Ringraziamo Laurie Destroismaisons e Sarah Peyrard per un supporto tecnico e Dr.Alexandre Prat per l&#39;accesso al citofluorimetro. Vorremmo inoltre ringraziare il dottor Timothy Miller per il suo contributo per quanto riguarda la rimozione della mielina dai preparativi. Questo lavoro è stato supportato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Neuromuscular Research Partnership, Canadian Foundation for Innovation, ALS Society of Canada, la Fondazione Frick per la SLA Research, CHUM Fondazione e Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV). Sia CVV e NA sono studiosi di ricerca del Fonds de la Recherche en Santé du Québec e CIHR nuovi ricercatori. SP è sostenuto dalla Tim Noël Studentship dalla ALS Society of Canada.

Animali utilizzati in questo studio sono stati trattati in stretta conformità ad un protocollo (N08001CVsr) approvato dal du Centre Hospitalier de l&#39;Université de Montréal (CRCHUM) Comitato istituzionale Centre de Recherche per la protezione degli animali che segue gli standard nazionali, come delineato dalla Canadian Consiglio su Animal Care (CCAC). Preparare tutti i reagenti necessari per eseguire questo protocollo (Tabella 1). Tutti gli altri dettagli riguardanti attrezzature, forniture e fornitori possono essere trovati nella lista dei materiali. <img alt="Tabella 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> Tabella 1 Buffer Composizioni. 1 Raccolta di Rat Spinal Cord <ol><li> Profondamente anestetizzare il ratto (Sprague Dawley) con il 4% isoflorane. Verificare l&#39;anestesia da una mancanza di riflesso su di schiacciamento di the zampa anteriore. Euthanize il ratto per decapitazione mediante ghigliottina. Questo metodo di eutanasia è preferito rispetto ad altri, che potrebbero distorcere il midollo spinale. </li><li> Tagliare la pelle della schiena per esporre la colonna vertebrale. Tagliare la colonna vertebrale con le forbici osso appena sopra l&#39;osso pelvico. Visualizzare l&#39;apertura della colonna vertebrale. </li><li> Inserire una siringa da 10 ml, con una pipetta punta di 200 microlitri (collegato tramite la fusione poco più di fiamma), riempita con tampone fosfato (PBS), nella colonna vertebrale. </li><li> Lavare il midollo spinale, applicando una quantità media di pressione allo stantuffo. </li><li> Se è presente del sangue sul midollo spinale, risciacquare con PBS prima di procedere alla fase successiva. NOTA: Questo metodo è stato validato anche per il cervello e il fegato. Se tra cui questi tessuti, raccogliere la metà del cervello dal ratto eutanasia e un pezzo di fegato pari in peso al midollo spinale. Tutti gli altri passaggi rimangono identici. </li></ol> 2 Isolamento del midollo spinale Mitochondria (Adattato da Vande Velde et al. 4) <ol><li> Raccogliere tutto il midollo spinale intatta e posto in 5 ml omogeneizzatore vetro con 5 volumi (~ 3,25 ml) Omogeneizzazione Buffer (HB). Per il recupero ottimale dei mitocondri isolati, eseguire tutti i passaggi su ghiaccio o in camera fredda. Omogeneizzare i tessuti a mano fino a quando rimangono senza grandi pezzi di tessuto, circa otto colpi. Mettere omogenato in due (2 ml) o tre (1,7 ml) microprovette. Centrifuga 1.300 xg per 10 min a 4 ° C in una microcentrifuga da banco. </li><li> Recuperare il surnatante e posto in un tubo ultracentrifuga 5 ml. Aggiungere 750 ml (~ 0,5 volumi) HB alla provetta-pellet contenente e risospendere delicatamente il pellet. Ripetere la centrifugazione e risospensione passi altre due volte. Pool tutti i surnatanti (S1a e S1b) nella stessa 5 ml tubo ultracentrifuge sopra. Questo passaggio serve per eliminare piccoli detriti. </li><li> Centrifugare riunito S1 utilizzando un&#39;ultracentrifuga dotato di marciume oscillante secchioo e centrifugare a 17.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Tenere surnatante (S2) per l&#39;ulteriore elaborazione se la frazione citosolica è di interesse (ad esempio per le analisi Western blot). Risospendere il pellet (P2), la frazione mitocondriale grezzo, in 4 ml HB + KCl 50 mM. Centrifugare 17.000 xg per 15 min a 4 ° C in un rotore oscillante. Eliminare il supernatante e risospendere delicatamente il pellet (P3) in 800 ml HB. NOTA: I mitocondri vengono lavati con HB + 50 mM KCl per rimuovere eventuali contaminanti mitocondrialmente associati non specifici. </li><li> In un nuovo 5 ml tubo Ultracentrifuge, aggiungere esattamente 800 ml di sedimento risospeso (P3). </li><li> Per aggiungere questo tubo, 200 ml di Iodixanolo (media gradiente di densità), creando così una concentrazione finale del 12% Iodixanolo. Miscelare il contenuto della provetta delicatamente, ma accuratamente mediante pipettaggio con un P1000. Aggiunta di Iodixanolo prima, e poi pellet risospeso (P3) può essere preferibile per facilitare un&#39;accurata miscelazione. Centrifugare in un ultracentrifuge dotato di un rotore benna oscillante a 17.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> NOTA: Fegato non contiene mielina e, pertanto, questo passaggio non è necessario se solo il fegato è in fase di elaborazione. Tuttavia, se il fegato sta per essere eseguita in concomitanza con mitocondri del SNC, si raccomanda di trattare tutti i tessuti allo stesso modo. </li><li> Aspirare lo strato di mielina nella parte superiore del tubo e con attenzione rimuovere e scartare il surnatante. Pellet potrebbe essere allentato. Risospendere il pellet in 4 ml di HB. Centrifugare nuovamente a 17.000 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 4 ml di HB. Ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet finale (P7) in 100-200 ml HB e trasferire in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga. Questo campione contiene mitocondri isolati. </li><li> Procedere alla proteina quantificazione. Diluire i campioni e la curva standard nel 2% sodio dodecil solfato (SDS) per assicurare un&#39;adeguata solubilizzazione dei mitocondri During proteina quantificazione. </li></ol> 3. immunomarcatura di mitocondri isolati per Citometria a flusso <ol><li> Per ogni mix colorazione da testare, pipetta 25 mg di mitocondri isolati in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga. Includere un campione senza macchia in ogni esperimento; e per ogni anticorpo, essere sicuri di includere un campione per il controllo isotipico appropriato. </li><li> Centrifugare a 17.000 xg per 2 min a 4 ° C in una microcentrifuga da banco. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere mitocondri isolati in 50 microlitri mitocondri Buffer (Buffer M) supplementato con 10% di BSA libera acidi grassi per 15 min a 4 ° C (blocco passo). NOTA: Durante l&#39;etichettatura, effettuare incubazioni in frigorifero a 4 ° C. </li><li> Aggiungere l&#39;anticorpo primario (coniglio anti-MFN2, 20 mg per ml) per tubo e incubare per 30 minuti a 4 ° C. NOTA: Determinare la concentrazione ottimale di ciascun anticorpo empiricamente mediante titolazione. A causa della variabilità della concentrazione e / o purezza, diversi lotti dello stesso anticorpo dello stesso produttore possono portare a risultati diversi; pertanto è necessaria titolazione per ciascun nuovo lotto di anticorpi. </li><li> Lavare anticorpo primario non legato: Centrifugare a 17.000 xg per 2 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente il pellet in 200 ml M Buffer. Centrifugare a 17.000 xg per 2 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 50 microlitri M tampone. </li><li> Aggiungere l&#39;anticorpo secondario (Donkey anti-coniglio IgG ficoeritrina (PE), 0,5 mg per ml) di tubo e incubare i campioni per 30 minuti a 4 ° C, al riparo dalla luce. </li><li> Lavare anticorpo secondario non legato: Centrifugare a 17.000 xg per 2 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml M Buffer. Centrifugare a 17.000 xg per 2 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri M tampone. </li><li> Per assicurare gli eventi sono in realtà mitocondri, macchia isolato mitocondri concolorante mitocondri specifico fluorescente per 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Se si desidera la colorazione di altri parametri funzionali (potenziale transmembrana mitocondriale o di produzione superossido), passare al punto 4 In caso contrario, passare al punto 5 per l&#39;acquisizione. NOTA: È importante verificare che lo spettro di emissione della anticorpo secondario è compatibile con quella dei coloranti funzionali. Ad esempio, se la verifica purezza mitocondriale con un colorante commerciale con proprietà spettrali simili a potenziale transmembrana con FITC e tetramethylrhodamine estere metilico (TMRM), un anticorpo secondario praticabile sarebbe allophycocyanin (APC: Ex 650 nm / em 660 nm). Aggiungere controlli compensazioni, cioè, un campione immunolabeled o tinto con un unico fluoroforo, quando applicabile. </li><li> Trasferire in un tubo adatto per il flusso di carico citometro. (Per facilitare la piccola dimensione del campione, un tubo di microtitolazione è collocato all&#39;interno 3 ml citofluorimetro tubo.) Conservare i campioni in ghiaccio e procedere immediatamente allacitofluorimetro per l&#39;acquisizione. </li></ol> 4 Saggio mitocondriale potenziale transmembrana mitocondriale superossido e Produzione per Citometria a flusso <ol><li> Verificare che i mitocondri isolati hanno un potenziale transmembrana intatto dalla colorazione con 100 nM TMRM (Ex 548 nm / 574 nm Em) 5, al punto 3.8, per 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Per il confronto del potenziale transmembrana tra i campioni e popolazioni, l&#39;uso di concentrazioni inferiori / non-tempra di TMRM (da 1 a 30 Nm), può essere più appropriato 6. <ol><li> Come controllo per TMRM colorazione, macchia mitocondri isolati con 100 nM TMRM in presenza di 100 mM carbonilico cianuro m-cloro fenil idrazina (CCCP), un disaccoppiatore mitocondriale che depolarizzare mitocondri. La concentrazione di CCCP necessaria per depolarizzare i mitocondri può essere inferiore se si utilizzano più basse concentrazioni di colorante. </li></ol></li><li> Verificare che i mitocondri isolati producono superossido mitocondriale da staining con un appropriato indicatore superossido mitocondriale 7, anche al punto 3.8, per 15 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. <ol><li> Come controllo per la produzione di superossido mitocondriale, macchia mitocondri isolati con colorante in presenza di 10 mM Antimicina A, un inibitore del complesso III della catena respiratoria che aumenterà la produzione di superossido mitocondriale. </li></ol></li></ol> 5. acquisizione e analisi dei immunolabeled mitocondri isolati da Citometria a flusso <ol><li> Strumento costituito: tensioni Passare dalla lineare alla modalità log per facilitare l&#39;analisi dei mitocondri isolati e tensioni previste (FSC: 450; SSC: 250). Assicurarsi che gli eventi sono raccolti in FSC modo A (area) così come FSC-W (larghezza) e FSC-H (altezza), per poter escludere doppietti (cioè due eventi, passano attraverso il rivelatore allo stesso tempo ) nella raccolta di post-analisi dei dati. Impostare il numero di eventi da raccogliere a 100.000. Acquisire i controlli di compensazione, Se applicabile. </li><li> Acquisizione dati: Prima di acquisizione dei dati, evitare vortex campioni. Invece Mescolare agitando leggermente il tubo. Inizialmente la raccolta di eventi a bassa pressione, durante gating. Gate popolazione totale. Regolare le tensioni di istogrammi di conseguenza, di solito il picco del campione non colorato corrisponderà al secondo decennio (10 2). Una volta che cancelli sono stabiliti, ei campioni vengono elaborati, la pressione può essere commutata in alto. </li><li> Analisi: Visualizza doppietti tracciando FSC-W contro FSC. Identificare canottiere e doppiette. Gate canottiere. Selezionare la popolazione mitocondriale da gating su eventi che sono macchiati positivamente con un colorante mitocondriale selettivo. </li><li> Determinare l&#39;etichettatura sfondo da controllo isotipico. Utilizzando il campione di controllo isotipico, determinare la percentuale della popolazione di etichettatura mitocondriale positivo per gli anticorpi MFN2. </li></ol>

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P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1.">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li><li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamin-related+protein+1,+a+mediator+of+mitochondrial+fission,+in+apoptosis.">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li><li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalh&#227;es, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant.">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li><li>Tantama, M., Martinez-Fran&#231;ois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio.">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

E &#39;sempre più evidente che i mitocondri sono i principali attori sia normale fisiologia e patologia. Mentre immunoblotting può determinare quali proteine ​​si trovano all&#39;interno dei mitocondri né sulla superficie mitocondriale in una certa condizione, questo metodo relazioni sulla media dell&#39;intera popolazione. Questo metodo non può fornire informazioni sulle abbondanze relative delle sottopopolazioni mitocondriali o sottoinsiemi. Mentre è stato precedentemente ipotizzato che tutti i mitocondri son...

I mitocondri sono organelli altamente dinamiche che subiscono vari cicli di fissione e fusione, sono trasportati ai siti di domanda di alta energia e di rispondere rapidamente agli stimoli fisiologici 1. Poiché è sempre più riconosciuto che i mitocondri all&#39;interno di diversi tessuti, anche diversi compartimenti cellulari, hanno profili funzionali distinti, nuovi metodi sono necessari per identificare questi sottoinsiemi mitocondriali distinti. Microscopia fornisce un mezzo attraverso il quale i singoli mitocondri possono essere visualizzati e la presenza di una proteina in o nei mitocondri può essere determinato mediante immunofluorescenza 2. Tuttavia, l&#39;analisi quantitativa con questo metodo è laborioso ed è più adatto per gli esperimenti che utilizzano linee cellulari immortalizzate o primari. Lo studio dei mitocondri individuale derivate da tessuti è molto più difficile e la maggior parte dei metodi non consentono una facile identificazione di sottoinsiemi mitocondriali in concomitanza con la valuzione della funzione mitocondriale 3. Per far fronte a questo ostacolo, un nuovo metodo per immunolabel mitocondri isolati da tessuti di roditori e successivamente analizzati mediante citometria a flusso è stato sviluppato. Questo permette la rapida individuazione e la quantificazione delle proteine ​​localizzate alla membrana esterna mitocondriale, che rispetto all&#39;analisi al microscopio, è molto meno laborioso e permette l&#39;analisi di migliaia di mitocondri in un singolo campione. Questo test può essere applicato per controllare il destino e la quantità relativa di proteine ​​di membrana esterna mitocondriale che si pensa siano costitutivamente presente alla mitocondri, l&#39;assunzione di proteine ​​alla superficie mitocondriale, o la rilevazione di proteine ​​mislocalized ai mitocondri in condizioni patologiche. Inoltre, l&#39;incorporazione di coloranti convenzionali indicatori fluorescenti consente la valutazione simultanea di alcuni aspetti della funzione mitocondriale in mitocondriale distintosottopopolazioni.

<table><tbody><tr><td>Rats</td><td>Charles River</td><td>Strain code 400</td><td>Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>Kontes Glass Co.&amp;nbsp;</td><td>885450-0022</td><td>Duall 22</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall Legend Micro 17 R</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td>Transparent, thin walled&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall WX UltraSeries</td></tr><tr><td>AH-650 rotor and buckets&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-prep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114542</td><td>Iodixanol, density gradient medium</td></tr><tr><td>Fatty acid free Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td>Must be fatty acid free for mitochondria</td></tr><tr><td>Sodium succinate dibasic hexahydrate&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9637</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Mitofusin2 antibody</td><td>Sigma</td><td>M6319</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research&amp;nbsp;</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4739-81</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9391</td><td>For sample acquisition by flow cytometry&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MitoTrackerGreen (MTG)</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td>5 &amp;micro;M: Ex 540 nm/Em 600 nm</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8874</td><td></td></tr><tr><td>LSR II flow cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>Software used for analysis</td></tr><tr><td>BCA protein assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS</td></tr></tbody></table>

immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria

Metodi per rilevare e monitorare mitocondriali componenti proteiche della membrana esterna nei tessuti animali sono di vitale importanza per lo studio della fisiologia mitocondriale e fisiopatologia. Questo protocollo descrive una tecnica in cui i mitocondri isolati da tessuto roditori sono immunolabeled e analizzati mediante citometria a flusso. I mitocondri sono isolate dal midollo spinale di roditori e sottoposti ad una fase di arricchimento rapido in modo da rimuovere mielina, un importante contaminante di frazioni mitocondriali preparate da tessuto nervoso. Mitocondri isolati vengono poi etichettati con un anticorpo di scelta e di un anticorpo secondario coniugato fluorescente. L&#39;analisi per flusso citometria verifica la relativa purezza delle preparazioni mitocondriali da colorazione con un colorante specifico mitocondriale, seguita da rilevamento e la quantificazione di proteine ​​immunolabeled. Questa tecnica è rapido, quantificabile e ad alta velocità, consentendo l&#39;analisi di centinaia di migliaia di mitocondri per campione. È applicabile per valutare romanzo proteins sulla superficie mitocondriale in condizioni fisiologiche normali, così come le proteine ​​che possono diventare mislocalized a questo organello durante patologia. È importante sottolineare che questo metodo può essere accoppiato a coloranti indicatori fluorescenti a riferire su determinate attività di sottopopolazioni mitocondriali ed è fattibile per i mitocondri del sistema nervoso centrale (cervello e midollo spinale), così come il fegato.

I mitocondri derivate da midollo spinale di ratto possono essere immunolabeled con un anticorpo mirato al Mitofusin2 (MFN2), una proteina coinvolta nella fusione della membrana esterna dei mitocondri 8. Dopo aver isolato e marcatura con un anticorpo specifico MFN2 e un anticorpo secondario coniugato fluorescente, mitocondri vengono elaborati mediante citometria di flusso (Figura 1). Dopo l&#39;acquisizione dei dati, i campioni vengono analizzati mediante citometria a flusso software di analis...

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Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Qui descritto è un metodo per rilevare e quantificare proteine ​​di membrana mitocondriale esterna da immunomarcatura di mitocondri isolati da tessuto roditore e l&#39;analisi mediante citometria a flusso. Questo metodo può essere esteso a valutare aspetti funzionali di sottopopolazioni mitocondriali.

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine ​​mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Views.  Université de Montréal, CRCHUM.  Qui descritto è un metodo per rilevare e quantificare proteine ​​di membrana mitocondriale esterna da immunomarcatura di mitocondri isolati da tessuto roditore e l'analisi mediante citometria a flusso. Questo metodo può essere esteso a valutare aspetti funzionali di sottopopolazioni mitocondriali. 

Video: Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

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Biochimica

Isolamento dei siti di contatto mitocondriali

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Autore in primo piano: Svelare i siti di contatto mitocondriali e le intuizioni architettoniche 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Immunologia e infezioni

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Un'analisi basata su citometria a flusso per misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci dopo ipossia/riossigenazione

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Medicina

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Biologia

Application of Flow Cytometric Analysis for Measuring Multiple Mitochondrial Parameters in 3D Brain Organoids

Mitochondrial dysfunction is a common primary or secondary contributor to many types of neurodegeneration, and changes in mitochondrial mass, mitochondrial respiratory chain (MRC) complexes, and mitochondrial DNA (mtDNA) copy number often feature in these processes. Human brain organoids derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) recapitulate the brain&#39;s three-dimensional (3D) cytoarchitectural arrangement and offer the possibility to study disease mechanisms and screen new therapeutics in a complex human system. Here, we report a unique flow cytometry-based approach to measure multiple mitochondrial parameters in iPSC-derived cortical organoids. This report details a protocol for generating cortical brain organoids from iPSCs, single-cell dissociation of generated organoids, fixation, staining, and subsequent flow cytometric analysis to assess multiple mitochondrial parameters. Double staining with antibodies against the MRC complex subunit NADH: Ubiquinone Oxidoreductase Subunit B10 (NDUFB10) or mitochondrial transcription factor A (TFAM) together with voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC 1) permits assessment of the amount of these proteins per mitochondrion. Since the quantity of TFAM corresponds to the amount of mtDNA, it provides an indirect estimation of the number of mtDNA copies per mitochondrial content. This entire procedure can be completed within a span of 2-3 h. Crucially, it allows for the concurrent quantification of multiple mitochondrial parameters, including both total and specific levels relative to the mitochondrial mass.

This protocol reports a unique method of using a streaming cytometer and multiple antibodies for simultaneous assessment of multiple mitochondrial functional parameters, including changes in mitochondrial volume, amounts of the mitochondrial respiratory chain (MRC) complex subunits, and mitochondrial DNA (mtDNA) replication.

Mitochondrial dysfunction is a common primary or secondary contributor to many types of neurodegeneration, and changes in mitochondrial mass, ...

Neuroscienze

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Misura sensibile di Mitophagy di flusso Cytometry utilizzando il pH-dipendente Reporter fluorescente mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

Riepilogo

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Isolamento e misure respiratoria dei mitocondri da Arabidopsis thaliana

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Un metodo migliorato per isolare i siti di contatto mitocondriali

Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

Un'analisi basata su citometria a flusso per misurare il potenziale di membrana mitocondriale in miociti cardiaci dopo ipossia/riossigenazione

Isolamento e analisi funzionale dei mitocondri da cellule in coltura e Tissue mouse

Application of Flow Cytometric Analysis for Measuring Multiple Mitochondrial Parameters in 3D Brain Organoids

Misura sensibile di Mitophagy di flusso Cytometry utilizzando il pH-dipendente Reporter fluorescente mt-Keima

Rilevamento e caratterizzazione dell'autoassemblaggio proteico in vivo da parte della Cytometria di flusso

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine ​​mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

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Rilevamento e caratterizzazione dell'autoassemblaggio proteico in vivo da parte della Cytometria di flusso

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine mediante citometria di flusso di mitocondri isolati