This work was supported by the US National Institutes of Health grants (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), a Leukemia &amp; Lymphoma Society scholar award (K.M.A.), and the National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Medical Scientist Training Program (Grant #T32GM007618) (M.M.).

פרוטוקול זה פועל לפי ההנחיות של UCSF לאתיקת מחקר אנושי. 1. הכנת תרבית תאי T, הבידוד של תאים מסוג CD4 + T, ואת קיטוב TH17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 0, צלחות תרבות מעיל רקמה 6-היטב עם 1.5 מ&quot;ל לכל טוב של CD3 אנטי אנושי (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התאים mononuclear דם טבורי (CBMCs) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות לפי הוראות היצרן. זהירות: עבוד בזהירות ולוודא ציוד מגן אישי מתאים (PPE) הוא משוחק בעת טיפול דם אנושי כדי למנוע כל סיכון של חשיפה לפתוגנים שמקורן בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאי mononuclear בודדו ורחץ, לבצע בידוד תא אנושי CD4 + T על ידי Sele גודל שליליction באמצעות ערכת תא מסחרית האנוש CD4 + T. הערה: אם יש זיהום תא דם אדום לאחר בידוד תא mononuclear, הגידול ימס כדוריות דם אדום אופציונאלי עשויות להתבצע לפני צעדי בידוד תא CD4 + T. Resuspend התאים mononuclear ב 1 מ&quot;ל של חיץ בידוד (2% FBS ב PBS). מוסיפים 5 מ&quot;ל של תמיסת lysing 1x. דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 5 מ&quot;ל של חיץ צנטריפוגות בידוד XG 300 5 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים mononuclear בצפיפות של 50 x 10 6 לכל 500 μL במאגר הבידוד בצינור 5 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של FBS ו 100 μL של מיקס נוגדן לכל צינור דגירה אז כל צינור בבית 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות על שייקר מסלולית לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להוסיף 3-4 מ&quot;ל של חיץ בידוד לשטוף את התאים. צנטריפוגה התאים XG 300 8 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. בזהירות לשאוב Supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ספין זו, טרום לשטוף את החרוזים המגנטיים. מעביר את הכמות הרצויה של חרוזים מגנטיים לתוך צינור חדש (בשימוש ב- 1: 1 עם התאים) ולהוסיף נפח שווה של חיץ בידוד כדי לשטוף את החרוזים. מערבבים היטב באמצעות micropipette מ&quot;ל 1 ולאחר מכן למקם את הצינורית שואבת דק 1 לפחות. בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend החרוזים המגנטיים בהיקף הזהה הועבר בתחילה לפני הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בצינור אחד עם 500 μL של חיץ בידוד ולהוסיף 500 μL של חרוזים מגנטיים מראש שטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם חרוזים מגנטיים עבור 15 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר (18 ° C עד 25 ° C) לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, ביסודיות pipet התאים באמצעות micropipette 1 מ&quot;ל לפחות 10 פעמים. ואז להוסיף 3-4 מיליליטר של חיץ בידוד ומקום כל צינורית השואבת 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את התאים באופן שלילי שנבחרו CD4 + T הנמצאיםאת supernatant לצינור חדש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר CD4 + T בידוד תא יושלם, לספור את התאים עם hemocytometer ולשמור תאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 1.5 מ&quot;ל של 2x תערובת של TH17-מקטב התקשורת היטב כל: אנטי-אנושי IFNγ (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל), אנטי אנושי IL-4 (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל), TGFβ אדם (10 ng / mL), אדם IL-1β (40 ng / mL), אדם IL-23 (40 ng / mL), IL-6 אדם (50 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל, 10 HEPES מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol). הערה: Transfection והפרעה RNA עושה עבודה בתקשורת סרום המכיל. מטרת השימוש בסרום ללא מדיה עם פרוטוקול זה היא להשיג ייצור IL-17A טוב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאי CD4 + T האנושיים XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת תאים. בזהירות לשאוב supernatנְמָלָה. ואז resuspend התאים בתקשורת בסיס סרום ללא צלחת התאים בצפיפות של 3 x 10 6 ב 1.5 מ&quot;ל לכל היטב כך נפח הסופי הוא 3 מ&quot;ל לכל טוב וציטוקינים מקטב כיום בריכוז סופי 1x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחות ב 5% 2 CO, 37 ° C חממה במשך יומיים. </li></ol></li></ol> 2. Electroporation של במבחנת תאי TH17 אנוש Polarized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, צלחות תרבות 48-היטב רקמות מעיל עם 250 μL לכל טוב של אנטי אנושי CD3 (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן RNA הקטן עבור transfection. במשך כל transfection, aliquot 1 μL של פתרון המניות 5 מיקרומטר של siRNA לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. כלול contr RNA קטן כימית בהתאמה המתאימהol. שמור את כל הצינורות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 500 μL של 1X TH17-מקטב התקשורת היטב כל: IFNγ האנטי-אנושית (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל), אנטי אנושי IL-4 (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל), אדם TGFβ (5 ng / mL), אדם אִי- 1β (20 ng / mL), אדם IL-23 (20 ng / mL), IL-6 אדם (25 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 U / מ&quot;ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל, 10 HEPES מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחות תרבות ריאגנטים transfection מוכנים, להשעות את התאים עם pipetting 1 מ&quot;ל micropipette, בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. פינת התאים לתוך צינור צנטריפוגות חרוטים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 °. הערה: עבור תקופות תרבות יותר מאשר פרוטוקול ארבעה ימים המוצגת כאן, התאים צריכים להיות טרנספקציה בערך כל 3 ימים באמצעות בפרוטוקול הזה. שלב 20.4 מן ראוי לשנות זאת מאז התאים שטופלו RNA הקטן שונה לא צריכים להיות ונקווה. כל התנאים הנבדקים יש לאסוף, נספר בנפרד טרנספקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים לפחות 1 מ&quot;ל של PBS לשטוף. ספירת תאי TH17 החיים (למשל עם hemocytometer באמצעות הרחקה הכחולה Trypan להעריך כדאיות) ולאחר מכן להעביר את התאים לצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים באמצעות חיץ resuspension סיפק מן ערכת מערכת transfection 10 μL בצפיפות של 2.5-4 x 10 7 תאים לכל מ&quot;ל. שמור תאים בטמפרטורת החדר. הערה: ככלל מנחה, ולנסות להכין רק כמו תאים רבים ככל שניתן טרנספקציה בתוך 30 דקות. ניתן להשוות קבוצות מרובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 9 μL של תאים 1 μL של RNA קטנים בכל microcצינור entrifuge. Pipet פעם לערבב את התאים RNA קטנים עבור transfection מכן לטעון לתוך קצה האלקטרודה פיפטה המסופקים. הערה: בדרך כלל, להוסיף 9.5 μL של ההשעיה התא כדי להבטיח שיש מספיק מהתערובת על מנת למנוע יצירת בועות קצה האלקטרודה pipet לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו קובט מסופק עם 3 מ&quot;ל של E. חוצץ אלקטרוליטי בטמפרטורת החדר מקום קובט בתוך תחנת פיפטה ואז למקם את פיפטה לתוך העמדה בתוך קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד electroporate כל תמהיל 10 μL של תאים ו- RNA הקטן באמצעות הפרמטרים הבאים: מתח דופק 1,500-1,550 V, רוחב דופק 10 ms, ו 3 פולסים הכוללים במכשיר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation יושלם, ישירות מוסיף את תערובת תא 500 μL של 1X TH17-מקטב תקשורת בארות מוכנות של צלחת תרבות. צלחות מקום בתוך CO 5% 2, 37 ° C חממה במשך יומיים נוספים. הערה: לשטוף את קצה האלקטרודה פיפטה ידי pipettingמעלה ומטה PBS בין כל transfection. </li></ol> 3. תאי קציר האנוש TH17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים התקשורת והתרבות עם micropipette, pipetting בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. הכן את התאים עבור מבחני ביטוי תפקודיים ו / או גן. הערה: שגרה, מספיק תאי ניב מבאר אחת של תאי TH17 טרנספקציה לשמש לניתוח הזרימה cytometric של סמן משטח גורם ציטוקינים ותמלול תאיים מכתים או להכנה של RNA עבור ניתוח ביטוי גנים. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Effector+CD4+T+Cell+Populations*.">Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*.</a> Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).</li><li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17+and+Th17+Cells.">IL-17 and Th17 Cells.</a> Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).</li><li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+IL-23-IL-17+immune+axis:+from+mechanisms+to+therapeutic+testing.">The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing.</a> Nature. 14 (9), 585-600 (2014).</li><li>Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+origin+of+human+Th17+cells.">Properties and origin of human Th17 cells.</a> Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).</li><li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells.">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).</li><li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells.">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li><li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-326+regulates+TH-17+differentiation+and+is+associated+with+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis.">MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).</li><li>Escobar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-155+Activates+Cytokine+Gene+Expression+in+Th17+Cells+by+Regulating+the+DNA-Binding+Protein+Jarid2+to+Relieve+Polycomb-Mediated+Repression.">miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression.</a> Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+Hif1a+expression+and+TH17+differentiation+by+the+hypoxia-regulated+microRNA+miR-210.">Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210.</a> Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Steiner, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-&amp;gamma;+Production+in+Helper+T+Cells.">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&amp;gamma; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).</li><li>Simpson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+upregulated+in+asthma+airway+T+cells+promotes+TH2+cytokine+production.">A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production.</a> Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).</li><li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production.">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li><li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Na&#239;ve+CD4++T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets.">Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins.">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מספק שיטה משופרת עבור המשלוח של RNA הקטן לתוך תאי TH17 אנושיים. למרות תאים אנושיים TH17 שימשו כאן, שיטה זו של electroporation עם RNA קטנים יכולים לשמש עם תת T מסייעים האנושי העיקרי אחרים, כגון Th1, Th2, ו Tregs. זה לא עבד היטב עבור תאים נאיביים CD4 + T כך התאים חייב להיות מופעל ...

תאי CD4 + T הם Orchestrators חיוני של התגובה החיסונית אדפטיבית. תאים נאיבי CD4 + T המסוגלים להתפתח לתאי T מפעיל שונים (למשל Th1, Th2, TH17, וכו &#39;), כל אחד עם סט משלו של ציטוקינים מאפיין גורמי שעתוק, תלוי במיקרו-סביבה מקומיים 1. החלטות השושלת תאי T להפוך הן קריטיות עבור שני החסינויות וסובלנות עצמיות. תאי TH17 הם תת-קבוצה אחת של תאי T הידועים להילחם חיידקים ופטריות תאיים, אבל התגובות הפסולות שלהם הן מעורבות גם בפתוגנזה של מחלות מרובות אוטואימוניות ודלקתיות כגון טרשת נפוצה ופסוריאזיס 2, 3. ניתן להפיק תאי TH17 אדם מתאי נאיבית CD4 + T במבחנה על ידי מתן אותם עם סביבת מקטב מתאימה 4. Vario<html> לנו שילובים של ציטוקינים IL-1β, IL-23, TGFβ, ו- IL-6 שימשו לפיתוח תאי TH17 האנושי. תאי האדם TH17 להביע CCR6, קולטן chemokine כי הוא נפוץ לזהות אוכלוסיית התא הזה ומוגדרים על ידי הביטוי של גורם השעתוק העיקרי שלהם, RORγt (המקודדים על ידי RORC) 5, 6. יש TH17 התאים את היכולת להביע ציטוקינים מרובים, אך IL-17A הוא ציטוקין מפעיל-המגדיר בשושלת מיוצר על ידי תאים אלה. בחנו את הביטוי של כל שלושת הסמנים הקשורים TH17 (CCR6, RORγt, IL-17A) כדי להעריך את החוסן של assay בידול במבחנה ב TH17 האנושי שלנו. בנוסף, אנו בתרבית תאים מסוג CD4 + T אנושיים בתנאים בלתי-מקטב, שבו אין ציטוקינים או נוגדנים חוסמים נוספו התקשורת והתרבות להשתמש כביקורת שלילית מאז הביטוי של סמנים TH17 אלה צריכים להיות מאוד נמוך או נעדר. ve_content &quot;&gt; דרך אחת ללמוד פיתוח T תא אנושי נורמלי ביולוגיה היא לתפעל ביטוי גנים במהלך ההתפתחות שלהם. קצר מפריעים RNA (siRNA) הם מולקולות רנ&quot;א קטנות כי למקד תעתיקי המקודדים חלבונים והוא יכול להיות מנוצל כדי להפחית ביטוי גנים ספציפיים . מיקרו RNA (miRNAs) הוא אנדוגניים ללא קידוד RNA הקטן הידוע לווסת ביטוי גנים לאחר תעתיק. miRNAs הוכח לשחק תפקיד חשוב הן בעכברי ביולוגיה של תא T אנושי, לרבות TH17 תא 7, 8, 9. זה חשוב לי שיטות אמינות של מניפולצית פעילות RNA קטנה תא T אנושי ללמוד והשפיע על ביטוי גנים, ובסופו של דבר על הביולוגיה של תאי T אנושי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול קל לשימוש, עקבי ואמין שפתחנו עבור החדרה RNAs סינטטי קטן וחומצות גרעין נעול (LNAs, שינוי כימי חומצות גרעין עם יציבות מוגברת)לתוך תאי מערכת חיסון, ובאופן ספציפי לתאי TH17 אנושיים. ישנן מספר שיטות חלופיות של החדרת RNA הקטן לתוך תאי יונקים, אשר בדרך כלל מתחלקים לקטגוריות כימיות, ביולוגיות, או פיסיות 10. בשימוש נפוץ שיטות כימיות, כולל transfections שומנים מבוססי transfections וסידן-פוספט, להסתמך על יצירת מתחמים הכימי-DNA, כי הם יותר נלקחים ביעילות על ידי תאים. באופן כללי, שיטות כימיות אינן יעילות כמו עבור transfection של תאי T העיקריים. השיטה הביולוגית הנפוצה ביותר היא להשתמש וקטור ויראלי (רטרו-וירוס למשל או lentivirus), אשר מוסיף RNA זרות ישירות לתוך שורה כחלק מחזור השכפול הטבעי שלה. תמרת ויראלי בדרך כלל לוקחת יותר זמן כדי להשלים, במיוחד כאשר אחד גורמים בזמן שיבוט מולקולרי של פלסמידים proviral. בנוסף, וקטורי תמרת ויראלי יכולים להיות מזיקים חוקרים אנושי. Electroporation הוא מ פיזיתethod של גרימת הקרום permeabilization ידי העמדה לתאים פולסי מתח גבוה, המאפשרת חומצות גרעין להיכנס לתוך התא זמני שבו הם יכולים לפעול על היעד שלהם. מכשירי electroporation מסורתיים היו לא יעילים עבור transfecting לימפוציטים העיקרי. עם זאת, electroporation הדור הבא אופטימיזציה הוכיח להיות מסוגל transfecting תאי T ביעילות גבוהה מאוד, במיוחד כאשר החומר להיות transfected הוא RNA הקטן. הדור הבא המונח משמש באופן רופף להבדיל שני הפלטפורמות החדשות יותר (למשל, הניאון, Amaxa) ממכונות electroporation מסורתיות. בנוסף, שיטה זו היא להרחבה בקלות עבור מסכי תפוקה מתונים עם עד כ 120 RNA הקטנים בניסוי אחד, לעתים קרובות באמצעות ריאגנטים סינטטיים תוקף. חשוב לציין, ניתן להשיג transfections מוצלח קטן כמו 16 שעות לאחר הפעלת תא T. החסרון של שיטה זו, לעומת זאת, הוא שזה לא לגרום incorporati גנומי יציבעל, ולכן הוא חולף. לפיכך, זה שווה את המאמץ הנוסף כדי ליצור מבנה ביטוי יציב שיכול להיות ארוז לתוך וקטור ויראלי והביע בהצלחה בתאי T במקרים בם ביטוי לטווח הארוך של RNA קטנה נדרש. השתמשנו transfection הדור הבא (למשל, ניאון) כדי לספק כלי RNA או LNA oligonucleotide יחידים או פעמים התקועות סינטטיים מגוונים למטרות שונות 11, 12, 13. התערבות RNA יעילה יכולה להיגרם עכבר עיקרי ותא T אנושי באמצעות RNA דו-גדילים קצרי מפריעים (siRNA). פרוטוקול זה מתאר מצבים מותאמים לשימוש בטכניקה זו בתאי TH17 אנושיים. בנוסף siRNAs, מחק מירנה סינטתית זמינה מסחרי מעכבים יכולים לשמש כדי ללמוד רווח מירנה ואובדן התפקוד. מחקה מירנה הן מולקולות RNA דו-גדילים דומות מאוד siRNAs, אבל designeד עם רצף של miRNAs בוגרת אנדוגניים. מעכבי מירנה הם כימית-modified RNA ו / או LNA מבוסס oligonucleotides תקועים אחד אשר נקלטות על ידי miRNAs יליד להרגיז את תפקידם. מצאנו כי כל הכלים האלה יכולים לשמש ביעילות לימפוציטים מסוג T העיקרי מתורבתים, לרבות אך לא רק תאי TH17 אנושיים.

<table><tbody><tr><td>anti-human IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&amp;nbsp;</td><td>Clone: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-human IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>Clone: 4S.B3</td></tr><tr><td>anti-human CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>Clone: SK3</td></tr><tr><td>mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>Clone: 11A9</td></tr><tr><td>anti-human RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>Clone: Q21-559</td></tr><tr><td>anti-human CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>Clone: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>For intracellular transcription factor flow cytometry staining</td></tr><tr><td>Hu FcR Binding Inhibitor Purified</td><td>ebioscience</td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>10981</td><td>&quot;Serum-Free Base Media&quot;</td></tr><tr><td>MACS CD28 pure functional grade, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>Clone: 15E8</td></tr><tr><td>anti-human CD3 Purified</td><td>UCSF monoclonal antibody core</td><td>N/A</td><td>Clone: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF purified anti-human IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>Clone: MP4-25D2</td></tr><tr><td>anti-human IFNg, functional grade purified</td><td>ebioscience</td><td>16-7318-85</td><td>Clone: NIB42</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-23</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-1&amp;beta;</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human TGF-&amp;beta;1</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human IL-6</td><td>Peprotech&amp;nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Control Pool, Non-targeting #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell Isolation Kit</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Next generation electroporation instrument</td></tr><tr><td>Neon Tranfection System 10 &amp;mu;L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Resuspension Buffer T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Provided in kit (MPK1096)</td><td>&quot;Transfection Resuspension Buffer&quot;</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>Density Gradient Medium</td></tr><tr><td>costar 6-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>costar 48-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>Must make 1x solution with distilled water prior to use</td></tr></tbody></table>

small rna transfection in primary human th17 cells by next generation electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

הצעד הראשון כדי לפתח מערכת אמינה של electroporating בהצלחת תאים אנושיים TH17 היה לייצר חזק בתרביות תאי TH17 אנושיות המובחן במבחנה. תאי T בתרבית בתנאים-מקטב TH17 הביע את הקולטן chemokine CCR6 ואת גורם שעתוק RORγt (איור 1A, שמאל). סמנים אלה לא באו לידי ביטוי ...

Watch this Scientific Journal Video about Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation at JoVE.com

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

small-rna-transfection-primary-human-th17-cells-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.8K Views.  University of California, San Francisco. Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Video: Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for silencing specific genes1-8 for functional genomics and therapeutics. A major challenge involved in RNAi based studies is the delivery of RNAi agents to targeted cells. Traditional non-viral delivery techniques, such as bulk electroporation and chemical transfection methods often lack the necessary spatial control over delivery and afford poor transfection efficiencies9-12. Recent advances in chemical transfection methods such as cationic lipids, cationic polymers and nanoparticles have resulted in highly enhanced transfection efficiencies13. However, these techniques still fail to offer precise spatial control over delivery that can immensely benefit miniaturized high-throughput technologies, single cell studies and investigation of cell-cell interactions. 
Recent technological advances in gene delivery have enabled high-throughput transfection of adherent cells14-23, a majority of which use microscale electroporation. Microscale electroporation offers precise spatio-temporal control over delivery (up to single cells) and has been shown to achieve high efficiencies19, 24-26. Additionally, electroporation based approaches do not require a prolonged period of incubation (typically 4 hours) with siRNA and DNA complexes as necessary in chemical based transfection methods and lead to direct entry of naked siRNA and DNA molecules into the cell cytoplasm. As a consequence gene expression can be achieved as early as six hours after transfection27. Our lab has previously demonstrated the use of microelectrode arrays (MEA) for site-specific transfection in adherent mammalian cell cultures17-19. In the MEA based approach, delivery of genetic payload is achieved via localized micro-scale electroporation of cells. An application of electric pulse to selected electrodes generates local electric field that leads to electroporation of cells present in the region of the stimulated electrodes. The independent control of the micro-electrodes provides spatial and temporal control over transfection and also enables multiple transfection based experiments to be performed on the same culture increasing the experimental throughput and reducing culture-to-culture variability. 
Here we describe the experimental setup and the protocol for targeted transfection of adherent HeLa cells with a fluorescently tagged scrambled sequence siRNA using electroporation. The same protocol can also be used for transfection of plasmid vectors. Additionally, the protocol described here can be easily extended to a variety of mammalian cell lines with minor modifications. Commercial availability of MEAs with both pre-defined and custom electrode patterns make this technique accessible to most research labs with basic cell culture equipment.

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays MEA

The article details the protocol for site-specific transfection of scrambled sequence of siRNA in an adherent mammalian cell culture using a microelectrode array (MEA).

יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)

The discovery of RNAi pathway in eukaryotes and the subsequent development of RNAi agents, such as siRNA and shRNA, have achieved a potent method for ...

Bioengineering

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biology

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately understood, thus impeding the establishment of defined treatments. Cell-based additive gene therapies for the increased expression of a protective factor are considered as a promising option to medicate neurodegenerative diseases, such as age-related macular degeneration (AMD). We have developed a method for the stable expression of the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF), which is characterized as a neuroprotective and anti-angiogenic protein in the nervous system, into the genome of primary human pigment epithelial (PE) cells using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Primary PE cells were isolated from human donor eyes and maintained in culture. After reaching confluence, 1 x 104 cells were suspended in 11 &#181;L of resuspension buffer and combined with 2 &#181;L of a purified solution containing 30 ng of hyperactive SB (SB100X) transposase plasmid and 470 ng of PEDF transposon plasmid. Genetic modification was carried out with a capillary electroporation system using the following parameters: two pulses with a voltage of 1,100 V and a width of 20 ms. Transfected cells were transferred into culture plates containing medium supplemented with fetal bovine serum; antibiotics and antimycotics were added with the first medium exchange. Successful transfection was demonstrated in independently performed experiments. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) showed the increased expression of the PEDF transgene. PEDF secretion was significantly elevated and remained stable, as evaluated by immunoblotting, and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-mediated transfer allowed for a stable PEDF gene integration into the genome of PE cells and ensured the continuous secretion of PEDF, which is critical for the development of a cell-based gene addition therapy to treat AMD or other retinal degenerative diseases. Moreover, analysis of the integration profile of the PEDF transposon into human PE cells indicated an almost random genomic distribution.

We have developed a protocol to transfect primary human pigment epithelial cells by electroporation with the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF) using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Successful transfection was demonstrated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR), immunoblotting, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

Medicine

<meta charset="utf8"></head><body>התמיינות תאי Th17 מתאי T נאיביים CD4+ באמצעות ציטומטריית זרימה

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: השגת התמיינות במבחנה ברמת טוהר גבוהה של תאי Th17 באמצעות אפנון ריכוז ציטוקינים

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4+ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

<meta charset="utf8"></head><body>טרנסדוקציה רטרו-ויראלית של RNA מנחה לעריכת גנים בהתמיינות Th17

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells can be stimulated with antigens and well-defined cytokine cocktails in vitro to mimic Th17 cell differentiation in vivo. Research has been conducted extensively on the Th17 differentiation regulation mechanisms using the in vitro Th17 polarization assay.
Conventional Th17 polarization methods typically involve obtaining na&#239;ve CD4 T cells from genetically modified mice to study the effects of specific genes on Th17 differentiation and function. These methods can be time-consuming and costly and may be influenced by cell-extrinsic factors from the knockout animals. Thus, a protocol using retroviral transduction of guide RNA to introduce gene knockout in CRISPR/Cas9 knockin primary mouse T cells serves as a very useful alternative approach. This paper presents a protocol to differentiate na&#239;ve primary T cells into Th17 cells following retroviral-mediated gene targeting, as well as the subsequent flow cytometry analysis methods for assaying infection and differentiation efficiency.

<meta charset="utf8"></head><body>מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

We present a protocol for retroviral transduction of guide RNA into primary T cells from Cas9 transgenic mice, providing an efficient alternative for gene editing in studying Th17 differentiation.

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

יעילות גבוהה Transfection, אתר ספציפי של תאים חסידים עם siRNA שימוש במערכי microelectrode (MEA)

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

דור של תאים מעלף העיקרי ומורחבת NK האנושי באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins

שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת

התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4⁺ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר

התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4⁺ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר

התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4⁺ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה