This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen&#8217;s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.

הפרוצדורות הבאות נערכו בהתאם קפדן עם בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986. 1. הכנת פלסמיד DNA לMicroinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הפלסמיד pTol2-krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: eGFP עם ערכת טיהור פלסמיד דנ&quot;א מסחרית בהתאם להוראות היצרן ולדלל את ה- DNA פלסמיד לריכוז פתרון המניות סופי של 100 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize transposase מכיל pT3TS פלסמיד / 14 Tol2 ידי עיכול הגבלת BamHI, בעקבות הפרוטוקול של היצרן. ניתן להאריך צעד זה לילה. להאיץ את ה- DNA לינארית על ידי מיצוי פנול / כלורופורם, בעקבות הפרוטוקול הסטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במבחנה לתמלל mRNA transposase מפלסמיד לינארית עם ערכת שעתוק מסחרית לכמויות גדולות של RNA כתרים על פי הוראות היצרן, לדלל וaliquot לריכוז סופי פתרון מניות של 100 ng / μl במי nuclease חינם. להבטיח את האיכות של RNA המטוהר עם 1-2% ילידי טה (40 מ&quot;מ טריס, חומצה אצטית 20 מ&quot;מ, 1 mM EDTA) אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל (80-120 V). אחסן את RNA ב -80 ° C. </li></ol> 2. Microinjection של פלסמיד DNA על ביטוי גני חלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת הזרקת agarose להחזיק את הביצים המופרות במהלך הזרקה. יוצקים agarose 3% נוזל לתוך צלחת פטרי 90 מ&quot;מ. בוא מגניב agarose 40-50 מעלות צלזיוס ומוסיף את עובש microinjection תקוע בצורת TU-1 על גבי agarose הנוזלי. לאחר התקשות בטמפרטורת חדר, בואו שאר agarose על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הסרת העובש. תבניות microinjection החנות ב 4 ° C ושימוש חוזרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquot של פתרון ההזרקה. בצע את השלבים הבאים על קרח. פיפטה 1 μl של DNA פלסמיד (ריכוז סופי של 10 ng / μl), 2 μl של mRNA transposase (ריכוז 20 ng / μl סופי), 2μl של 10 מ&quot;ג / Rhodamine B isothiocyanate-Dextran μl, 2 μl של פתרון 5x Danieau (290 מ&quot;מ NaCl, 3.5 מ&quot;מ KCl, 2 מ&quot;מ MgSO 4, 3 מ&quot;מ Ca (NO 3) 2, 25 מ&quot;מ HEPES, pH 7.6) ל נפח סופי של 10 μl במי nuclease חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מחטים מנימי זכוכית בורוסיליקט בקוטר 1 מ&quot;מ המכילות חוט להט פנימי על ידי משיכת הנימים בכיוונים מנוגדים עם חולץ micropipette. השתמש בתכנית הבאה: חום 530, למשוך 200, מהירות 80 וזמן 150. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מחט אחת עם 2 μl של פתרון ההזרקה (כל הזמן על קרח). הימנע מבועות על ידי משיכת בזהירות את קצה microloader תוך שחרור הפתרון לנימים. זהירות לשבור את קצה המחט עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסדיר את גודל הטיפה עם משאבת pico פנאומטי. מדוד את קוטר טיפה / הנפח (V = 4/3 πr 3) ולהתאים את גודל הטיפה עם מיקרומטר עיני תחת stereoscope בdimethylpolysiloxane. אנו ממליצים100 מיקרומטר, מקביל לרמה של 0.5 nl. זה מבטיח ריכוזים אחידים ושחזור לכל עובר מוזרק. לכייל הריכוז המוזרק ולהתאים לכל מבנה והכנת פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את zygotes (איור 1 א) המתקבל מצלב של Tg (כטב&quot;מ: eGFP-HRAS G12V) io006 15 עם Tg (lysC: dsRed2) nz50Tg 16 לתוך התבניות של צלחת ההזרקה ידי שימוש בpastette 3 מיליליטר. בינתיים, לשמור על קצה מחט הזריקה מוכנה מראש בdimethylpolysiloxane כדי למנוע את הפתרון מהתייבשות וקרישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את ירידת premeasured (100 מיקרומטר המקביל לרמה של 0.5 nl) תחת stereoscope הדרך סיסית לblastodisc 17, (איור 1 א) לפני המחשוף הראשון. הזרקה לתוך השלב אחד התא מגדילה את הפוטנציאל של התפלגות אחידה של פלסמיד דנ&quot;א ורנ&quot;א במסת תאי פיתוח והאפשרות לשידור בתאי מין. זהראוי לציון כי הביטוי של מבנים לעתים קרובות יותר נוטה להיות פסיפס. </li></ol> 3. שינוי תא עור מותנה על ידי 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את העוברים הוחדרו לתוך פתרון 0.3x Danieau ולשמור אותם על 28.5 מעלות צלזיוס בחממה. הסר ביצים מופרה מהצלחת בשלב תחום 17. -הזריק שיתוף Rhodamine B isothiocyanate-dextran יכול להיות מנוצל כמו הזרקת שליטה תחת stereoscope ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי מסך ב 24 hpf (שעות שלאחר הפריה) לביטוי לב של eGFP. תמשיך להעלות cmlc: עוברי דג הזברה חיוביים eGFP עד 72 hpf. לפקח בזהירות את המים באיכות (0.3x Danieau). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את סיסית מאותם עוברים שלא בקעו עם מלקחיים ב 72 hpf. לתקוע בזהירות סיסית עם 1 מלקחיים ולפרק אותו על ידי שימוש באחר. עוברים בחרו לlysC: ביטוי dsRed2 באמצעות stereoscope ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של 10 מ&quot;מהמניה של (Z) -4-Hydroxytamoxifen 20 מיליליטר של תמיסת 0.3x Danieau (ריכוז סופי של 5 מיקרומטר). השתמש באינדוקצית פתרון 4-OHT לצלחת אחת סטנדרטית פטרי (90 מ&quot;מ) בקבוצה של 40-60 עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את העוברים לתוך צלחת פטרי המכילה חדשה 20 מיליליטר של אינדוקצית פתרון טרי. 4-OHT יש לאחסן וטפל בחושך. הסימנים הראשונים של ביטוי ניתן לזהות תחילת לאחר אינדוקציה שעה 2. ניתן להאריך האינדוקציה-צעד לילה, תוך התחשבות כי תא מארח ראשוני: אינטראקציות תא preneoplastic יכולים להתרחש כבר כמה שעות לאחר טיפול. </li></ol> 4. הרכבה והדמיה חיה של דג הזברה זחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת פטרי 60 מ&quot;מ על ידי החדרת חור בקוטר של 18-20 מ&quot;מ. השתמש גריז סיליקון ואקום גבוה כדי לכסות ולאטום את החור בתחתית החיצונית של צלחת פטרי עם מכסה זכוכית 25 מ&quot;מ (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1% agarose נקודת התכה נמוך (LMP). שמור צינור 1.5 מיליליטר אחדשל agarose LMP על 37 מעלות צלזיוס בבלוק חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיון הקפדני Tg (krt4: T2 KalTA4-ER; כטב&quot;מ: eGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) זחלים לתא ירוק ניאון עור וביטוי dsRed2 חיובי מולדים תאים חיסוניים, תחת stereoscope ניאון. להרדים זחלים על ידי התוספת של 1 מיליליטר של 0.4% tricaine 18 לפתרון האינדוקציה 20 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הזחלים שנבחרו מראש עם pastette לagarose LMP הנוזלי. בואו הזחלים לשקוע LMP agarose ולהעביר אותם על מכסה הזכוכית (איור 1). להתמצא עובר תחת stereoscope. הזחלים צריכים להיות ממוקמים על משטח הזכוכית ישירות להפחית את מרחק העבודה (עד 6 זחלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את agarose LMP עם tricaine מכילה פתרון אינדוקציה לאחר שהתקשה (חץ איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת הזחלים המוטבעים באמצעות ניאון הפוך, לייזר סריקה או מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב. השתמש 40X או 63Xמטרה כמטרות במרחקים ארוכה עובדים מאפשרת התמקדות בכל הזחלים. </li></ol>

<ol>
	<li>Kajita, M., Sugimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamin+acts+as+a+key+regulator+in+epithelial+defence+against+transformed+cells.">Filamin acts as a key regulator in epithelial defence against transformed cells.</a> Nature communications. 5, 4428 (2014).</li><li>Feng, Y., Santoriello, C., Mione, M., Hurlstone, A., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+innate+immune+cell+sensing+of+transformed+cells+in+zebrafish+larvae:+parallels+between+tumor+initiation+and+wound+inflammation.">Live imaging of innate immune cell sensing of transformed cells in zebrafish larvae: parallels between tumor initiation and wound inflammation.</a> PLoS Biology. 8 (12), e1000562 (2010).</li><li>Feng, Y., Renshaw, S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Tumor+Initiation+in+Zebrafish+Larvae+Reveals+a+Trophic+Role+for+Leukocyte-Derived+PGE+2.">Live Imaging of Tumor Initiation in Zebrafish Larvae Reveals a Trophic Role for Leukocyte-Derived PGE 2.</a> Current Biology. 22 (13), 1253-1259 (2012).</li><li>Halpern, M. E., Rhee, J., Goll, M. G., Akitake, C. M., Parsons, M., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gal4/UAS+transgenic+tools+and+their+application+to+zebrafish.">Gal4/UAS transgenic tools and their application to zebrafish.</a> Zebrafish. 5 (2), 97-110 (2008).</li><li>Gong, Z., Ju, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=fluorescent+protein+expression+in+germ-line+transmitted+transgenic+zebrafish+under+a+stratified+epithelial+promoter+from+keratin8.">fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8.</a> Developmental Dynamics an Official Publication of the American Association of Anatomists. 223 (2), 204-215 (2002).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., K&#246;ster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li><li>Feil, R., Wagner, J., Metzger, D., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Cre+recombinase+activity+by+mutated+estrogen+receptor+ligand-binding+domains.">Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 237 (3), 752-757 (1997).</li><li>Gerety, S. S., Breau, M. a., Sasai, N., Xu, Q., Briscoe, J., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+transgene+expression+system+for+zebrafish+and+chick.">An inducible transgene expression system for zebrafish and chick.</a> Development. 140 (10), 2235-2243 (2013).</li><li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos.">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Cell+Extrusion+from+the+Epidermis+of+Developing+Zebrafish.">Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).</li><li>Kague, E., Weber, C., Fisher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Zebrafish+Transgenesis+for+Evaluating+Enhancer+Sequences.">Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences.</a> J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).</li><li>Balciuniene, J., Gene Balciunas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+Using+Gal4+in+Zebrafish.">Trapping Using Gal4 in Zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (79), e50113 (2013).</li><li>Balciunas, D., Wangensteen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genetics. 2 (11), e169 (2006).</li><li>Santoriello, C., Gennaro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kita+driven+expression+of+oncogenic+HRAS+leads+to+early+onset+and+highly+penetrant+melanoma+in+zebrafish.">Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish.</a> PloS One. 5 (12), e15170 (2010).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+development+in+bony+fish+with+particular+emphasis+on+collagen+deposition+in+the+dermis+of+the+zebrafish+(Danio+rerio).">Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio).</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).</li><li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiSite+Gateway+Three-+Fragment+Vector+Construction+Kit.">MultiSite Gateway Three- Fragment Vector Construction Kit.</a> Protocols and Product Manuals. 12537-023, (2010).</li><li>Petersen, L. K., Stowers, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gateway+MultiSite+Recombination+Cloning+Toolkit).">A Gateway MultiSite Recombination Cloning Toolkit).</a> PLoS ONE. 6 (9), e10 (2011).</li><li>Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Gateway+to+MultiSite+Gateway+in+one+recombination+event.">From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event.</a> BMC Molecular Biology. 7, 46 (2006).</li><li>Robertson, D. W., Katzenellenbogen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+the+(E)+and+(Z)+isomers+of+the+antiestrogen+tamoxifen+and+its+metabolite,+hydroxytamoxifen,+in+tritium-labeled+form.">Synthesis of the (E) and (Z) isomers of the antiestrogen tamoxifen and its metabolite, hydroxytamoxifen, in tritium-labeled form.</a> The Journal of Organic Chemistry. 47 (12), 2387-2393 (1982).</li><li>Murphy, C., Langan-Fahey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-function+relationships+of+hydroxylated+metabolites+of+tamoxifen+that+control+the+proliferation+of+estrogen-responsive+T47D+breast+cancer+cells+in+vitro.">Structure-function relationships of hydroxylated metabolites of tamoxifen that control the proliferation of estrogen-responsive T47D breast cancer cells in vitro.</a> Molecular. 38 (5), 737-743 (1990).</li><li>Furr, B. J. A., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+clinical+uses+of+tamoxifen.">The pharmacology and clinical uses of tamoxifen.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 25 (2), 127-205 (1984).</li><li>Akerberg, A. a., Stewart, S., Stankunas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Control+of+Transgene+Expression+in+Zebrafish.">Spatial and Temporal Control of Transgene Expression in Zebrafish.</a> PloS One. 9 (3), e92217 (2014).</li><li>Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally-controlled+site-specific+recombination+in+zebrafish.">Temporally-controlled site-specific recombination in zebrafish.</a> PloS One. 4 (2), e4640 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

במהלך embryogenesis ופיתוח זחל, עור דג הזברה העוברי מורכב משתי שכבות אפיתל, periderm נקרא השכבה השטחית ושכבה של קרטינוציטים בסיסיים המחוברים לקרום במרתף הבסיסי 19 (איור 1 ג, א). הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה פשוטה כדי לגרום לשינוי preneoplastic תאים בשכבת העור השטחית של זחלי דג הזברה על תנאי, ומאפשר ניתוח אינטראקציה שלאחר מכן עם תאים חיסוניים מולדים על ידי הדמיה לחיות. מתודולוגיות הבסיסיות בפרוטוקול שלנו לעקוב אחר טכניקות דג הזברה מבוססות היטב 9-13, והפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם בקלות ובשינוי. אמרגן krt4 5 משמש כאן מניע ביטוי T2 KalTA4-ER במיוחד בשכבת העור החיצונית ביותר (איור 1 ג, ב). עם זאת, המרובה אתרי Gateway מודולרישיבוט אסטרטגיה, המשמשת לייצור krt4: מבנה T2 KalTA4-ER (1D איור,), מספק את האפשרות לשבט כל אמרגן של עניין מול T2 KalTA4-ER בצעד שיבוט יחיד. הסתגלות של השיטה המוצגת במסמך זה ולכן אפשרי עבור רוב הרקמות בעובר ושלבי זחל. הזמינות של רצפי אמרגן היא זאת הגורם המגביל. יתר על כן, כמעט בכל גן של העניין המשובט מאחורי כטב&quot;מ ניתן ביטוי יתר תנאים בשלבי התפתחותיים שונים על ידי שימוש בביטוי T2 KalTA4-ER המרחבית ובזמן בשליטה. לכן, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם כדי לבצע ביטוי גנים מותנה בכל רקמות של עניין בזחלי דג הזברה, באופן פסיפס. אפשר גם לייעל את מיקרוסקופ הגדרה כדי לחיות תמונת רקמות עמוקות יותר כגון כבד או לבלב. שתארנו יישום אחד תוך שימוש בפרוטוקול שהואמחדש, באופן דומה, ניתן ביטוי יתר מאפנני דלקת אחרים תוך שימוש בפרוטוקול זה כדי ללמוד את הרגולציה של תגובות דלקתיות, כאחד יכול נויטרופילים תמונה בקלות חיים ושינויים התנהגותיים מקרופאג הבא האינדוקציה ומעצרים בביטוי של מאפנן דלקתי מועמד. יתר על כן, הפרוטוקול המותאם יהיה גם מועיל למי שרוצה לעקוב אחר תנועה של תאים ושינוי התנהגות בשלבים שונים של המורפוגנזה רקמה והיווצרות איברים ו, ​​תמונה סוף סוף לחיות את האינטראקציה של אינטראקציות תא חיסון מולדים עם שושלות תאים ספציפיות אחרות שיכולה להיות ממוקדת על ידי מערכת ביטוי T2 / כטב&quot;מ KalTA4-ER מושרה. השתמשנו וקטור pDestTol2CG מTol2kit דג הזברה 20-23 המכיל cmlc2: eGFP-הרשות הפלסטינית קלטת (1D איור,) המאפשרת בחירה הבאה של עוברים על ידי לב חיובי ניאון ירוק כseסמן lection 20, המפשט את תהליך מיון F0. הכנסה יציבה של גן transposon מוקף עניין לתוך הגנום היא הקלה על ידי הזרקה המשותפת של ה- DNA פלסמיד יחד עם mRNA transposase. ההכנה של ה- DNA פלסמיד וmRNA transposase לmicroinjection כדלקמן פרוטוקולים סטנדרטיים. עם זאת, שילוב מוצלח של המבנה לתוך הגנום תלוי בהעתקה מבוססת Tol2 14. זה מדגיש את תשומת הלב המיוחדת שתשולם לעבודה על קרח בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהומים והשפלות על ידי RNases וDNases. Microinjection לעוברי שלב אחד תא הוא טכניקה חזקה ומבוססת היטב לרווח והפסד של מחקרים לתפקד ב9,10 דג הזברה. למרות שאדם מאומן היטב בקלות יכול להזריק לתוך החלמון של מעל 1,000 עוברים בשעה 1, ההזרקה לblastodisc (איור 1 א, כוכבית) דורשת יותר ניסיון והכשרה. קריטי במהלך הליך זה אניזה הטיפול במחט. המחט צריכה להיות דק מאוד לחדור לתא ללא נזק, ולכן צריכה להיות שנשברה רק על הקצה שלה מאוד. חשוב לשלוט באופן קבוע ולמדוד את גודל הירידה במהלך ההזרקה כדי להבטיח הזרקה אחידה לכל עובר. מטופל בזהירות, את המחט ניתן להשתמש כדי לסובב את העובר. זה נחוץ לעתים קרובות כדי למצוא את blastodisc וזווית החדירה האופטימלית. הריכוז של mRNA DNA וtransposase המשמש להזרקה כמעט בודאות משפיע על יעילות הביטוי. מינונים גבוהים יותר יכולים להוביל לעליית משקלם של תאים המבטאים את הגן, אבל עם ריכוזים גבוהים יותר של ה- DNA (&gt; 50 ng / μl) וtransposase mRNA (&gt; 100 ng / μl) גם הפוטנציאל להשפעות רעילות בקרב עוברים מוזרקים אינו מתעורר. אנחנו בעד השימוש של 10 ng / μl DNA ו- 20 ng / μl transposase mRNA להזרקה, אשר תואם את 50 pg של פלסמיד דנ&quot;א ורנ&quot;א 100 pg לEMB הזריקryo. של עוברים מוזרקים עם ריכוזים אלה 100% מפתחים בדרך כלל, ובין 40-70% ביטוי G12V תכנית eGFP-HRAS, לאחר אינדוקציה 4-OHT, בהתאם ליעילות ההזרקה לתוך התא הבודד. בין עוברים חיוביים שאנחנו בדרך כלל למצוא כ -30% שיש לי 1-10 שיבוטים, 40% שיש לי 10-50 שיבוטים ו -30% שיש יותר מ 50 שיבוטים. בשל מטרות המחקר שלנו, אנו דוגלים בשימוש בעוברים עם פחות שיבוטים להביע G12V eGFP-HRAS. אנו בוחרים עוברים עם 10-50 שיבוטים לניסויים חולפים שלנו. עבור הדור של דגי מייסד מהונדסים, אנו ממליצים לבחור עוברים עם שני סמן eGFP החיובי הלב ומספר גדול של שיבוטים חיוביים eGFP-HRAS G12V באפידרמיס בלבד. (Z) -4-Hydroxytamoxifen עובר מרה הדדית cis-טרנס (EZ) כאשר הם נחשפים לאור 24. נמצא כי האיזומר cis (E) הוא 100x אנטי-אסטרוגניים פחות מעמיתו טרנס 25,26. Exposurדואר לאור ולכן יש להימנע. פתרון מניות 4-OHT מומס באתנול ניתן לאחסן ב -20 ° C בחושך על פני תקופה ארוכה. אנו ממליצים על השימוש בתיבה כדי להגן על צלחות פטרי מהאור במהלך האינדוקציה גן המטרה בחממה והתחבורה. למרות שהשטח של הדמיה הוא מאוד קטן וחשיפה של 4-OHT לאור UV מצטמצם למינימום, חליפין קבועים של פתרון אינדוקציה כל 2 שעות בזמן הדמיה פני תקופות זמן ארוכות יותר מומלצת כדי לשמור על רמות ביטוי המרביות. 4-OHT permeabilizes יעילות הדרך סיסית ושכבות העור החיצוניות ביותר בעובר דג הזברה, ולכן זה יכול לגרום לביטוי גנים בקצב מהיר מאוד. אנחנו בקלות יכולות לראות פליטת eGFP לאחר 2 שעות של אינדוקציה וזה כבר דווח כי סימנים הראשונים של ביטוי היעד-גן ניתן לצפות לאחר שעה 1 ורמה לאחר 3 שעות של טיפול 8. ההבדלים יכולים להיות בגלל האמרגן שונה ששמש במחקר שלנו. כיש יחסי ציבור היהדיווחו eviously ש4-OHT טיפול במינון 8,27 תלויים, בחרנו להשתמש בריכוז המדווח הגבוה ביותר של 5 מיקרומטר להשיג רמות ביטוי חזקות ושחזור בגישה החולפת שלנו. זה צריך להבטיח שכל התאים הנושאים את הגן יגרמו לביטוי גן המטרה. יש לה שיש לקחת בחשבון שהגישה החולפת הציגה כאן עלולה להוביל לרמות ביטוי שונות בשל האפשרות של אירועי החדרת הגנום מרובים ואקראיים. יתר על כן, השימוש בmRNA transposase ברקע המהונדס Tol2 של Tg (כטב&quot;מ: eGFP-HRAS G12V) io006 יכול להוביל לחילופים ופוטנציאל של transgene כטב&quot;מ שעלול לגרום להשתקת גנים או שיבוש. עם זאת, כשיטת המוצגת כאן מייצגת גישה חולפת, המיון המוקדם של עוברים לאחר הזרקה הוא חובה. מעבדות רבות מצאו כי רצפי כטב&quot;מ נוטים להיות מושתקים בצאצאים מהונדסים, ומכאן בjecting pTol2-krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: eGFP לבנות לתוך Tg (כטב&quot;מ: eGFP-HRAS G12V) io006 עוברים לא יכול להיות יעיל כמו הזרקת כטב&quot;מ לבנות לתוך Tg (krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: GFP עוברים). השימוש בקו המהונדס היציב Tg (krt4: T2 KalTA4-ER) חצה עם Tg (כטב&quot;מ: eGFP-HRAS G12V) io006 יאפשר ניטור מדויק של קינטיקה / כיבוי של זמן מינון הפעלת גן 4-OHT תלוי . צעד קריטי במהלך ההרכבה של זחלים הוא ההעברה לagarose LMP ועל מכסה הזכוכית (איור 1). יש רק פרק זמן קצר לטמפרטורת agarose LMP נוזלית המאפשר העברה וכיוון בטוחה של הזחלים שנבחרו מראש מבלי לפגוע בדגים או על ידי הלם חום או התקשות של ג&#39;ל. הזחלים צריכים להיות מכוון ישירות על גבי מכסה הזכוכית כדי לצמצם את מרחק העבודה לanaly המיקרוסקופי שלאחר מכןsis. כמו זה יכול להיות גורם מגביל במיקרוסקופיה בחירת המטרות המתאימות היא חובה. ברגע שעלה, הזחל יכול להישמר משעות עד ימים. ההתניה של מערכת המודל שהוצגה במסמך זה מאפשרת לשינוי חוזר ונשנה של הפעלת 4-OHT של transgene. מערכת הביטוי תלויה בנוכחות של 4-OHT ולכן ביטוי KalTA4 המבוקר של גן של עניין הוא הפיך (1D איור, ב). בניגוד לT2 Cre-ER / המערכת לקס, המאפשרת אירוע רקומבינציה הגנומי בלתי הפיך 28, יכול להיות מופעל על KalTA4-ER T2 / כטב&quot;מ ומנוטרל על תוספת או גריעה של 4-OHT ופוטנציאל זה לזירוז חוזר ונשנה הוא יתרון של הטכניקה מעל T2 המערכת / קס Cre-ER. עם זאת, הדרישה לרמות קבועות של 4-OHT היא מגבלה אם הניסוי צריך להיות ממושך מימים עד שבועות.

צמיחת היתר של צאצאי תא preneoplastic בתוך גיליון אפיתל אחרת נורמלי מאוד תלויה אינטראקציה עם מייקרו-הסביבה שלה. האינטראקציה עם רקמת המארח שלה עשויה להיות הגורם המכריע באם תא preneoplastic הוא מסוגל להקים נישה משובט כדי לפתח עוד יותר לסרטן מפוצץ מלא. למרות חשיבותה בהתפתחות, שלב ראשוני זה של התקדמות הסרטן אינו נגיש במערכות מודל הנפוצות ביותר, in vivo. דג הזברה, Danio rerio, הוא אורגניזם מודל מבוסס היטב ללימודי הדמיה לחיות בגלל השקיפות שלה בכל התפתחות, האפשרות למניפולציה גנטית, והנגישות לתרופות מסיסות במים. מחקרים שנעשה לאחרונה תוך שימוש במודל דג הזברה זחל, ביתר אונקוגן אדם HRAS G12V להפוך לתאי האפיתל, הראו כי תא מארח נגזר אותות, בH 2 O מסוים יתרון 2 להגיוס של תאים חיסוניים מולדים. מעניין לציין, כי התאים, נויטרופילים ומקרופגים חיסוניים גייסו, הוצגו ליש להם תפקיד בתמיכה תזונתי תא preneoplastic התפשטות 2,3. כדי להבין את האירועים המוקדמים של התחלה של גידול והתקדמות, כמו גם את התרומה של תגובה דלקתית, אחד צריך להיות מסוגל תמונת האירועים הללו מנקודת הזמן המוקדמת ביותר ואילך. לכן יש צורך לשלוט בשינויי תא באופן ספציפי זמני ורקמות. אנו מנצלים את המערכת / כטב&quot;מ Gal4 שהותאם בהצלחה מ4 תסיסנית להביע תנאי אונקוגן אדם HRAS G12V תחת שליטתו של קרטין אמרגן ספציפי עור 4 (krt4) 5. הגרסה שונה של activator Gal4 תעתיק, כלומר KalTA4 6, מאפשרת ביטוי של HRAS G12V תחת שליטתו של Upstream ההפעלה של הרצף (כטב&quot;מ). תנאים כדי לגרום לביטוי activator תעתיק, KalTA4 כבר התמזג תחום המוטציה מחייב ליגנד של α קולטן אסטרוגן האנושי (T2 ER) 7 אשר נקשר באופן ספציפי 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) 1. בהעדר 4-OHT T2 ER כרוך בציטופלסמה על ידי חלבוני חום-הלם. על 4-OHT מחייב חום-הלם חלבונים לנתק, המאפשר טרנסלוקציה גרעינית של KalTA4-ER T2 והפעלה הבאה של כטב&quot;מ המבוקר גן של עניין 8 (איור 1 ג, ב). כמערכת ביטוי, זה תלויה בנוכחות של 4-OHT, ביטוי KalTA4 המבוקר של גן של עניין הוא הפיך. בניגוד לT2 Cre-ER / המערכת לקס, מה שמוביל לאירוע רקומבינציה בלתי הפיך, האינדוקציה של הפעלת תעתיק ידי KalTA4-ER T2 היא הפיכה על ידי תוספת או גריעה של 4-OHT. Allo הפרוטוקול הבא<html> ws שינוי מותנה של תאי עור בזחלי דג הזברה וניטור הבא של האינטראקציה עם תאים חיסוניים מולדים על ידי ביטוי חלבון פלואורסצנטי. מתודולוגיות הבסיסיות המועסקות בפרוטוקול זה דומות לכמה טכניקות נפוצות בקהילת דג הזברה 9-13. הדור ושימוש הקומבינטורית של קווים מהונדסים יחד עם microinjection של מבנים מהונדסים מאפשרים גישה חולפת להפוך רק תאים בודדים באופן פסיפס. חדירות החמצן של עור דג הזברה העוברי וזחל מעלה את האפשרות ללימודי הדמיה לחיות זמן לשגות על ידי מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה משעות עד ימים. יתר על כן, נגישותו לתרופות מסיסות במים תאפשר מחקרים מכניסטית עתיד והניטור של אירועים ביולוגיים תא in vivo שעלול להוביל להבנה טובה יותר של השלבים המוקדמים ביותר של התפתחות הסרטן. _content &quot;&gt; פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לבצע ביטוי גנים מותנה בכל רקמות של עניין בזחלי דג הזברה, באופן פסיפס. אפשר גם לייעל את מיקרוסקופ הגדרה כדי לחיות תמונת רקמות עמוקות יותר אחרות מאשר עור.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1104">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:197px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:467px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(Z)-4-Hydroxytamoxifen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7904</td>
			<td>dilute in ethanol and store in the dark at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>20x/0,5 Ph2 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>40x/1,2W Korr &#8734;/0,14-0,18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">63x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>63x/1.4 Oil Ph3 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 510 META</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0171</td>
			<td>Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DMPSV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning high-vacuum silicone grease&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MKBL4135V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent stereoscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection mold TU-1</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axiovert 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE mMACHINE Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>PV820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-90A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B isothiocyanate-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8881</td>
			<td>10mg/&#956;l in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M80</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine/MS-222</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Low Melting Point Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>25:24:1, v/v</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of innate immune and preneoplastic cell interactions using an inducible gal4/uas expression system in larval zebrafish skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Zygotes של הכלאה בין Tg (כטב&quot;מ: eGFP-HRAS G12V) io006 וTg (lysC: dsRed2) nz50Tg נאסף 10-15 דקות לאחר הפריה (איור 1 א) כדי לקבל עוברי תא בשלב 1. לאחר הזרקת העוברים הועלו עד 3 DPF, לפני גיוס עם 4-OHT והרכבת הדמיה חיה (איור 1). 2-6 שעות לאחר אינדוקציה העוברים רכובים הונחו גם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (איור 2 א) או מיקרוסקופ הפוך confocal (איור 2 ב-ג) וצלמתי במשך שעה 2-3 במרווחי 1.5 דקות. ניתן לזהות תאי עור שטחיים Preneoplastic ידי המורפולוגיה המעוגלת יותר שלהם בהשוואה לקרטינוציטים רגילים, כמו גם את פליטת הניאון הירוקה של הקרום המקומי eGFP-HRAS G12V. תחומי ההדמיה, שנבחרו לשיתוף לוקליזציה של תאי עור ותאי preneoplastic מולדים חיסוניים (חץ איור 2 א). בשל mig המהירתהליך המנה של נויטרופילים מרווחי הזמן לשגות נבחרו להיות בין 1-1.5 דקות עם גדלי צעד ערימת Z של .7-1.7 מיקרומטר להשיג תחזיות מרבי עוצמה (איור 2, 1 וידאו). יש מגוון רחב של התנהגויות שניתן לראות בזמן ההדמיה חיה: נויטרופילים להעביר ליד ותחת תאי preneoplastic (איור 2 ג, 1 וידאו), יוצרים קשר ישיר לתאים (איור 2 ו- C), להסיר שאריות של תאי preneoplastic שעוברים אפופטוזיס (וידאו 1), או באופן פעיל לבלוע חלקים של תאי preneoplastic (לא מוצג). כדי ללכוד את הספקטרום המלא של אינטראקציות, רצוי לעקוב ההתנהגויות שלהם על ידי הדמיה לחיות זמן לשגות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" width="700px" /> איור 1: סכמטי לשינוי תא עור מותנה בזחלי דג הזברה. תמונה של הזיגוטה של Tg (כטב&quot;מ (): eGFP-HRAS G12V; LysC: דג הזברה dsRed2) בשעה 10 דקות שלאחר הפריה (MPF). הביצית המופרית מוקפת סיסית (ראש החץ). האתר להזרקה הוא blastodisc (הכוכבית), שהוקם על ידי זרמי cytoplasmic מהחלמון (החץ) המגדיר את מוט החיה של העובר. הרכבה (B) של זחלי דג הזברה. 60 מ&quot;מ צלחת פטרי עם חור מ&quot;מ 18-20 (ראש חץ) שהוא חתומה על ידי מכסה זכוכית 25 מ&quot;מ. זחלי דג הזברה הם משותקים ורכובים על גבי מכסה הזכוכית ב -1% agarose LMP. פתרון 0.3x Danieau (חץ) המכיל 5 מיקרומטר 4-OHT משמש לכיסוי agarose LMP. (C)-OHT 4 מושרה תמורות של תאי עור שטחיים. (א) פרופיל חתך סכמטי של עור זחל. העור העוברי וזחל מורכב משתי שכבות של תאי האפיתל, שכבת תא שטחית ושכבת תאי בסיס של קרטינוציטים שמחוברים לקרום במרתף הבסיס (BM). T מערכת הביטוי חולף (ב)o לגרום לשיבוט תאי preneoplastic בין תאי עור שטחיים. KalTA4-ER T2 בא לידי ביטוי אך ורק בשכבת העור החיצונית ביותר מונעת על ידי האמרגן krt4 (הצהוב). ביטוי פסיפס של KalTA4-ER T2 מפעיל כטב&quot;מ מבוקר ביטוי G12V (כחול) eGFP-HRAS בתאים שטחיים, שמוביל לשיבוט של תאי preneoplastic (ירוק). (ד) סכמטי של מערכת הביטוי החולפת. (א) קלטת Tol2 של pTol2-krt4: KalTA4-ER T2; cmlc2: וקטור ביטוי eGFP משמש זמני (ב) אינדוקציה מותנית של ביטוי activator תעתיק.. KalTA4 הוא התמזגה לתחום מחייב ליגנד המוטציה של α קולטן אסטרוגן האנושי (T2 ER) אשר נקשר באופן ספציפי 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT). בהעדר 4-OHT T2 ER כרוך בציטופלסמה על ידי חלבוני חום-הלם (Hsp90). על 4-OHT מחייב Hsp90 dissociates, המאפשר טרנסלוקציה גרעינית של KalTA4-ERT2 וההפעלה הבאה של כטב&quot;מ המבוקר ביטוי eGFP-HRAS G12V. בר סולם = 500 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" width="700px" /> איור 2: הדמיה חיה של אינטראקציה תא חיסון preneoplastic והמולדת. (AC) תמונות של 4 DPF Tg (כטב&quot;מ: eGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) עובר, שכבר הזריק עם pTol2-krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: eGFP וmRNA transposase בשלב תא אחד. תמונות צולמו לאחר 6 שעות של אינדוקציה 4-OHT (א) להציג לרוחבו של אזור הסנפיר ב -6 שעות שלאחר טיפול, מראה כתמי G12V eGFP-HRAS לבטא בתאי עור (חץ), וlysC:. DsRed2 + נויטרופילים (ראש חץ). (BC) נציג תמונות taקן מסרט הזמן לשגות confocal, מראה נויטרופילים (אדום) אינטראקציות עם תאי G12V eGFP-HRAS להביע עור (ירוק). (ב) תא preneoplastic יוצר סיומת filopodial קצרה עם נויטרופילים (ראש החץ) פנייה. (C) נויטרופילים (אדום) נמצא בקשר קרוב לשיבוט של תאי עור preneoplastic (ירוק). בר סולם ב= 100 מיקרומטר; B / C = 50 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52107/Video_1.mov" target="_blank">1 וידאו:</a> הדמיה לחיות זמן לשגות של אינטראקציה תא חיסון preneoplastic והמולדת. זמן לשגות של 4 DPF Tg (כטב&quot;מ: eGFP-HRAS G12V; lysC: dsRed2) עובר, הוזרק לי pTol2-krt4: T2 KalTA4-ER; cmlc2: eGFP וmRNA transposase בשלב תא אחד. סרט הזמן לשגות Confocal ב 6-9 הואורס לאחר 4-OHT אינדוקציה מראה lysC: נויטרופילים dsRed2 + (אדום) אינטראקציות עם תאי G12V eGFP-HRAS להביע עור (ירוק). נויטרופילים להעביר ליד ותחת תאי preneoplastic ולהסיר שאריות של תאי preneoplastic שעוברים אפופטוזיס. מרווחי זמן לשגות של 1.5 דקות על פני 3 שעות עם גדלי צעד ערימת Z של 1.3 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin at JoVE.com

הדמיה חיה של אינטראקציות מולדות של תאים חיסוניים וקדם-נאופלסטיים באמצעות מערכת ביטוי Gal4/UAS מושרה בעור דג הזברה הזחל | ביולוגיה התפתחותית | וִידֵאוֹ

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

לומד את האירועים המוקדמים ביותר של התפתחות תא preneoplastic ואינטראקציה תא חיסון מולדת הוא מרכזי להבנה ולטיפול בסרטן. כאן אנו מתארים שיטה לגרום לתנאי תמורות תאי אפיתל והדמית החיה הבאה של אינטראקציה תא חיסון מולדת עם G12V HRAS לבטא בתאי עור בזחלי דג הזברה.

הדמיה חיה של אינטראקציות תא של מערכת חיסון המולדת וPreneoplastic שימוש מערכת ביטוי / כטב&quot;מ העין מתנהלת Gal4 בעור הזחל דג הזברה

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

live-imaging-innate-immune-preneoplastic-cell-interactions-using-an

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Human Biology

Immune System

SCIENTISTS IN ACTION

11.8K Views.  The University of Edinburgh.  לומד את האירועים המוקדמים ביותר של התפתחות תא preneoplastic ואינטראקציה תא חיסון מולדת הוא מרכזי להבנה ולטיפול בסרטן. כאן אנו מתארים שיטה לגרום לתנאי תמורות תאי אפיתל והדמית החיה הבאה של אינטראקציה תא חיסון מולדת עם G12V HRAS לבטא בתאי עור בזח?...

Video: Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

מעקב תאים דג הזברה GFP מהונדס שימוש במערכת photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

בדיקת גודל הכבד בזחל זברה באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

ביטוי GFP המושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...