וresuspend גלולה ב50 μl M הצפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים משני (נגד הארנב IgG החמור Phycoerythrin (PE), 0.5 מיקרוגרם למ&quot;ל) לצינור ודגירת דגימות ל30 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הנוגדנים משני מאוגדים: צנטריפוגה ב 17,000 XG למשך 2 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant וresuspend גלולה ב200 μl M הצפת. צנטריפוגה ב XG 17,000 עבור 2 דקות ב 4 ° C.. הסר supernatant וresuspend גלולה ב500 μl M הצפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח אירועים נמצאים במיטוכונדריה עובדה, מיטוכונדריה כתם מבודד עםצבע מיטוכונדריה ספציפי ניאון ל15 דקות ב RT, המוגן מפני אור. אם הכתמה של פרמטרים אחרים תפקודיים (פוטנציאל הטרנסממברני המיטוכונדריה או ייצור סופראוקסיד) היא רצויה, המשך לשלב .4 אם לא, המשיכו לשלב 5 לרכישה. הערה: חשוב לוודא שספקטרום הפליטה של ​​הנוגדנים משני בקנה אחד עם זו של הצבעים הפונקציונליים. לדוגמא, אם אימות טוהר המיטוכונדריה עם צבע מסחרי עם תכונות ספקטרליות דומות לפוטנציאל FITC והטרנסממברני עם תיל אסטר Tetramethylrhodamine (TMRM), נוגדנים משני קיימא יהיה allophycocyanin (APC: ננומטר אקס 650 / Em 660 ננומטר). להוסיף בקרות פיצויים, כלומר, מדגם immunolabeled או מוכתם עם fluorophore יחיד, כאשר החלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים צינור מתאים לזרימת טעינת cytometer. (כדי להקל על גודל המדגם הקטן, צינור microtiter ממוקם בתוך 3 מ&quot;ל לזרום cytometer צינור.) שמור על דגימות קרח ולפנות מייד ללזרום cytometer לרכישה. </li></ol> .4 Assaying מיטוכונדריאלי הטרנסממברני פוטנציאלי ומיטוכונדריאלי Superoxide ייצור על ידי cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיש לי מיטוכונדריה המבודדת פוטנציאל הטרנסממברני שלם על ידי צביעה עם 100 ננומטר TMRM (548 ננומטר / ננומטר 574 Em Ex) 5, בשלב 3.8, ל15 דקות ב RT, מוגנות מפני אור. לשם השוואה של פוטנציאל הטרנסממברני בין דגימות ואוכלוסיות, שימוש בריכוזים שאינן מרווה / תחתונה של TMRM (1 עד 30 ננומטר), עשוי להיות מתאים יותר 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת מכתים TMRM, מיטוכונדריה המבודדת כתם עם 100 ננומטר TMRM בנוכחות של הידרזין פניל ​​מ-כלורו ציאניד קרבוניל 100 מיקרומטר (CCCP), uncoupler המיטוכונדריה שdepolarize מיטוכונדריה. הריכוז של CCCP נדרש depolarize מיטוכונדריה עשוי להיות פחות אם ריכוזים נמוכים יותר של צבע משמשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שמיטוכונדריה המבודדת לייצר סופראוקסיד המיטוכונדריה ידי staining עם מחוון סופראוקסיד המיטוכונדריה מתאים 7, גם בשלב 3.8, ל15 דקות ב RT, מוגנות מפני אור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת לייצור סופראוקסיד המיטוכונדריה, מיטוכונדריה המבודדת כתם עם צבע בנוכחות 10 מיקרומטר Antimycin, מעכב של הקומפלקס III של שרשרת הנשימה שתגביר את ייצור סופראוקסיד המיטוכונדריה. </li></ol></li></ol> .5 רכישה וניתוח של Immunolabeled מבודד המיטוכונדריה על ידי cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר להגדיר: מתחי החלף ליניארי כדי להיכנס למצב כדי להקל על ניתוח של מיטוכונדריה המבודדת ומתחים שנקבעו (FSC: 450; SSC: 250). להבטיח כי אירועים נאספים בFSC-מצב (אזור), כמו גם FSC-W (רוחב) וFSC-H (גובה), כדי להיות מסוגל להוציא כפילויות (כלומר, שני אירועים, שעוברים דרך גלאים באותו הזמן ) באוסף של הודעה נתונים ניתוח. הגדר את מספר האירועים שייגבה ל100,000. לרכוש בקרות פיצוי, אם ישים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת נתונים: לפני רכישת נתונים, להימנע vortexing דגימות. במקום לערבב בעדינות על ידי הקשה על צינור. בתחילה לאסוף אירועים בלחץ נמוך, בgating. שער באוכלוסייה. התאם מתחים של היסטוגרמות בהתאם, בדרך כלל השיא של המדגם בלא כתם יהיה מתאים לעשור השני (10 2). ברגע שהשערים הוקמו, ודגימות שנמצאות בעיבוד, הלחץ יכול להיות מופעל עד גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח: דמיין כפילויות על ידי התוויית FSC-W לעומת FSC. לזהות singlets וכפילויות. השער בsinglets. בחר את אוכלוסיית המיטוכונדריה על ידי gating על אירועים שהם מוכתמים חיובי עם צבע המיטוכונדריה סלקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע תיוג רקע משליטת אלוטיפ. שימוש במדגם שליטת אלוטיפ, לקבוע את אחוז תיוג אוכלוסיית המיטוכונדריה החיובי לנוגדני Mfn2. </li></ol>

<ol>
	<li>Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+in+neurodegeneration.">Mitochondrial dynamics in neurodegeneration.</a> Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).</li><li>Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+intracellular+organelle+function+using+fluorescent+probes:+from+animalcules+to+quantum+dots.">Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots.</a> Circ Res. 95, 239-252 (2004).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+five+dimensions:+time-dependent+membrane+potentials+in+individual+mitochondria.">Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria.</a> Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50, 98-115 (2011).</li><li>Xu, X., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+determination+of+superoxide+release+at+both+sides+of+the+mitochondrial+inner+membrane+by+capillary+electrophoretic+analysis+of+the+oxidation+products+of+triphenylphosphonium+hydroethidine.">Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine.</a> Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).</li><li>Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+function+and+regulation+of+mitochondrial+fission.">New insights into the function and regulation of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).</li><li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria.">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li><li>Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+mitochondrial+heterogeneity+tell+us+about+mitochondrial+dynamics+and+autophagy.">What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).</li><li>Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1.">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li><li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamin-related+protein+1,+a+mediator+of+mitochondrial+fission,+in+apoptosis.">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li><li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalh&#227;es, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant.">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li><li>Tantama, M., Martinez-Fran&#231;ois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio.">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550 (2013).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

זה בא לידי ביטוי יותר ויותר כי המיטוכונדריה הן שחקני מפתח בשני פיזיולוגיה ומחלות נורמליות. בעוד immunoblotting יכול לקבוע אילו חלבונים נמצאים בתוך המיטוכונדריה או על פני השטח של המיטוכונדריה במצב מסוים, דיווחים בשיטה זו בממוצע של האוכלוסייה כולה. שיטה זו לא יכולה להניב מידע על שכיחותם היחסית של תת אוכלוסיות או תת המיטוכונדריה. למרות שזה היה בעבר הניח כי כל מיטוכונדריה נוצרו באותה מידה, השדה הוא הכרת המיטוכונדריה שבתוך תא יותר ויותר יש לי שונות רבות במונחים של מורפולוגיה ו / או פונקציה 10. גישות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לוקחים בחשבון את ההטרוגניות של המיטוכונדריה. עם זאת, כימות של סוג זה של נתונים היא עבודה אינטנסיבית. יתר על כן, גישה זו היא מתאימה יותר למחקרים באמצעות תאים בתרבית, כתיוג של המיטוכונדריה in vivo / באתרו הוא קשה בשל excesמספר sive של המיטוכונדריה הנוכחית, מה שהופך את הבידול של האברונים פרט קשה מטבעו. ברוב פרוטוקולי immunocytochemistry, זה גם לא ניתן לתייג בו זמנית חלבוני קרום המיטוכונדריה חיצוניים ולהעריך את התפקוד המיטוכונדריה בשל צעד permeabilization הסלולרי הנדרש לתיוג נוגדן. השיטה הנוכחית עובדת עם מיטוכונדריה המבודדת, ולכן אינו דורשת צעד permeabilization. בנוסף, ההדמיה של המיטוכונדריה פרט אפשרית רק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, שאינו ניתן לניתוח של תפקוד המיטוכונדריה. עם זאת, אנו מכירים בכך שהבידוד של המיטוכונדריה מרקמות גורם לשיבוש של רשת המיטוכונדריה וזה יכול להשפיע על כמה אלמנטים של פונקציה של המיטוכונדריה. עם זאת, השוואות של היבטים פונקציונליים של מיטוכונדריה המבודדת מרקמות שמעובדות באופן דומה יישארו בתוקף. שיטה זו של immunolabeling של בידוד ע המופק מרקמותמיטוכונדריה ed וניתוח שלאחר מכן על ידי זרימת cytometry מאפשר לשיטה מהירה וכמותיים כדי לזהות ולנטר את הנוכחות של חלבון הממוקם בקרום החיצוני. זיהוי של חלבון המיטוכונדריה נרחב ביותר (כמו Mfn2) אפשרי עם טכניקה זו. בדומה לכך, בשיטה זו ניתן לזהות חלבוני שפע נמוכים שמופקדים רק על הממברנה של המיטוכונדריה במחלה, כמו SOD1 misfolded בהקשר של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) 11. בנוסף, שיטה זו יכולה להיות שימושית כדי לפקח על החלבונים שזמניים לקשר עם משטח המיטוכונדריה כחלק מהתפקוד התקין שלהם. דוגמאות לכך כוללות-קשור dynamin חלבון-1 (Drp1), חלבון cytosolic שגויס למיטוכונדריה כדי לקדם את ביקוע המיטוכונדריה 12 והגורם הקשורים הקולטן לגורם נמק גידול 6 (TRAF6), אשר translocates למיטוכונדריה כדי להגדיל מיני חמצן תגובתי המיטוכונדריה כ חלק מתגובה חיסונית מולדת 13. כיום טכניקה זו היא נוחה רק לחלבונים המצויים על פני השטח של המיטוכונדריה, כמו פרוטוקולי permeabilization סטנדרטיים לתיוג תאיים דורשים חומר ניקוי שמשבש את השלמות המבנית של המיטוכונדריה. בעוד מספר של חומרים כימיים אפשריים כבר ניסה (לא פורסם), אופטימיזציה נוספת של פרוטוקול immunolabeling יש צורך עדיין לעשות את זה בפרוטוקול ניתן לאיתור רכיבי התוך המיטוכונדריה. טכניקה זו יש יישומים רחבים וניתן להשתמש בם כדי לזהות את הנוכחות או גיוס של חלבונים אחד או יותר למיטוכונדריה תחת פרדיגמות ניסוי שונות. יתר על כן, יכול להיות שותף שכותרת המיטוכונדריה עם שני נוגדנים שונים, כמו גם עם אינדיקטורים ניאון 11. בדיקות ניאון אחרות גם יכולות להיות משולבות כדי לאפיין היבטים נוספים של תפקוד המיטוכונדריה. לדוגמא, צבעים זמינים מסחרי כדי לפקח pH המיטוכונדריה 14 </sעד&gt;, ספיגת סידן עם רמות 15 ירוק-5N, וATP סידן 16 אפשרית.

המיטוכונדריה הם אברונים מאוד דינמיים שעוברים סבבים רבים של ביקוע והיתוך, מועברים לאתרים של ביקוש לאנרגיה גבוהה ולהגיב במהירות לגירויים פיסיולוגיים 1. מאז הוא מוכר מיטוכונדריה שיותר ויותר בתוך רקמות שונות, תאים סלולריים שונים אפילו, יש לי פרופילים תפקודיים שונים, יש צורך בשיטות חדשות לזיהוי תת המיטוכונדריה השונה אלה. מיקרוסקופית מספקת אמצעי לפיו ניתן דמיין המיטוכונדריה פרט ואת הנוכחות של חלבון באו במיטוכונדריה יכול להיקבע על ידי immunofluorescence 2. עם זאת, ניתוח כמותי בשיטה זו הוא עבודה אינטנסיבית ומתאים יותר לניסויים באמצעות שורות תאים הונצחו או עיקריות. המחקר של המיטוכונדריה פרט נגזרת מרקמות הוא באופן משמעותי יותר קשה ורוב השיטות אינן מאפשרות זיהוי קל של תת המיטוכונדריה במקביל לevaluני של פונקציה של המיטוכונדריה 3. כדי להתמודד עם המשוכה הזאת, שיטה חדשנית לimmunolabel מיטוכונדריה מבודדת מרקמות מכרסמים ולאחר מכן נותחה על ידי cytometry זרימה פותח. זה מאפשר לאיתור והכימות של חלבונים מקומיים לקרום החיצוני של המיטוכונדריה, אשר בהשוואה לניתוח על ידי מיקרוסקופ המהיר, היא הרבה פחות עבודה אינטנסיבית ומאפשרת הניתוח של אלפי מיטוכונדריה במדגם יחיד. assay זה יכול להיות מיושם כדי לפקח על הגורל וכמות היחסית של חלבוני קרום החיצוניים של המיטוכונדריה שנחשבים לconstitutively נוכח במיטוכונדריה, הגיוס של חלבונים על פני השטח של המיטוכונדריה, או זיהוי של חלבוני mislocalized למיטוכונדריה במצבים פתולוגיים. יתר על כן, השילוב של צבעי מחוון ניאון קונבנציונליים מאפשר ההערכה בו זמנית של היבטים מסוימים של תפקוד המיטוכונדריה בהמיטוכונדריה שונהאוכלוסיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:349px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:543px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Rats</td>
			<td style="width:349px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">Strain code 400</td>
			<td style="width:543px;">Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:349px;">Kontes Glass Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">885450-0022</td>
			<td>Duall 22</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:349px;">Beckman Coultier</td>
			<td style="width:119px;">344057</td>
			<td>Transparent, thin walled&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sorvall Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall WX UltraSeries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">AH-650 rotor and buckets&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:267px;">Opti-prep</td>
			<td style="width:349px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:119px;">1114542</td>
			<td>Iodixanol, density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Fatty acid free Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8806</td>
			<td>Must be fatty acid free for mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sodium succinate dibasic hexahydrate&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:267px;">Rabbit anti-Mitofusin2 antibody</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:267px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:349px;">Jackson Immuno Research&#160;</td>
			<td style="width:119px;">011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Anti-Rabbit IgG PE</td>
			<td style="width:349px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">12-4739-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Micro titer tube</td>
			<td style="width:349px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">223-9391</td>
			<td>For sample acquisition by flow cytometry&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoTrackerGreen (MTG)</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td>100 nM: Ex490 nm/Em516 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">TMRM</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T668</td>
			<td>100 nM: Ex548 nm/Em574 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CCCP</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoSOX Red</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M36008</td>
			<td>5 &#181;M: Ex540 nm/Em600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">BS FACSDiva Software</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FlowJo</td>
			<td style="width:349px;">TreeStar Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software used for analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">BCA protein assay kit&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td style="width:543px;">Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria

שיטות לאיתור ולמעקב אחר רכיבי חלבון קרום חיצוניים של המיטוכונדריה ברקמות של בעלי חיים הן חיוניות כדי ללמוד פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מתאר טכניקה שבה מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסם הם immunolabeled ונותחה על ידי cytometry זרימה. המיטוכונדריה הוא מבודד מחוט השדרה של מכרסמים ונתונים לצעד העשרה מהיר כדי להסיר מיאלין, חומר מזהם ביותר של שברים במיטוכונדריה הוכנו מרקמת עצבים. אז מיטוכונדריה המבודדת מסומנות עם נוגדן של בחירה ונוגדנים משני מצומדות fluorescently. ניתוח על ידי cytometry זרימה מאמת את טוהר היחסי של הכנות המיטוכונדריה על ידי צביעה עם צבע ספציפי של המיטוכונדריה, ואחריו איתור וכימות של חלבון immunolabeled. טכניקה זו היא מהירה, לכימות ותפוקה גבוהה, המאפשר לניתוח של מאות אלפי מיטוכונדריה לדגימה. זה ישים להערכת p רומןroteins על פני השטח של המיטוכונדריה בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, כמו גם חלבונים שעשויות להפוך mislocalized לאברון זה בפתולוגיה. חשוב לציין, בשיטה זו ניתן מצמידים את צבעי מחוון ניאון כדי לדווח על פעילויות מסוימות של אוכלוסיות המיטוכונדריה ואינה ריאלי למיטוכונדריה ממערכת העצבים המרכזית (מוח וחוט השדרה), כמו גם בכבד.

מיטוכונדריה נובעת ממייתרי השדרה עכברוש ניתן immunolabeled עם נוגדן הממוקד לMitofusin2 (Mfn2), חלבון מעורב באיחוי של הקרום החיצוני של המיטוכונדריה 8. בעקבות בידוד ותיוג עם נוגדן ספציפי Mfn2 ונוגדנים משני מצומדות fluorescently, מיטוכונדריה מעובדות על ידי cytometry זרימה (איור 1). בעקבות רכישת נתונים, דגימות מנותחות באמצעות cytometry זרימת תוכנה לניתוח, על ידי לדמיין את כל האירועים שנאספו על מגרש נקודה (איור 2 א) הראשון. כפילויות וsinglets נבדלים כאשר האירועים נרשמות בFSC, רוחב (W) לעומת אזור (א) (איור 2). ברגע שsinglets נבחרים, שער אוכלוסיית המיטוכונדריה באמצעות FSC / SSC (איור 2 ג), ולאמת את מספר האירועים מכתימים חיובי לצבע מיטוכונדריה הספציפית על ידי שיתוף זומם היסטוגרמה של המדגם בלא כתם עם מדגם מוכתם במיטוכונדריה-SPEצבע cific. כדי לקבוע את האירועים במיטוכונדריה, למקם את שער בצומת של שתי פסגות (איור 2 ד). להכנות חוט השדרה, בדרך כלל&gt; 90% מהאירועים חיוביים לצבע מיטוכונדריה הספציפית. לרקמות אחרות, כגון כבד, ~ 98% מהאירועים יהיו תווית עם הצבע (מידע לא מוצג). לאחר הבחירה רק אירועים שתווית חיובית לצבע מיטוכונדריה הספציפית, לקבוע תיוג רקע עם שליטת אלוטיפ על ידי בחירת שער (Mfn2 +) הכולל 1% או תיוג אלוטיפ פחות (איור 2E, משמאל). החל השער הזה באופן אחיד לכל הדגימות שכותרתו עם הנוגדן Mfn2 כדי לקבוע את האחוז של המיטוכונדריה עם Mfn2 הנוכחי על הממברנה של המיטוכונדריה החיצונית (איור 2E, מימין). בניסוי זה, 30% ממיטוכונדריה נובעים מתווית חוט השדרה חיובית לMfn2. חשוב לציין כאן, כי למרות שMfn2 נחשב mit הביע בכל מקוםחלבון קרום חיצוני ochondrial, זה לא היה לכמת בעבר. יתר על כן, ניתוח immunocytochemical של Mfn2 בתאים בתרבית תערוכות תיוג שאינו הומוגנית של המיטוכונדריה פרט 9. אפשר גם שepitope Mfn2 היה זמין בשל לפרסם שינויי translational או בשל אינטראקציות עם עצמו או שותפים המחייבים אחרים. מן ראוי לציין כי, הנוגדנים במחקר זה נוצר באמצעות פפטיד סינטטי לN-הסופי (חומצות אמינו 38-55). יש גרסת אחוי חזויה של Mfn2 חסרת חומצות אמינו הראשונות 302, למרות שגרסה זו טרם אישרה באופן ניסיוני (מסד נתונים UniProt). לפיכך, assay זה אינו מסוגל לזהות Mfn2 שחבור חלופי חסר רצף N-המסוף, נתן את הנוגדן בשימוש. פוטנציאל מיטוכונדריאלי הטרנסממברני (מ &#39;ΔΨ) וייצור סופראוקסיד ניתן להעריך בassay זה. על פני קרום המיטוכונדריה הפנימי, קיימת הפרדת תשלום ש&quot;שich מניע ייצור ATP באמצעות זירחון חמצוני. TMRM הוא צבע קטיוני שמצטבר בתוך המיטוכונדריה באופן תלוי פוטנציאל הממברנה 5, ולכן ניתן להשתמש בו ככתב של פוטנציאל הטרנסממברני המיטוכונדריה. רוב מיטוכונדריה (95%) הם TMRM חיובי לאחר צביעה, בהשוואה לשליטה בלא כתם (איור 3 א). עם זאת, כאשר CCCP uncoupler הוא הוסיף שיש ירידה משמעותית במספרם של המיטוכונדריה מסוגלת לשמור TMRM (איור 3 א). CCCP מאפשר מעבר החופשי של יונים על פני קרום המיטוכונדריה הפנימי, במהות הורס את הפרדת תשלום וdepolarizing הקרום. סופראוקסיד שחרור המיטוכונדריה כתוצר לוואי נורמלי של זרחון חמצוני מאני מורכב וIII של שרשרת העברת אלקטרונים. סופראוקסיד מיטוכונדריאלי ניתן למדוד באמצעות צבע חדיר קרום שהוא ממוקד למיטוכונדריה והופך follo ניאוןאגף תגובה עם סופראוקסיד 7. מיטוכונדריה פונקציונלית לייצר כמות בסיסית של סופראוקסיד בהשוואה לדגימות בלא כתם (איור 3 ב). תוספת של המעכב המורכב III Antimycin מניבה עלייה בסופראוקסיד, כפי שניתן לראות על ידי תזוזה ימינה בתפרחת ומספר גבוה יותר של מיטוכונדריה (בדרך כלל ~ 10%) כי הם ניאון עם הצבע הזה המיטוכונדריה סופראוקסיד מחוון (איור 3 ב). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 סכמטי של בידוד, immunolabeling וניתוח של המיטוכונדריה. שלב 1: איסוף רקמות וhomogenize שלב 2:. הליך הבידוד מכיל שמונה שלבי צנטריפוגה. המיאלין, בלימה העיקרית של רקמת מערכת עצבים המרכזית הוסר על ידי דילול מיטוכונדריה בiodixanol (בינוני שיפוע צפיפות) וcentrifuging, וכתוצאה מכך המיאלין צף למעלה של הצינור, תוך המיטוכונדריה pelleted שלב 3:. בעקבות בידוד וכימות, מיטוכונדריה חסומה, שכותרתו עם נוגדן ראשוני ורחץ. נוגדנים משני מצומדת לfluorophore הוא הוסיף לאחר מכן. נוגדן מאוגד נשטף החוצה שלב 4:. בשלב ניתן להוסיף צבעי ניאון שידווחו על טוהר המיטוכונדריה, או פונקציה של המיטוכונדריה זה שלב 5:. המיטוכונדריה הוא עכשיו מוכן להיות מנותח על ידי cytometry זרימה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887fig2highres.jpg" width="500" /> אסטרטגיה איור 2 לניתוח מיטוכונדריה המבודדת על ידי cytometry זרימה. המתחים קדימה פיזור (FSC) וצד פיזור (SSC) חייבת להיות מותאם לאירועים קטנים, משתמשים בשתי הפרמטרים במצב לוגריתמים. רוחב FSC נתונים (FSC-W) חייבים להיותנאסף שלא לכלול כפילויות. הערה, ברוב הזרימה cytometers, הגדרת ברירת המחדל עבור FSC ו SSC הוא מצב ליניארי. () דמיינו את כל האירועים שנאספו על מגרש נקודה. (B) כפילויות, שתי המיטוכונדריה עוברת הלייזר באותו הזמן, ניתן להבחין בין singlets על ידי התוויית FSC לעומת FSC-W (מצב לינארי). אירועים אינם נכללים אם ערך FSC-W הוא יותר מכפול מערך FSC-W הממוצע של רוב האירועים, כלומר, אלה שהם חלק מהענן הסמיך. אירועים תחת סף זה הם מגודרים כsinglets. (C) שוב, לדמיין את האירועים בעלילה נקודה, ושער על האירועים שנותרו. (ד) מגרש היסטוגרמה של המדגם בלא כתם מדגם (מוצק, אפור, מלא) ומוכתם עם צבע המיטוכונדריה ספציפי (MSD: מוצק, ירוק). שער האירועים מכתימים חיובי עבור MSD (MSD +). (ה) היסטוגרמה של שליטת אלוטיפ, ארנב IgG (מקווקו, שחורים) ומדגם שכותרתו Mfn2 (מוצק, ורוד).הגדר את השער כדי להניב ≤ 1% + Mfn2 בשיא שליטת אלוטיפ וליישם את אותו השער הזה למדגם ניסיוני על מנת לקבוע את אחוז אירועי תיוג החיובי לMfn2 (Mfn2 +). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51887/51887fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887fig3highres.jpg" width="500" /> ייצור איור 3 (מ &#39;ΔΨ) Assaying הטרנסממברני המיטוכונדריה פוטנציאל וסופראוקסיד במיטוכונדריה המבודדת על ידי cytometry זרימה. (א) בתנאים בסיסיים כל המיטוכונדריה הפעילה תהיה תווית עם TMRM (מוצק, שחור), בהשוואה לשליטה בלא כתם (מוצק, אפור, מלא) בגלל הצבע מצטבר במיטוכונדריה עם פוטנציאל הטרנסממברני. Addi<html> tion של CCCP protonophore (מקווקו, הכחול) מתפוגג הפוטנציאל הטרנסממברני גורם מיטוכונדריה לdepolarize ולשמר פחות צבע שהשוואה לתנאים בסיסיים. הנתונים הוא כפי שדווח הדלתא מתכוונים עוצמת ניאון (ΔMFI), המהווה את עוצמת הניאון הממוצעת של השליטה בלא כתם יורדת מעוצמת הניאון הממוצעת של המדגם. (ב &#39;) בתנאים בסיסיים, המיטוכונדריה לייצר סופראוקסיד כתוצר לוואי של חמצון זרחון. מקור המיטוכונדריה זה של סופראוקסיד יכול להיות assayed עם מחוון המיטוכונדריה סופראוקסיד, (MitoO 2: מוצק, שחור) בהשוואה לשליטה בלא כתם (מוצק, אפור, מלא). תוספת של המעכב המורכב III, Antimycin תוצאות (מקווקוים, כתום) בייצור סופראוקסיד מוגבר, בהשוואה לרמות בסיס. הנתונים שדווחו כאחוז מתאים מכתימים חיובי למדד MitoO 2.k &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria at JoVE.com

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

שתואר כאן הוא שיטה לאיתור וללכמת חלבוני קרום חיצוני של המיטוכונדריה ידי immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסמים וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטה זו ניתנת להארכה על מנת להעריך היבטים פונקציונליים של אוכלוסיות המיטוכונדריה.

Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Google

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Views.  Université de Montréal, CRCHUM.  שתואר כאן הוא שיטה לאיתור וללכמת חלבוני קרום חיצוני של המיטוכונדריה ידי immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסמים וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטה זו ניתנת להארכה על מנת להעריך היבטים פונקציונליים של אוכלוסיות המיטוכונדריה. 

Video: Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.

MitoCeption: העברת המיטוכונדריה MSC אדם מבודד בתאי גזע Glioblastoma

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...