Wir danken Laurie Destroismaisons und Sarah Peyrard für hervorragende technische Unterstützung und Dr.Alexandre Prat für den Zugang zum Durchflusszytometer. Wir möchten auch Dr. Timothy Miller für seinen Beitrag anerkennen, in Bezug auf die Entfernung von Myelin von den Vorbereitungen. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) Neuromuskuläre Forschung Partnerschaft, kanadischen Stiftung für Innovation, ALS Society of Canada, der Frick-Stiftung für ALS-Forschung, CHUM Stiftung und Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV) unterstützt. Sowohl CVV und NA sind Forschung Gelehrten des Fonds de la Recherche en Santé du Québec und New CIHR Ermittler. SP wird von der Tim Noël Studentship von der ALS-Gesellschaft von Kanada unterstützt.

Tiere in dieser Studie verwendet wurden in strikter Übereinstimmung mit einem Protokoll (N08001CVsr), die vom Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l&#39;Université de Montréal (CRCHUM) Institutionelle Ausschuss für den Schutz der Tiere zugelassen, die nationalen Normen im Sinne der kanadischen skizziert folgt behandelt Rates über Animal Care (CCAC). Bereiten Sie alle erforderlich, um dieses Protokoll (Tabelle 1) durchführen Reagenzien. Alle anderen Details bezüglich Ausrüstung, Material und Lieferanten können in der Liste der Materialien gefunden werden. <img alt="Tabelle 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> Tabelle 1. Pufferzusammensetzungen. 1. Erhebung von Rattenrückenmark <ol><li> Tief betäuben die Ratte (Sprague Dawley) mit 4% isoflorane. Stellen Sie sicher, Betäubung durch einen Mangel an Reflex auf Kneifen von the Vorderpfote. Euthanize die Ratte durch Enthauptung über Guillotine. Diese Methode der Euthanasie wird über andere, die das Rückenmark verzerren könnten bevorzugt. </li><li> Schneiden Sie die Haut am Rücken, die Wirbelsäule freizulegen. Schneiden Sie die Wirbelsäule mit Knochen Schere knapp über dem Beckenknochen. Visualisierung der Öffnung der Wirbelsäule. </li><li> Legen Sie eine 10 ml-Spritze mit einer Pipettenspitze 200 ul (durch Schmelzen leicht über Flamme angebracht), mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gefüllt ist, in der Wirbelsäule. </li><li> Ausspülen des Rückenmarks unter Anwendung einer mittleren Menge von Druck auf den Plunger. </li><li> Wenn kein Blut auf das Rückenmark vorhanden ist, mit PBS spülen, bevor Sie zum nächsten Schritt. Hinweis: Diese Methode ist auch für Gehirn und Leber validiert. Wenn auch diese Gewebe, sammeln die Hälfte des Gehirns von der Ratte getötet und ein Stück Leber gleich im Gewicht des Rückenmarks. Alle anderen Schritte bleiben gleich. </li></ol> 2. Isolierung von Spinal Cord Mitochondria (von Vande Velde et al Angepasst 4.) <ol><li> Sammeln Sie die ganze intakte Rückenmark und in 5 ml Glas-Homogenisator mit 5 Volumina (~ 3,25 ml) Homogenisationspuffer (HB). Für eine optimale Erholung der isolierten Mitochondrien, alle Schritte auf Eis oder in kalten Raum. Homogenisieren Gewebe von Hand, bis keine großen Stücke von Gewebe bleiben, etwa acht Schlägen. Platzieren Homogenat in zwei (2 ml) oder drei (1,7 ml)-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge 1.300 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Tischmikrozentrifuge. </li><li> Recover Überstand und in eine 5 ml Ultrazentrifugenröhrchen. Fügen Sie 750 ul (~ 0,5 Volumen) HB zum Pellet-haltigen Mikrozentrifugenröhrchen und sanft das Pellet. Wiederholen Sie die Schritte Zentrifugation und Resuspension zwei weitere Male. Pool alle Überstände (S1a und S1b) in der gleichen 5 ml Ultrazentrifugenröhrchen oben. Dieser Schritt dient dazu, kleine Fremdkörper zu entfernen. </li><li> Zentrifuge gebündelt S1 mit einer Ultrazentrifuge mit einem schwingenden Eimer rot ausgestattetoder und Zentrifuge bei 17.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. </li><li> Halten Überstand (S2) für die weitere Verarbeitung, wenn die cytosolische Fraktion von Interesse ist (beispielsweise für Western-Blot-Analyse). Das Pellet (P2), das rohe mitochondriale Fraktion, in 4 ml HB + 50 mM KCl. Zentrifuge 17.000 × g für 15 min bei 4 ° C in einem Schwingbecher-Rotor. Überstand verwerfen und das Pellet vorsichtig (P3) in 800 ul HB. HINWEIS: Die Mitochondrien sind mit HB + 50 mM KCl gewaschen, um alle nicht-spezifische mitochondrial-assoziierte Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> In einer neuen 5 ml Ultrazentrifugenröhrchen, fügen Sie genau 800 ul des resuspendierten Pellets (P3). </li><li> Um dieses Rohr hinzuzufügen, 200 ul Iodixanol (Dichtegradienten-Medium), wodurch eine Endkonzentration von 12% Iodixanol schaffen. Mischen Sie den Inhalt des Rohres sanft, aber gründlich über Pipettieren mit einer P1000. Zugabe von Iodixanol zuerst, und dann resuspendiert Pellet (P3) kann bevorzugt sein, um ein gründliches Mischen zu erleichtern. Zentrifuge in einem ULTracentrifuge mit einem Schwingbecher-Rotor ausgestattet war, bei 17.000 × g für 15 min bei 4 ° C ist. </li><li> HINWEIS: Leber nicht Myelin enthalten und daher ist dieser Schritt nicht erforderlich, wenn nur die Leber verarbeitet wird. Allerdings, wenn Leber, die gleichzeitig mit ZNS-Mitochondrien verarbeitet wird, ist es empfehlenswert, alle Gewebe gleich zu behandeln. </li><li> Saugen Sie die Schicht von Myelin an der Spitze des Rohres und sorgfältig zu entfernen und den Überstand verwerfen. Pellet kann locker sein. Das Pellet in 4 ml HB. Zentrifuge wieder bei 17.000 × g für 10 min bei 4 ° C ist. Überstand verwerfen und das Pellet in 4 ml HB. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Entfernen des Überstandes. </li><li> Resuspendieren endgültige Pellet (P7) in 100-200 ul HB und in ein 1,7 ml Reaktionsgefäß. Diese Probe enthält isolierte Mitochondrien. </li><li> Fahren Sie mit Proteinquantifizierung. Verdünnte Proben und der Standardkurve in 2% Natriumdodecylsulfat (SDS), um eine ausreichende Solubilisierung der Mitochondrien Duri gewährleistenng Protein-Quantifizierung. </li></ol> 3. Immunmarkierung von isolierten Mitochondrien für die Durchflusszytometrie <ol><li> Für jede zu testende Färbung Mix Pipette 25 ug der isolierten Mitochondrien in ein 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie eine ungefärbte Probe in jedem Experiment; und für jeden Antikörper, sicher sein, um eine Probe für die entsprechende Isotyp-Kontrolle umfassen. </li><li> Zentrifuge bei 17.000 × g für 2 min bei 4 ° C in einem Labor-Mikrozentrifuge. </li><li> Überstand entfernen und resuspendieren isolierten Mitochondrien in 50 ul Puffer Mitochondrien (M-Puffer) mit 10% fettsäurefrei BSA ergänzt für 15 min bei 4 ° C (Blockierungsschritt). HINWEIS: Während der Etikettierung, führen Inkubationen in einem Kühlschrank bei 4 ° C. </li><li> Fügen primären Antikörper (Kaninchen-Anti-Mfn2, 20 ug pro ml) Rohr und Inkubation für 30 min bei 4 ° C. HINWEIS: Bestimmen Sie die optimale Konzentration von jedem Antikörper empirisch durch Titration. Aufgrund der Variabilität der Konzentration und / oder purity, verschiedenen Chargen des gleichen Antikörper vom gleichen Hersteller kann zu unterschiedlichen Ergebnissen führen; Daher Titration wird für jede neue Charge von Antikörper benötigt. </li><li> Auswaschen ungebundenen primären Antikörper: Zentrifuge bei 17.000 g für 2 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und sanft das Pellet in 200 ul M Buffer. Zentrifuge bei 17.000 × g für 2 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und das Pellet in 50 ul M Buffer. </li><li> Fügen Sekundärantikörper (Esel Anti-Kaninchen-IgG-Phycoerythrin (PE), 0,5 g pro ml) Rohr und Inkubation Proben für 30 min bei 4 ° C, vor Licht geschützt. </li><li> Auswaschen ungebundenen Sekundärantikörper: Zentrifuge bei 17.000 g für 2 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 200 ul M Buffer. Zentrifuge bei 17.000 × g für 2 min bei 4 ° C ist. Überstand entfernen und das Pellet in 500 ul M Buffer. </li><li> Um sicherzustellen, dass Ereignisse sind in der Tat Mitochondrien, Flecken isolierten Mitochondrien mit einMitochondrien spezifischen Fluoreszenzfarbstoff für 15 min bei RT, vor Licht geschützt. Wenn Färbung von anderen Funktionsparameter (mitochondrialen Transmembranpotentials oder Superoxid-Produktion) gewünscht wird, gehen Sie zu Schritt 4. Wenn nicht, fahren Sie mit Schritt 5 für den Erwerb. HINWEIS: Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Emissionsspektrum des sekundären Antikörpers ist, dass mit der funktionellen Farbstoffe kompatibel. Wenn beispielsweise die Überprüfung der mitochondrialen Reinheit mit einem kommerziellen Farbstoff mit einer spektralen Eigenschaften ähnlich FITC und Transmembranpotential mit Tetramethylrhodamin Methylester (TMRM) würde eine brauchbare sekundäre Antikörper werden Allophycocyanin (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Hinzufügen Kompensationen steuert, dh eine Probe immun oder mit einem einzigen Fluorophor, falls gefärbt. </li><li> Übertragen auf eine für Lade Durchflusszytometer Rohr. (Zur Erleichterung der geringen Stichprobengröße, eine Mikrotiterplatte Rohr innerhalb 3 platziert ml Durchflusszytometer Rohr fließen.) Halten Proben auf Eis und gehen sofort aufDurchflusszytometer für Erwerb. </li></ol> 4. Assaying Mitochondriale Transmembranpotentials und der mitochondrialen Superoxid-Produktion mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Stellen Sie sicher, dass isolierte Mitochondrien haben eine intakte Transmembranpotential durch Färbung mit 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) 5, in Schritt 3.8, 15 min bei RT, vor Licht geschützt. Zum Vergleich der Transmembranpotential zwischen den Proben und Populationen, die Verwendung von niedrigeren / Nichtlöschkonzentrationen TMRM (1 bis 30 nM), kann es sinn 6 sein. <ol><li> Als Kontrolle für TMRM Färbung, Fleck isolierten Mitochondrien mit 100 nM TMRM in Gegenwart von 100 uM Carbonylcyanid m-Chlor Phenylhydrazin (CCCP), einem mitochondrialen Entkoppler, die Mitochondrien depolarisiert wird. Die Konzentration von CCCP erforderlich, um die Mitochondrien depolarisieren kann geringer sein, wenn niedrigere Konzentrationen von Farbstoff verwendet werden. </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, dass isolierte Mitochondrien produzieren mitochondrialen Superoxid von staining mit einem geeigneten mitochondrialen Superoxid-Indikator 7, auch in Schritt 3.8, 15 min bei RT, vor Licht geschützt. <ol><li> Als Kontrolle für mitochondrialen Superoxid-Produktion, Flecken isolierten Mitochondrien mit dem Farbstoff in Gegenwart von 10 uM Antimycin A, einem Inhibitor der Komplex III der mitochondrialen Atmungskette, die Superoxid-Produktion zu erhöhen wird. </li></ol></li></ol> 5. Aufnahme und Analyse von immun isolierten Mitochondrien durch Durchflusszytometrie <ol><li> Instrument geschaffen werden: Schalterspannungen von linear auf Protokollmodus auf die Analyse von isolierten Mitochondrien und stellen Spannungen zu erleichtern (FSC: 450; SSC: 250). Stellen Sie sicher, dass die Ereignisse in FSC-A (Bereich)-Modus als auch FSC-W (Breite) und FSC-H (Höhe) gesammelt, um Dubletten (dh auszuschließen, zwei Ereignisse, die durch den Detektor zur gleichen Zeit ) in der Analyse nach der Datenerhebung. Stellen Sie die Anzahl der Ereignisse, bis zu 100.000 gesammelt werden. Erwerben Entschädigung Kontrollen, Falls zutreffend. </li><li> Datenerfassung: Vor der Datenerfassung, zu vermeiden Vortexen Proben. Stattdessen mischen durch leichtes Antippen Röhre. Zunächst sammeln Ereignisse bei niedrigem Druck, während Gating. Tor an der Gesamtbevölkerung. Einzustellen Spannungen Histogramme entsprechend üblicherweise die Spitze der ungefärbten Probe in die zweite Dekade (10 2) entsprechen. Sobald Gates hergestellt und Proben verarbeitet werden, kann der Druck zu hoch geschaltet werden. </li><li> Analyse: Visualisieren Dubletten durch Auftragen von FSC-W gegenüber FSC. Slips und Dubletten zu identifizieren. Tor auf Slips. Wählen Sie das mitochondriale Bevölkerung durch Gating auf Ereignisse, die positiv mit einer mitochondrialen selektiven Farbstoff angefärbt werden. </li><li> Bestimmung von Hintergrund Kennzeichnung von Isotypenkontrolle. Verwendung der Isotyp-Kontrolle der Proben der Prozentanteil der Bevölkerung mitochondrialen Markierung positiv Mfn2 Antikörper. </li></ol>

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P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1.">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li><li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamin-related+protein+1,+a+mediator+of+mitochondrial+fission,+in+apoptosis.">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li><li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalh&#227;es, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant.">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li><li>Tantama, M., Martinez-Fran&#231;ois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio.">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es wird immer offensichtlicher, dass die Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle sowohl in der normalen Physiologie und Krankheit. Während Immunoblotting kann feststellen, welche Proteine ​​in Mitochondrien oder an der Oberfläche der Mitochondrien in einem bestimmten Zustand zu finden sind, diese Methode berichtet über dem Durchschnitt der Gesamtbevölkerung. Diese Methode kann nicht liefern Informationen zu relativen Häufigkeiten der mitochondrialen Subpopulationen oder Teilmengen. Während es zuvor angenomm...

Mitochondrien sind Organellen, die hochdynamische mehrere Runden von Spaltung und Kernfusion unterzogen werden, sind auf Seiten der hohen Energiebedarf transportiert und reagieren schnell auf Reize physiologischen 1. Da es zunehmend in verschiedenen Geweben erkannt, dass die Mitochondrien, auch unterschiedlichen zellulären Kompartimenten, haben unterschiedliche Funktionsprofile, neue Methoden benötigt werden, um diese verschiedenen mitochondrialen Untergruppen zu identifizieren. Mikroskopie liefert ein Mittel, wodurch einzelne Mitochondrien sichtbar gemacht werden und die Anwesenheit eines Proteins an oder in Mitochondrien kann durch Immunfluoreszenz-2 bestimmt werden. Quantitative Analyse nach diesem Verfahren ist jedoch arbeitsintensiv und eignet sich besser für Experimente mit immortalisierten Zelllinien oder primäre. Das Studium der einzelnen Mitochondrien aus Gewebe abgeleitet ist deutlich schwieriger und die meisten Methoden nicht für eine einfache Identifizierung der mitochondrialen Untergruppen gleichzeitig mit der Evalu ermöglichenation der mitochondrialen Funktion 3. Um diese Hürde, ein neues Verfahren zu Mitochondrien aus Nagetier Gewebe isoliert und anschließend mittels Durchflusszytometrie analysiert immunolabel Adresse entwickelt. Dies ermöglicht den schnellen Nachweis und die Quantifizierung von Proteinen an der äußeren Mitochondrienmembran, die einer Analyse durch Mikroskopie verglichen lokalisiert ist viel weniger arbeitsintensiv und erlaubt die Analyse von Tausenden von Mitochondrien in einer einzigen Probe. Dieser Test kann angewendet werden, um das Schicksal und die relative Menge der mitochondrialen Außenmembran-Proteine, die Gedanken zu sein konstitutiv an der Mitochondrien zu überwachen, die Rekrutierung von Proteinen an der Oberfläche der Mitochondrien oder die Detektion von Proteinen in die Mitochondrien in pathologischen Bedingungen mislocalized. Außerdem ist die Einarbeitung von herkömmlichen fluoreszierenden Indikatorfarbstoffen erlaubt die gleichzeitige Auswertung von bestimmten Aspekten der mitochondrialen Funktion in verschiedene mitochondrialeSubpopulationen.

<table><tbody><tr><td>Rats</td><td>Charles River</td><td>Strain code 400</td><td>Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.</td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>Kontes Glass Co.&amp;nbsp;</td><td>885450-0022</td><td>Duall 22</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall Legend Micro 17 R</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td>Transparent, thin walled&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Sorvall WX UltraSeries</td></tr><tr><td>AH-650 rotor and buckets&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-prep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114542</td><td>Iodixanol, density gradient medium</td></tr><tr><td>Fatty acid free Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8806</td><td>Must be fatty acid free for mitochondria</td></tr><tr><td>Sodium succinate dibasic hexahydrate&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9637</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Mitofusin2 antibody</td><td>Sigma</td><td>M6319</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research&amp;nbsp;</td><td>011-000-003</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4739-81</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9391</td><td>For sample acquisition by flow cytometry&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MitoTrackerGreen (MTG)</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm</td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td>5 &amp;micro;M: Ex 540 nm/Em 600 nm</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8874</td><td></td></tr><tr><td>LSR II flow cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>TreeStar Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>Software used for analysis</td></tr><tr><td>BCA protein assay kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Pierce/Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS</td></tr></tbody></table>

immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria

Methoden zur Erkennung und Überwachung der mitochondrialen Außenmembran Protein-Komponenten in tierischen Geweben sind entscheidend für mitochondriale Physiologie und Pathophysiologie zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, bei der Mitochondrien aus Gewebe isoliert werden Nagetier immun und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Mitochondrien werden von Nagetieren Rückenmark isoliert und zu einem schnellen Anreicherungsschritt unterzogen, Myelin, eine Hauptverunreinigung der mitochondrialen Fraktionen aus Nervengewebe vorbereitet zu entfernen. Isolierten Mitochondrien werden dann mit einem Antikörper, der Auswahl und einen fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper markiert. Analyse durch Durchflusszytometrie verifiziert die relative Reinheit der mitochondrialen Präparationen durch Anfärben mit einem Farbstoff spezifische mitochondriale, gefolgt von der Detektion und Quantifizierung von immunmarkierten Proteins. Diese Technik ist schnell, quantitativ und mit hohem Durchsatz, so dass für die Analyse von Hunderten von Tausenden von Mitochondrien pro Probe. Sie ist anwendbar auf Roman S. zu bewertenroteins auf mitochondrialer Oberfläche unter normalen physiologischen Bedingungen als auch die Proteine, die während der Pathologie mislocalized dieser Organellen werden kann. Wichtig ist, dass dieses Verfahren auf Fluoreszenzindikatorfarbstoffen gekoppelt werden, um für bestimmte Aktivitäten des mitochondrialen Subpopulationen melden und machbar für Mitochondrien aus dem zentralen Nervensystem (Gehirn und Rückenmark) sowie Leber.

Mitochondrien aus Rattenrückenmark abgeleitet ist, mit einem Antikörper zu Mitofusin2 (Mfn2), ein Protein in der Fusion der äußeren Membran der Mitochondrien 8 gebracht gezielt immun werden. Nach der Isolierung und Markierung mit einem Mfn2 spezifischen Antikörpers und eines fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper, Mitochondrien durch Durchflusszytometrie (Figur 1) verarbeitet. Nach der Datenerfassung werden die Proben mittels Durchflusszytometrie-Analyse-Software, indem Sie zue...

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Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Detektion und Quantifizierung der mitochondrialen Außenmembran-Proteine ​​durch Immunmarkierung von Mitochondrien aus Nagetiergewebe und Analyse durch Durchflusszytometrie Strom isoliert. Diese Methode kann erweitert werden, um funktionale Aspekte der mitochondrialen Subpopulationen zu bewerten.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Research

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Biology

15.5K Aufrufe.  Université de Montréal, CRCHUM.  Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Detektion und Quantifizierung der mitochondrialen Außenmembran-Proteine ​​durch Immunmarkierung von Mitochondrien aus Nagetiergewebe und Analyse durch Durchflusszytometrie Strom isoliert. Diese Methode kann erweitert werden, um funktionale Aspekte der mitochondrialen Subpopulationen zu bewerten. 

Serie: Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Forschung

Biochemie

Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Autor im Rampenlicht: Enthüllung mitochondrialer Kontaktstellen und architektonischer Einblicke 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Immunologie und Infektion

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Medizin

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Biologie

Application of Flow Cytometric Analysis for Measuring Multiple Mitochondrial Parameters in 3D Brain Organoids

Mitochondrial dysfunction is a common primary or secondary contributor to many types of neurodegeneration, and changes in mitochondrial mass, mitochondrial respiratory chain (MRC) complexes, and mitochondrial DNA (mtDNA) copy number often feature in these processes. Human brain organoids derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) recapitulate the brain&#39;s three-dimensional (3D) cytoarchitectural arrangement and offer the possibility to study disease mechanisms and screen new therapeutics in a complex human system. Here, we report a unique flow cytometry-based approach to measure multiple mitochondrial parameters in iPSC-derived cortical organoids. This report details a protocol for generating cortical brain organoids from iPSCs, single-cell dissociation of generated organoids, fixation, staining, and subsequent flow cytometric analysis to assess multiple mitochondrial parameters. Double staining with antibodies against the MRC complex subunit NADH: Ubiquinone Oxidoreductase Subunit B10 (NDUFB10) or mitochondrial transcription factor A (TFAM) together with voltage-dependent anion-selective channel 1 (VDAC 1) permits assessment of the amount of these proteins per mitochondrion. Since the quantity of TFAM corresponds to the amount of mtDNA, it provides an indirect estimation of the number of mtDNA copies per mitochondrial content. This entire procedure can be completed within a span of 2-3 h. Crucially, it allows for the concurrent quantification of multiple mitochondrial parameters, including both total and specific levels relative to the mitochondrial mass.

<meta charset="utf8"></head><body>Anwendung der durchflusszytometrischen Analyse zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in 3D-Hirnorganoiden

This protocol reports a unique method of using a streaming cytometer and multiple antibodies for simultaneous assessment of multiple mitochondrial functional parameters, including changes in mitochondrial volume, amounts of the mitochondrial respiratory chain (MRC) complex subunits, and mitochondrial DNA (mtDNA) replication.

Anwendung der durchflusszytometrischen Analyse zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in 3D-Hirnorganoiden

Mitochondrial dysfunction is a common primary or secondary contributor to many types of neurodegeneration, and changes in mitochondrial mass, ...

Neurowissenschaften

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Zusammenfassung

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Isolation und Atemwege Messungen der Mitochondrien von Arabidopsis thaliana

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Eine verbesserte Methode zur Isolierung mitochondrialer Kontaktstellen

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Anwendung der durchflusszytometrischen Analyse zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in 3D-Hirnorganoiden

Anwendung der durchflusszytometrischen Analyse zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in 3D-Hirnorganoiden

Empfindliche Messung des Mitophagy von Flow Cytometry Verwendung der pH-abhängigen fluoreszierende Reporter Mt-Otamegane