The authors would like to acknowledge the Netherlands Organization for Scientific Research (NWO, grant 17.106.329)

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן (LUMC). 1. הכנת תאים, מכשירים ועכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני המבצע, לגלח את NOD גמא SCID העכברים / (NSG) מהפטמה הרביעית לקו האמצע ולשקול את העכברים כדי לוודא שיש את כל העכברים משקולות שווים בקירוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי מספריים, שתי פינצטה ושני מלקחיים ישר יתוש (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הפעולה, לשטוף את אדנוקרצינומה השד האנושית (מד&quot;א MB-231) תאים שניתן להזריק פעם אחת עם ופר פוספט (PBS), pH 7.4 וtrypsinize התאים. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 10 מיליליטר תקשורת DMEM סרום המכיל בחלק העליון של התאים. צנטריפוגה התאים ב1,200 סל&quot;ד 7 דקות ב RT להסיר סרום על ידי resuspending התאים או בPBS או באמצעי תקשורת ללא סרום. צנטריפוגה אותם שוב כדי להסיר עקבות של סרום לחלוטין. Resuspend תאי PBS אותקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים עם hemocytometer ולחשב את כמות התאים. השתמש 500,000 תאים / עכבר בלא יותר מ -150 μl. אופציונאלי לPBS או תקשורת, resuspend תאי matrigel. הערה: קבע את כמות התאים בהתאם לסוג התא בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום תאים בצינורות microcentrifuge סטרילי ולשמור אותם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את אחד 50 מיליליטר צינור צנטריפוגות חרוטי עם 35 מיליליטר של pH 7.4 PBS וצינור נוסף 50 מ&quot;ל חרוטי צנטריפוגות עם אתנול 70%. משרים צמר גפן לתוך צינור אחד. </li></ol> 2. הזרקה Orthotopic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הניתוח בשכונת סטרילי כדי לשמור על אווירה סטרילית. להרדים את העכבר על ידי תת עורי הזרקת תערובת Xylazin / קטמין במינון של 10 מ&quot;ג / קילוגרם, 100 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף בהתאמה. תקן את העכבר על כרית חימום. לאשר את ההצלחה של הרדמה על ידי חוסר התגובה לקמצוץ הבוהן. הערה: אם אחד הוא לא מכיר היטב את ההליכים כירורגיים, ניתוח עשוי להימשך זמן רב יותר. לארגןההרדמה במינון בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה עיניים על העיניים של עכברים, כדי למנוע את העיניים מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את האזור המגולח באמצעות מקלון צמר גפן טבול אתנול מוכן בשלב 1.6. לסירוגין סקראבס באמצעות בטאדין ואלכוהול שלוש פעמים בצורה מעגלית מסתובבת ממקום החתך המתוכנן צריכה להתבצע. לחלופין, להשתמש ionophore כחומר חיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בין הפטמה הרביעית וקו האמצע עם מספריים ולעשות כיס על ידי החדרה מקלון צמר גפן טבולה בpH 7.4 PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפינצטה כדי לחשוף את כרית שומן החלב. שים לב לכרית השומן על ידי הצבע הלבן שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסחוט את כרית השומן עם פינצטה האחרות מבסיסו; בדרך זו, לחשוף באופן מלא את כרית השומן (איור 1) כדי לבצע זריקות בקלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize תערובת התא על ידי pipetting למעלה ולמטה. לשאוב בעדינות 50 μl של השעיה תא לתוך מזרק אינסולין להזריק לכרית שומן החלב על ידי החזקת המחט אופקית. לאשר זריקה מוצלחת על ידי בדיקה לנפיחות של כרית השומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את כרית השומן בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את החתך באמצעות נהג מחט. הפוך שלושה זורק על ידי סיבוב התפר סביב נהג המחט בכיוון השעון, נגד כיוון השעון וכיוון השעון. יש להשתמש בשני קשרים לתפר. הערה: ודא שהקשרים הדוקים אחרת עכברים יכולים לפתוח את התפרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניתוח, להזריק משכך כאבים, כגון temgesic ב0.05-0.1 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף, מתחת לעור כדי להקל על הכאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תשאיר את בעלי החיים ללא השגחה עד שהם מרוויחים את ההכרה ולשמור על recumbence sternal. מניחים את כל החיות לכלובים שונים עד שהם התאוששו באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על סטריליות, להשתמש כלובים ומים autoclaved. לשנות את הכלובים כל שלושה ימים כדי לשמור על האווירה נקייה. </li></ol> 3. קצירת איברים לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של קציר, 8 שבועות לאחר ההשתלה של התאים, למלא צינורות צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר עם 3 מיליליטר הפתרון של Bouin לכל עכבר. בנוסף, משתמש בשני 15 מיליליטר צינורות מלאים ב5 מיליליטר פתרון פורמלין לכל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את בעלי החיים על ידי הזרקת Xylazin / קטמין, במינון של 10 מ&quot;ג / קילוגרם 100 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף מתחת לעור. חכה עד שהחיה מאבדת את רפלקס נסיגת קמצוץ הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את החיה עם מחטים על בסיס. ביצוע חתך ארוך, אנכי קו האמצע עם מספריים. לעשות שני חתכים אופקיים ממש מתחת לרגל הקדמית ומעל הרגל האחורית. לחשוף את הגידול על ידי מצמיד העור לבסיס. למדוד באמצעות קליפר נפח הגידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הגידול מהעור באמצעות מספריים. Snap להקפיא חלק מהגידול בחנקן נוזלי לבידוד RNA. מניחים את החלק השני, לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי מלאים בפורמלין לבצע אימונוהיסטוכימיה הבאה הטבעת פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בעדינות את הריאות. הנח אתעזב את הריאות לפתרון של Bouin. שמור את הריאות בפתרון במשך 3 ימים. שימו לב מוקדים גרורתי שטחיים באופן ברור לעין בלתי מזוינת. לחלופין, למקם את הריאה הימנית לתוך פורמלין כדי לוודא micrometastasis באמצעות haematoxylin וeosin מכתים (H &amp; E). הערה: למרות ש, גרורות ריאות נצפו לעתים קרובות בסרטן השד, אפשר גם רוצה לאסוף עצם, כבד, מוח וטחול לנתח גרורות. התאים באזור גרורתי הם צפופים יותר ושונים מורפולוגית ולכן ניתן להבחין בקלות מרקמת ריאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לאחר קציר, לשאוב את פתרון פורמלין מ -15 מיליליטר צינורות ולהחליף עם 70% אתנול. להטביע רקמות פרפין ולבצע מחקרי אימונוהיסטוכימיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקת דם, לפתוח את חלל החזה עם מספריים. למשוך 450 דם μl באמצעות לנקב לב. מניחים דגימת דם בצינור microcentrifuge המכיל 50 μl של 3.2% נתרן ציטרט. אחרי הדם נאסף, לסובב אותו XG ב 2000 עבור 10 מייליםn. אחסן את דגימות הפלזמה ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. הערה: קיימות מספר טכניקות איסוף דם אחרות נפוצה בתרגול 20 והטכניקה שצריכה להיות בשימוש תלויה בהגדרת ניסוי ובחירתו של המדען. אם דגימת דם אינה נדרשת, להרדימו על פי הפרוטוקול של בעלי החיים או על פי הנחיות המוסד. </li></ol>

<ol>
	<li>Aaronson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factors+and+cancer.">Growth factors and cancer.</a> Science. 254 (5035), 1146-1153 (1991).</li><li>Bao, L., Matsumura, Y., Baban, D., Sun, Y., Tarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+inoculation+site+and+Matrigel+on+growth+and+metastasis+of+human+breast+cancer+cells.">Effects of inoculation site and Matrigel on growth and metastasis of human breast cancer cells.</a> Br. J. Cancer. 70 (2), 228-232 (1994).</li><li>Brouxhon, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibody+against+the+ectodomain+of+E-cadherin+(DECMA-1)+suppresses+breast+carcinogenesis:+involvement+of+the+HER/PI3K/Akt/mTOR+and+IAP+pathways.">Monoclonal antibody against the ectodomain of E-cadherin (DECMA-1) suppresses breast carcinogenesis: involvement of the HER/PI3K/Akt/mTOR and IAP pathways.</a> Clin. Cancer Res. 19 (12), 3234-3246 (2013).</li><li>Dobie, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variegated+transgene+expression+in+mouse+mammary+gland+is+determined+by+the+transgene+integration+locus.">Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by the transgene integration locus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (13), 6659-6664 (1996).</li><li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma.">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).</li><li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+implantation+is+essential+for+the+selection,+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice+[corrected.">Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected.</a> Cancer Metastasis Rev. 9 (2), 149-165 (1990).</li><li>Fridman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+tumor+growth+of+both+primary+and+established+human+and+murine+tumor+cells+in+athymic+mice+after+coinjection+with+Matrigel.">Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel.</a> J. Natl. Cancer Inst. 83 (11), 769-774 (1991).</li><li>Fynan, T. M., Reiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+inhibition+of+cell+growth+by+transforming+growth+factor-beta+and+its+role+in+oncogenesis.">Resistance to inhibition of cell growth by transforming growth factor-beta and its role in oncogenesis.</a> Crit Rev. Oncog. 4 (5), 493-540 (1993).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17, 36 (2010).</li><li>Iorns, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mouse+model+for+the+study+of+human+breast+cancer+metastasis.">A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis.</a> PLoS. One. 7 (10), e47995 (2012).</li><li>Jessani, N., Niessen, S., Mueller, B. M., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+grown+in+vivo:+what+goes+in+isn't+always+the+same+as+what+comes+out.">Breast cancer cell lines grown in vivo: what goes in isn't always the same as what comes out.</a> Cell Cycle. 4 (2), 253-255 (2005).</li><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li><li>Kocaturk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatively+spliced+tissue+factor+promotes+breast+cancer+growth+in+a+beta1+integrin-dependent+manner.">Alternatively spliced tissue factor promotes breast cancer growth in a beta1 integrin-dependent manner.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 11517-11522 (2013).</li><li>Lowe, S. W., Lin, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+cancer.">Apoptosis in cancer.</a> Carcinogenesis. 21 (3), 485-495 (2000).</li><li>Meek, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p53+response+to+DNA+damage.">The p53 response to DNA damage.</a> DNA Repair (Amst). 3 (8-9), 1049-1056 (2004).</li><li>Meek, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppression+by+p53:+a+role+for+the+DNA+damage+response).">Tumor suppression by p53: a role for the DNA damage response).</a> Nat. Rev. Cancer. 9 (10), 714-723 (2009).</li><li>Miller, F. R., Medina, D., Heppner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+growth+of+mammary+tumors+in+intact+mammary+fatpads.">Preferential growth of mammary tumors in intact mammary fatpads.</a> Cancer Res. 41 (10), 3863-3867 (1981).</li><li>Mueller, B. M., Ruf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+binding+of+catalytically+active+factor+VIIa+in+tissue+factor-dependent+experimental+metastasis.">Requirement for binding of catalytically active factor VIIa in tissue factor-dependent experimental metastasis.</a> J. Clin. Invest. 101 (7), 1372-1378 (1998).</li><li>Paoli, P., Giannoni, E., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoikis+molecular+pathways+and+its+role+in+cancer+progression.">Anoikis molecular pathways and its role in cancer progression.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1833 (12), 3481-3498 (2013).</li><li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals.">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> J. Pharmacol. Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).</li><li>Shay, J. W., Zou, Y., Hiyama, E., Qright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+and+cancer.">Telomerase and cancer.</a> Hum. Mol. Genet.. 10 (7), 677-685 (2001).</li><li>Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+war+on+cancer.">The war on cancer.</a> Lancet. 347 (9012), 1377-1381 (1996).</li><li>Tao, K., Fang, M., Alroy, J., Sahagian, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imagable+4T1+model+for+the+study+of+late+stage+breast+cancer.">Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer.</a> BMC. Cancer. 8, 228 (2008).</li><li>Versteeg, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protease-activated+receptor+(PAR)+2,+but+not+PAR1,+signaling+promotes+the+development+of+mammary+adenocarcinoma+in+polyoma+middle+T+mice.">Protease-activated receptor (PAR) 2, but not PAR1, signaling promotes the development of mammary adenocarcinoma in polyoma middle T mice.</a> Cancer Res. 68 (17), 7219-7227 (2008).</li><li>Versteeg, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tissue+factor+signaling+suppresses+tumor+growth.">Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth.</a> Blood. 111 (1), 190-199 (2008).</li><li>Wagner, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+breast+cancer:+quo+vadis,+animal+modeling?.">Models of breast cancer: quo vadis, animal modeling?.</a> Breast Cancer Res. 6 (1), 31-38 (2004).</li><li>Weigelt, B., Peterse, J. L., van't Veer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+metastasis:+markers+and+models.">Breast cancer metastasis: markers and models.</a> Nat. Rev. Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד היא מודל רב עוצמה כדי לחקור את כל ההיבטים של צמיחת הסרטן. השתלה של תאים אלה בכרית שומן החלב של העכברים צריכה להתבצע בזהירות על מנת למנוע שינוי בצמיחת גידול. והכי חשוב, הזרקה את אותה הכמות של תאים לכל עכבר היא קריטית. לשם כך, יש trypsinize התאים בקפדנות, מבלי להשפיע על כדאיות של התאים. תאים שאינם בר-קיימא צריכים להתעלם בספירת התאים וחומרים הכימיים (כלומר הכחול trypan) שיכול לעזור להבחין בין תאים מתים ובת-קיימא עשוי להיות שימושי לקביעת מספר תאי קיימא. היווצרות של גושים של תאים יש להימנע על ידי pipetting התאים למעלה ולמטה כמו היווצרות של גושי תאים לגרום לבעיות במהלך ספירת תאים וגורמת לחישוב מוטעה של מספר התא. היבט חשוב נוסף שיש לקחת בחשבון הוא את עוצמת הקול של התאים עצמם. כפי שתואר בסעיף פרוטוקול, התאשלהם pelleted כדי להשעות אותם בPBS או תקשורת. לפני הוספת PBS או תקשורת, את עוצמת הקול של התאים עשוי להיות מוערך על ידי השוואה גלולה עם צינורות מלאים בכרכים שונים של מדיה. כתוצאה מכך נפח התא עשוי להיות מופחתים נועד נפח התקשורת, על פי הנוסחא הבאה: נפח התקשורת שצריך נפח שיתווסף = מחושב - נפח תא ריאגנטים המשמשים בפרוטוקול עשוי להשפיע על התוצאות של הניסוי; לכן הפרוטוקול צריך להיות בהתאם בהתאם לשאלת המחקר. לדוגמא, אם הניסוי שמטרתו להבהיר את התפקיד של חלבון קרום בהתקדמות גידול, trypsinization עלול לגרום לעיכול של חלבוני הקרום ולגרום לחפצים 9. אם זה דאגה, באמצעות פתרון EDTA שנאגרו או מגרד את התאים מהווה חלופה לנתק את התאים. כפי שצוין לעיל, תאים עשויים להיות מושעים בתקשורת, PBS או matrigel foהזרקת r. בין אלה, matrigel הוא אפשרות נוחה כmatrigel polymerizes בכרית השומן, ובכך לצמצם תאים דולפים החוצה של fatpad. בנוסף, engraftment בנוכחות matrigel עשויה לשפר את צמיחת גידול ואת הפוטנציאל גרורתי של שורות תאים מסוימות, כגון שורת תאי סרטן שד תאי מד&quot;א-MB-435 2, A253 קרצינומה submandibular האנושית, קרצינומה epidermoid אדם Kb וB16F10 מלנומה בעכבר 7. שים לב שחלק מהכנות matrigel מכילים גורמי גדילה שעלולה להשפיע על תוצאות הניסוי. עם זאת, matrigel מדולדל גורם הגדילה זמין מהספקים שונים. בנוסף, matrigel פועל כתאי מטריקס (ECM) ומפעיל תת integrin. לכן, אם שאלת המחקר כרוכה בתפקיד של פונקצית integrin בצמיחת גידול, יש להשתמש באמצעי תקשורת או PBS כנשא לתאי סרטן השד. בהגדרת הניסוי שלנו, אנו מזריקים תאי שד אנושי סרטן (מד&quot;א MB-231) לכרית שומן החלב של עכברי NSG. השימוש בעכברי immunodeficient ללא ספק עושה את זה קשה יותר ללמוד את מעורבותם של גני immunoregulatory בהתפתחות הסרטן. עם זאת, חשוב לשים לב כי טכניקה זו יכולה לשמש גם בעכברים עם מערכת חיסונית שלמה אם יש לי התאים שצריך להיות מוזרקים מוצא עכבר 23. בנוסף, שורת תאי מד&quot;א MB-231 היא שלילי קולטן אסטרוגן (ER-) ולכן, ההשפעה של הורמונים בהתפתחות סרטן השד חסרה. ובכל זאת, העבודה הקודמת שלנו הראתה שטכניקה זו היא גם ריאלי עבור ER + תאי סרטן השד כגון MCF-7 13. ניירות ניצול שיטה זו כדי ללמוד את צמיחת גידול של שורות תאי סרטן השד נפוצות מפורטים להלן: ההליך עצמו מכיל כמה שלבים קריטיים גם כן. בניגוד לזריקות תת עורית, זריקות orthotopic כרוכות הליכים כירורגיים בעכברים. לפיכך, יש לנקות כלים כירורגיים היטב וautoclaved. ראוי לציין, השתלה של תאים אנושיים ברפידות שומן החלב דורשת השימוש בעכברי immunodeficient (למשל, NOD / SCID). לכן רצוי להתבצע זריקות בארון בטיחות ביולוגית, שימוש בכלים סטריליים. יתר על כן, במהלך ההזרקה, המחט צריכה להיות כל הזמן בזווית הנכונה עם פתיחת המחט תפנה כלפי מעלה. מחזיק את המחט בתנוחה זו מפחיתה את הדליפה ובאופן זה זריקה מוצלחת יכולה להיות מאומת על ידי התבוננות הנפיחות של כרית שומן החלב. בנוסף, בעת ביצוע ניתוח, חשוב לעשות חתך במרחק מה מכרית שומן החלב כדי למנוע הפרעה של תהליך ריפוי הפצע עם צמיחת גידול. עם זאת, החתך לא צריך להיעשות רחוק מדי מכרית שומן החלב או, כפי שחושף את כרית שומן החלב עלול להיות קשה. בהמשך להליך, יש לבדוק את החיות באופן קבוע. עקב הניתוח והחשיפה לחומר ההרדמה, עכברים עלולים להיתקל אי נוחות משמעותית או אפילולמות. כך, בשבוע שלאחר ההליך הראשון הוא קריטי ועכברים צריכים להיות במעקב צמוד. בהתאם לקצב הצמיחה של התאים המושתלים, נפח גידול ניתן למדוד עד 4 פעמים בשבוע. יכולים גם להיות מתויגים תאים המוזרקים עם חלבון או לוציפראז ניאון, המאפשרים מעקב של תאי גידול ראשוניים וגרורתי, באמצעות מצלמה רגישה לאור. אף פעם לא צריכים להיות מותר גידולים להגיע גדלים גדולים מאוד ככיבים עלולים להתרחש נזק שרקמת הגידול. זה עשוי להקשות על ניתוחי immunohistochemical תקינים של רקמת הגידול. לאחר הגידול שנקטפו, אפשר לשקול קוצץ את הגידול וculturing תאי גידול המפוזרים ליצור שורת תאי סרטן השד חדשה לחקור הבדלים בין ההורים וmammay קווי כרית שומן עברו תא (MFP) 11. לסיכום, השתלת סרטן שד orthotopic שתוארו במאמר זה הוא כלי שימושי מאוד כדי לחקור את התהליכים הקשורים בסרטן. ca אחדn לתפעל את הגנום של התאים המוזרקים על ידי אחד upregulating או downregulating הגן של עניין ולבדוק את השפעתו על גידול ראשוני צמיחה, אנגיוגנזה או גרורות. גישה זו היא מועילה ללמוד פרוטו-אונקוגנים, supressors גידול או גנים שמעורבים בEMT. בנוסף, ניתן להזריק שורות תאים לעכברים מהונדסים גנטי כדי לבחון את ההשפעה של תא סטרומה בהתקדמות הסרטן. אנו ממליצים על השימוש בטכניקת הזרקת orthotopic על מודלים סרטן השד האמורים בשל הסיכום שלה הגבוה של תהליך pathophysiological.

הסרטן הוא מחלה מורכבת מאוד שהייתה הנתונה ללימודים במשך מאות שנים. סרטן השד הוא סוג הסרטן הנפוץ ביותר; היא מתרחשת בעיקר אצל נשים, אך עשויים להתרחש גם באופן ספורדי בזכרים 27. המחלה בעיקר נגרמת על ידי האובדן של חלוקת תא שלטון מנגנון בקרה אשר בתורו מוביל לצמיחה אינסופית של תאים בגוף. יכולות להיגרם תקלות אלה על ידי מספר מנגנונים: ראשון, תאים בריאים צריכים אותות צמיחה מהתאים המקיפים על מנת להתרבות ואילו תאים סרטניים לעשות גורמי הגדילה שלהם ולהגדיל את הביטוי של קולטנים גורם גדילה וכך להשיג שיעור גבוה יותר שגשוג 1; שני, תאי הסרטן הם פחות רגישים לאותות אנטי-שגשוג 8; שלישי, כדי לאזן את המספר הסלולרי במוות של תאי גוף גם נדרש; עם זאת, תאים סרטניים להימלט ממוות מתוכנת של תאים, המכונים אפופטוזיס 14; רביעי, תאים לדבוק מטריצות תאיעל מנת לשרוד, אך תאים סרטניים יכולים לגדול ללא הצורך בהתקשרות ולהראות התנגדות לanoikis 19; חמישי, הפעלה של הטלומרז עוקפת את ההתקצרות הטלומרים ומונעת הזדקנות replicative 21; ואחרון אחרון חביב, דילוג של בקרת איכות DNA בעקבות תוצאות מיטוזה בתוכן גנטי שינה 15,16. על מנת לזהות אונקוגנים או מדכאי גידול שמשחקים תפקיד בהתפשטות הבלתי מווסתת זה, ניסויי צמיחת גידולים בעכברים הם קריטיים. צמיחת גידול ראשונית היא בדרך כלל לא הסיבה העיקרית למוות. הגירה של תאים סרטניים מהאתר הראשי לאתר המשני, המכונה גרורות, הוא הגורם המוביל למוות ברוב חולי סרטן 22. גרורות הכרוכות פלישת תאים סרטנית, intravasation, נסיעה דרך מחזור הדם, הימנעות התקפה חיסונית, extravasation וצמיחה באתר המשני. אפיתל מעבר mesenchymal (EMT) הוא תהליך מפתח בגרורות וכרוכות מתג בפרופילי ביטוי גני מניב תאים עם תנועתיות והפולשנות גבוהות יותר, שהם דרישות קדם לתא הגרורות 12. ככל שהתהליך הסרטני היא התוצאה של שילוב של פעולות שונות, כוללים אינטראקציות הדדיות בין תאים סרטניים, תאי סטרומה ותאים פרו ואנטי דלקתיים, גישה במבחנה לסרטן לעתים קרובות אינה מספקת הבנה מלאה של התהליך הסרטני. בדומה לכך, לעתים קרובות יכולים להיות לא למדו טיפולים נגד הסרטן משפיעים על כלי הדם של גידול במבחנה, ובכך השימוש בin vivo הגישות הוא בלתי נמנע. ללמוד התקדמות סרטן השד, שיטות ניסיוניות שונות פותחו. המודל הנפוץ ביותר הוא ההזרקה תת עורית של תאי סרטן השד בעכברים 5. בהגדרת ניסוי זה, החוקר יכול להציג מגוון רחב של שינויים בקו תא של בחירה במבחנה (כלומרupregulation, downregulation של חלבונים) ולהזריק את התאים מתחת לעור. למרות ששיטה זו היא פשוטה ותהליך ההזרקה הוא פשוט ללא כל צורך בביצוע ניתוח בעכברים, האתר שבו הגידול מוזרק אינו מייצג את הסביבה המקומית החלב גידול והיעדר הסביבה זו עלולה לגרום להתפתחות סרטן שד ש שונה מזה שנצפה בהפתולוגיה אנושית. שנית, עכברים מהונדסים גנטי נמצאים בשימוש לעתים קרובות ככלי in vivo ללמוד התקדמות סרטן השד. במודל זה, ביטוי אונקוגן (כלומר PyMT, Neu) הוא מונע על ידי אמרגן רקמות ספציפי החלב מוביל להיווצרות של של גידול בשד ספונטני. התקנה ניסיונית זו שימושית כדי ללמוד את היבט טיפול במחלה על ידי הזרקת סמים או נוגדנים בעת בדיקת גודל גידול בזמן 3. עם זאת, גידול עכברים אלה עם זני עכבר אחרים חסרים או מוטציה בגן של עניין גם יכול לתת תוספותights לתוך התפקיד של חלבונים שונים בצמיחה של גידולי סרטן שד 24. החסרון של המודל הזה הוא שהוא נוטה וריאציה בגודל הגידול ומספר. יתר על כן, את רמת ביטוי transgene תלויה באתר האינטגרציה בגנום ויכולה להשתנות מזן עכבר אחד לעוד 4. במודל זה, הביטוי של transgene יכול להיות מושגת על ידי כל התאים אפיתל עם מקור ואילו במחלות של בני אדם, רק תת-אוכלוסייה של תאים לבטא אונקוגן או downregulate הרמות המדכאים גידול 26. ללמוד גרורות, תאי סרטן השד יכולים גם להיות מוזרקים לוריד (מודל מכונה גרורות ניסיוני) 25. עם זאת, גישה זו משחזרת רק את התהליך גרורתי באופן חלקי; עוקף את הדרישה לתאים סרטניים לפלוש וintravasate, ומתחיל מהנקודה שבה תאי גידול הם בקלות הווה במחזור הדם. בעבודה שלנו, אנו משתמשים להזריק orthotopicמודל היון ללמוד את מעורבותם של הגנים של עניין בהתקדמות סרטן השד 13. אנו ביטוי היתר של החלבון בתאי סרטן השד אנושיים ולהזריק אותם לתוך כרית שומן החלב של NOD גמא SCID עכברים / (NSG). שיטה זו יש יתרון בדרכים רבות: היא מאפשרת שינויים גנטיים מהירים מאוד ומגוונים בשורת התאים המוזרקת, הוא מכסה את כל התהליך של התקדמות סרטן השד מצמיחת גידול ראשונית לגרורות באתרים רלוונטיים באופן פתולוגי, והוא גם מספק מודל ניסיוני טוב לבוחן את ההשפעה של טיפולים טיפוליים במחלה מוקדם או מאוחר שלבים. בנוסף, משתמש באחד מודל זה יכול לחקור את התפקיד של סטרומה לעומת חלבונים המופקים מתאים סרטניים בהתקדמות מחלה באמצעות עכברים או תאים מהונדסים גנטי. למרות זריקות תת עורית קלות יותר לביצוע, דגמי orthotopic להצמיח אוכלוסיית תאי הסרטן יותר tumorigenic וגרורתי יותר. לפיכך, תוצאות שהושגו באמצעות ההזרקה תת עוריתים יכול להיות גם שגוי שלילי או חיובי שגוי 6,17 עידוד השימוש במודלי orthotopic ללמוד את צמיחת הגידול.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1093">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:185px;">Name of material/equipment</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:95px;">Catalog number</td>
			<td style="width:641px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bouin&#39;s solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT10132</td>
			<td>Used for investigating the metastasis on lungs</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formalin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>Used to fix the tissues</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Matrigel, growth factor reduced</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Cells can be resuspended in matrigel for injection</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Mosquito forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13008-12</td>
			<td>Used for stiching</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Angled forceps</td>
			<td>Electron microscopy sciences</td>
			<td>72991-4c</td>
			<td>These make the exposure of mammary fat pad easier</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Scissors</td>
			<td>B Braun Medicals</td>
			<td>BC056R</td>
			<td>Used to cut open the mice</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Straight forceps</td>
			<td>B Braun Medicals</td>
			<td>BD025R</td>
			<td>This is used to open up the skin to expose mammary fat pad</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">NOD scid gamma mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>005557</td>
			<td>Experimental animal used for experiment</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MDA-MB-231</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>92020424</td>
			<td>Experimental cells used for injections</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Oculentum simplex</td>
			<td>Teva Pharmachemie</td>
			<td></td>
			<td>Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Betadine</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>19-898-859</td>
			<td>Ionophore, used to disinfect the surgical area</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Xylazin/Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1251, K2753</td>
			<td>Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Temgesic</td>
			<td>Schering-Plough</td>
			<td></td>
			<td>Use the painkiller as 0,05-0,1mg/kg body weight</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM</td>
			<td>Life sciences</td>
			<td>11995</td>
			<td>For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Buffered sodium citrate</td>
			<td>Aniara</td>
			<td>A12-8480-10</td>
			<td>Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.

<html> צמיחת סרטן שד ניתן ללמוד בעכברים באמצעות שפע של דגמים. מניפולציה גנטית של תאי סרטן שד עשויה לספק תובנות הפונקציות של חלבונים מעורבים בהתקדמות או בעזרה שבעור לגלות מדכאי גידול חדשים. בנוסף, הזרקת תאי סרטן לעכברים עם גנוטיפים שונים עשויה לספק הבנה טובה יותר של חשיבותו של תא סטרומה. דגמים רבים עשויים להיות שימושיים כדי לחקור היבטים מסוימים של התקדמות מחלה אך לא לשחזר את התהליך הסרטני השלם. בניגוד לכך, תאי סרטן השד engraftment לכרית שומן החלב של עכברים טובים יותר מסכמת את המיקום של המחלה ונוכחות של תא סטרומה הנכון ומחקה לכן טוב יותר למחלות סרטניות אנושיות. במאמר זה, אנו מתארים כיצד להשתיל תאי סרטן השד בעכברי orthotopically ולהסביר כיצד לאסוף רקמות לנתח: -14 פיקסלים; קו-גובה:. 28px; &quot;&gt; סביבת גידול וגרורה לאיברים מרוחקים שימוש במודל זה, היבטים רבים (צמיחה, אנגיוגנזה, וגרורות) של הסרטן יכולים להיחקר פשוט על ידי מתן סביבה נאותה לתאים סרטניים לגדול.

יישום מוצלח של &quot;מודל סרטן שד orthotopic&quot; מבוסס על הזרקה נכונה של תאים לתוך כרית שומן החלב. שגיאות ניסיוניות כגון חיסון מדויק של תאים או דליפה עלולות לגרום לשינויים בגודל גידול או אפילו העדר גידול שמוביל להיווצרות של מבנה מחפשים דומה לכרית שומן החלב מוזרקת עם חיץ שליטה (איור 2 א). שיעור הצמיחה של הגידול תלוי בטיבו של קו התא שהוחדר ובאופן כללי, ניתן לראות דרך העור של העכברים (איור 2). שלא כמו בניסויים במבחנה, שיעור הצמיחה של התאים הסרטניים לא יכול להיות קבוע בזמן in vivo (איור 2 ג). בשל חוסר חמצן וחוסר של חומרים מזינים, אזורי נימקי עלולים להיווצר ואזורים אלה ישפיעו על שיעור הצמיחה של הגידול (איור 2 ד). בנוסף, הגן של עניין עשוי להשפיע שלב מסויםהתקדמות הסרטן (מוקדם או מאוחר), ובכך ובהתאם להגדרות הניסיוניות, צמיחת גידול עלולה להתחיל מהר אבל להאט בסוף או להיפך. יש להקפיד במהלך הליך הסרת הגידול; טיפול קפדני עשוי להשפיע על המבנה של הגידול וגורם לבעיות בניתוח immunohistochemical. סביב גידול האזור עשוי להציג כלי גדול הנובעים משיפוץ של כלי דם. כלים אלה לשחק תפקיד מכריע בהוצאת פסולת ולספק את רקמת גידול עם חומרי מזון וחמצן ובכך להקל על צמיחת גידול (איור 2). כינונה של neovessels (אנגיוגנזה) יכול להיחקר על ידי צביעת הגידול לסמני neovessel (כלומר CD31, CD34). אוסף של הריאות בפתרון של Bouin עוזר לדמיין מוקדים שטחיים גרורתי על הריאות (איור 3 א). המוקדים ניתן להבחין בין רקמת ריאה באמצעות הצבע החיוורד הם קל לזיהוי 18. גרורות עלולות להתבטא במספר המוקדים נוצרו על פני השטח הריאה. עם זאת, יצירת מוקדים הוא תא קו תלוי; תאים שאינם אגרסיביים להצמיח micrometastasis בלבד או לא גרורות בכל. גרורות מיקרו ניתן לזהות בקלות עם כתמי haematoxylin / eosin ברקמת ריאה-מוטבע פרפין (איור 3 ג). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51967/51967fig1highres.jpg" /> איור 1:. חומרים ושיטות () ציוד כירורגי הנדרש להזרקה של תאי סרטן השד לתוך כרית שומן החלב תמונת נציג מראה את החשיפה של כרית שומן החלב (B).. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51967/51967fig2highres.jpg" /> איור 2:. סקירה כללית של צמיחת גידולי שד orthotopic בעכברי שליטת Media (א) או <strאונג&gt; תאי סרטן השד אנושיים (B) (מד&quot;א MB-231) מוזרקים לתוך כרית שומן החלב של עכבר NSG הנשי. עכברים מורדמים ותמונות צולמו. גידולים מסומנים על ידי המעגל המקווקו. החץ מצביע על כרית שומן החלב (C) נפח גידול נמדד עם calliper על ידי שימוש בנוסחא הבאה:.. גידול נפח = 0.5 x אורך x רוחב x רוחב (D) מורפולוגיה כוללת של הגידול מנותח עם צביעת H &amp; E. אני עומד לתאים הסתננו, T מציין תאי גידול וN מייצג אזור נימקי. (בר סולם = 200 מיקרומטר) <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51967/51967fig3highres.jpg" /> איור 3: גרורות לריאות גידול () ריאות של עכברים שהוזרקו orthotopically עם תאים סרטניים (מד&quot;א MB-231).. דגירה של ריאות בפתרון של Bouin חושפת את המוקדים גרורתי על ריאות. ריאות (B) מעכברי שליטהשעבר הזרקת orthotopic של תקשורת שליטה. כפי שניתן לראות בבירור, ריאות שליטה אלה לא מראות גרורות מקרוסקופית. (ג) H &amp; E מכתים מראה את האזור גרורתי ברקמת ריאה. הכנס מציג סקירה ההגדלה נמוכה של רקמת הריאה המכילה את המיקוד גרורתי. המלבן המקווקו השחור בהוספה מיוצג בלוח הגדול. תאי גידול מסומנים על ידי הקו המקווקו הלבן; שים לב לגרעינים גדולים יותר וצפופים יותר. (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר שחור, סרגל קנה מידה לבן = 20 מיקרומטר)

Watch this Scientific Journal Video about Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth. at JoVE.com

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

הסרטן הוא מחלה מורכבת שמושפעת מהרקמות המקיפות את הגידול, כמו גם המתווכים פרו מקומיים ואנטי דלקתיים. לכן, דגמי הזרקת orthotropic, ולא מודלים תת עורי עשויים להיות שימושיים ללמוד התקדמות הסרטן באופן שהפתולוגיה אנושית מחקה טוב יותר.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

orthotopic-injection-breast-cancer-cells-into-mammary-fat-pad-mice-to

Google

Research

JoVE Journal

Medicine

78.3K Views.  Leiden University Medical Center.  הסרטן הוא מחלה מורכבת שמושפעת מהרקמות המקיפות את הגידול, כמו גם המתווכים פרו מקומיים ואנטי דלקתיים. לכן, דגמי הזרקת orthotropic, ולא מודלים תת עורי עשויים להיות שימושיים ללמוד התקדמות הסרטן באופן שהפתולוגיה אנושית מחקה טוב יותר. 

Video: Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Performing and Processing FNA of Anterior Fat Pad for Amyloid

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis. Since the clinical presentation of this disease is so variable and non-specific, the associated risks of these biopsies are too great for the diagnostic yield. Other sites that have a lower biopsy risk, such as skin or gingival, are also relatively invasive and expensive. In addition, these biopsies may not always have sufficient amyloid deposits to establish a diagnosis. Fat pad aspiration has demonstrated good clinical correlation with low cost and minimal morbidity. However, there are no standardized protocols for performing this procedure or processing the aspirated specimen, which leads to variable and nonreproducible results. The most frequently utilized modality for detecting amyloid in tissue is an apple-green birefringence on Congo red stained sections using a polarizing microscope. This technique requires cell block preparation of aspirated material. Unfortunately, patients presenting in early stage of amyloidosis have minimal amounts of amyloid which greatly reduces the sensitivity of Congo red stained cell block sections of fat pad aspirates. Therefore, ultrastructural evaluation of fat pad aspirates by electron microscopy should be utilized, given its increased sensitivity for amyloid detection. This article demonstrates a simple and reproducible procedure for performing anterior fat pad aspiration for the detection of amyloid utilizing both Congo red staining of cell block sections and electron microscopy for ultrastructural identification.

Fat pad aspiration is a preferred, minimally invasive, and low cost approach as compared to other methods to detect amyloid for diagnosis of systemic amyloidosis. This video article demonstrates a procedural outline for performing fat pad aspiration with appropriate processing of the specimen for the optimal diagnostic outcome.

ביצוע ועיבוד FNA של Pad שומן Anterior עבור עמילואיד

Historically, heart, liver, and kidney biopsies were performed to demonstrate amyloid deposits in amyloidosis.  Since the clinical presentation of this ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

במבחנה מערכת לחקר תרדמת גידול ואת החלף ל גידול גרורתי

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

שלפוחית ​​השתן Orthotopic גידול דגם ואת הערכת טיפול סרנה השלפוחית

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

השתלת אב עורקים בעכברי orthotopic לחקר מחלת כלי דם

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

הדמית זמן לשגות של תאי אפיתל חלב Preneoplastic ראשוניים הנגזרת ממודלי עכבר מהונדס גנטי של סרטן השד

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

הערכה של יכולת הקיום של הזרקת שומן האנושי בעכברי עירום עם מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...