המחברים מבקשים להודות וללהכיר במועצה למחקר הרפואית למימון מחקר זה - G1000788-98812 קוד מענק MRC-DPFS.

ייצור ועיקור 1.Scaffold <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר PCL ב1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol לתת 10% w / v ריכוז. כפי שתואר בוסוורת &#39;ואח&#39;, 9 electrospin פתרון פולימרים (הפרמטרים: 20 kV, 1 מיליליטר / שעה, 20 סנטימטרים). ולאסוף מיושר סיבים על קצה mandrel מסתובב (600 סל&quot;ד). עם אזמל להסיר את הסרט של סיבים שנאספו ואז לחתוך לאורכים קצרים יותר - 3 סנטימטר (לשקתות וכלי סיבוביים) ו- 4 סנטימטר (לתרבית תאים מוסיף) אורכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים קנס להטביע רצועות בודדות במים מזוקקים ולהסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק שני הקצוות בין האגודל לאצבע; לסובב ידני את הרצועה עד שדומה חוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לצלול הפיגום דמוי חוט הזה במים מזוקקים ומניח על אי-סיבי כרטיס נקי, לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שיבש מקום, בנפרד בצינורות microcentrifuge נקיים ולהוסיף 1 מיליליטר של 50% אתנול v / v במים מזוקקים. סגור את המכסים ולהשאיר למשך 24 שעות. הערה: בצע את השלבים תחת זרימה למינרית הבאה: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינורות microcentrifuge בזרימה למינרית ולשאוב את פתרון v / v 50%. החלף עם 1 מיליליטר אתנול 70% v / v במים מזוקקים, קרובים מכסים ומשאירים למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור 90% ו 100% אתנול v / v במים מזוקקים (1 מיליליטר כרכים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פיגומי פעמיים עם תמיסת מלח פוספט (PBS), 24 שעות לכל לשטוף (2 x 1 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS ולהחליף עם תקשורת ותרבות תא 1 מיליליטר. הערה: פיגומים מוכנים לשעת שימוש לאחר 24. </li></ol> 2. קביעת שטח פן פיגום ומספר התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת ההדמיה מיקרוסקופ ואור, למדוד את הקוטר של חוט electrospun לאורכו כדי לקבוע ערך ממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תניח חוט להיות מוט גלילי ולהתקרב לשטח פנים באמצעות: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפה פני שטח =, r = רדיוס וh = אורך הערה: השטח היה מחושב להיות 18902, 800 מיקרומטר 2. יתר על כן, יש לציין כי השטח בפועל יהיה גדול יותר מחישוב זה כחוט מורכב ממאות סיבים עדינים, אשר יגדילו את שטח הפנים. כתוצאה מכך מספר גדול יותר של תאים צריך להיות מסוגל לצרף אל הגרדום. עם זאת, זה לא משפיע על השוואה ישירה בין קבוצות בדיקה שנעשית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המספר המרבי של תאים שיכולים לצרף אל פני השטח הפיגום נחשף על ידי: הערה: שימוש בתוכנת מיקרוסקופ והדמיה אור, הקוטר של תאי גזע mesenchymal האדם היה נחוש להיות 20 מיקרומטר (תאי הנחה הם עגולים), ולכן במקרה זה, מספר התאים = 60200. </li></ol> 3. פיגום Set-up - Cell תרבות תוספות (איור 1 א) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הזרימה למינרית, לפתוח את התרבות מוסיף תא 6-גם סטרילי ולהפריד את הטבעות קצרות עם שיניים מהגופים רחבות מוקפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הטבעת עם שיניים מצביעות כלפי מעלה. לעטוף אחדשל פיגומי 4 סנטימטרים מעל מרכז הטבעת לוודא שזה חופף בשני הצדדים. קח את הגוף ועמדה מוקפים על טבעת השיניים ופיגום ולדחוף כלפי מטה כדי לוודא שהפיגום נשאר בעמדה והשקרים דרך המרכז של להכניס את תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום להכניס תרבית תאים עם פיגום לתוך הבאר של היטב 6, צלחת מחייבת נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של תקשורת בתרבות לפיגום. </li></ol> 4. פיגום Set-up - שוקת (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הזרימה למינרית, פולי המקום (tetrafluoroethylene) (PTFE) שקתות לצלחות פטרי אישיות ולהוסיף 10 מיליליטר של תקשורת בתרבות לשוקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים לעטוף אחד 3 פיגומי סנטימטרים לתוך השוקת, כדי לוודא שאורכו נמצא במקביל לקצה הארוך של השוקת. </li></ol> 5. פיגום Set-up - כלי Bioreactor (איור 1 ג) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת הזרימה למינרית, להפריש 10 מיליליטר PBS סטרילי באמצעות כלי של bioreactorנמל ועיקרי להשאיר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS ולהחליף עם תקשורת והתרבות 8 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, להכניס אחד מפיגומי 3 סנטימטר לתוך הכלי דרך היציאה הראשית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הנמל הראשי. </li></ol> ספירת 6. Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות אנושיים גזע mesenchymal (hMSC) נגזרים ממח עצם על פי פרוטוקול עד למעבר 4 לפני קציר יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מסנטימטר 75 2 בקבוק המכיל hMSCs נגזר ממח עצם (קטע 4, confluency 80%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS ולשאוב 10 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר טריפסין ודגירת הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד התאים וחילצה ממשטח הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 מיליליטר תקשורת ותרבות כדי להשבית את האנזים ולהעביר נפח זה כולל (10 מיליליטר) לצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend השעיה תא זה על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים כדי לפזר הומוגנית תאים בתוךתקשורת וagglomerates תא גבול (10 פיפטה מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 20 μl של השעיה תא והעברה לhaemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את haemocytometer תחת מיקרוסקופ אור ותמונה במטרת x10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס קווי הרשת ולספור את מספר התאים ב4 x 4 ריבועים בכל פינה של הרשת ואשר נופלים בתוך הריבוע ואלה החוצים את יד ימין או קו גבול תחתון. רוזן לכל סט של 4 x 4 ריבועים (4 סעיפים לרשת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ספירת resuspension ותא שלוש פעמים (שלבים 6.6-6.9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את ספירת תאים הממוצעת ולקבוע את עוצמת הקול של מדיה הנדרשת לresuspension תא (תא ריכוז 60200 ב -200 μl). לדוגמא, לקבוע את ספירת תאים הממוצעת מhaemocytometer ולאחר מכן לקבוע את המספר הממוצע הכולל של תאים משלושה סעיפים נפרדים. תכפיל את זה ב 1 x 10 4 לתת מספר התאים למ&quot;ל, ואז להכפיל בנפח הכולל של השעיה תא לתת למספר הטל של תאים. השתמש בנוסחא הבאה כדי לקבוע נפח של תקשורת הנדרשת לresuspension: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב241 XG במשך 5 דקות. </li></ol> זריעת 7. Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מצינור centrifuged עוזב את התא גלולה ולהחליף עם מחושב נפח התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים והתקשורת אפילו לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה Gilson P200, לוותר לאט 200 μl של השעיה תא על כל פיגום על ידי הפעלת קצה פיפטה לאורך הפיגום ומתחת לפני השטח הנוזלי תקשורת. השאר באין מפריע במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכלי bioreactor, לוותר 200 μl של השעיה תא דרך היציאה הראשית. Top-עד התקשורת נותרה 2 מיליליטר התרבות דרך יציאות המזרק כדי לתת נפח כולל של 10 מיליליטר. </li></ol> 8. ניסויי התחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כלי bioreactor לbioreactor RCCS-4DQ ולהגדיר כדי לסובב בשעה 9 בסל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טראןספיר הצלחות גם עם התרבות מוסיף תא ושקתות לצלחת שייקר ולהגדיר כדי לסובב ב 30 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחות גם עם התרבות מוסיף תא ושקתות למדף של חממת תא נקבעה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (תרבות סטטית). </li></ol> 9. DNA Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות - מאגר תמוגה, מאגר 1x TE, תקני ה- DNA ופתרון עובד DNA תא - בהתאם להנחיות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 שעות, להסיר את הדגימות מהחממה ולמקם תחת הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השברים תקשורת מכל המדגמים ומניח בצינורות צנטריפוגה שכותרתו בנפרד. צנטריפוגה הצינורות 241 XG. הסר את supernatant ולהוסיף למאגר תמוגה 3 מיליליטר. Resuspend הפתרון להתפרקות התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים להסיר את הפיגומים ומקום בצינורות צנטריפוגה המכילים 3 מיליליטר חיץ תמוגה (לפיגומים בתוך כלי bioreactor, להסיר את הפיגום לפני aspiratingקוטר). לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא, לשחרר ראשון פיגום על ידי חיתוך הפיגום בסמוך לשפת של insert באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיליליטר של חיץ תמוגה לכל כלי קיבול פיגום ולגרד את פני השטח (במרץ להתסיס לכלי bioreactor). הסר את מאגר תמוגה ומניח בצינורות צנטריפוגה שכותרתו בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת כל צינור צנטריפוגות במשך כ 1 דק &#39;על מנת להבטיח תסיסה מספקת של התאים וחיץ ולעודד תמוגה של קרום התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת גם שחורה 96, להוסיף למאגר תמוגה 100 μl לכל חלק מדגם - פיגום, תקשורת וגם (לשכפל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחושך, להוסיף של פתרון ה- DNA תא 100 μl לכל הבארות המכילות מאגר תמוגה ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל בארות עם חיץ תמוגה מכיל לא פתרון ה- DNA ו- DNA של התאים כדי לספק שליטה שלילית וחיובית לצלחת גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בצלחת-קורא הקרינה, למדוד את הספיגה של הבארs באמצעות 485 ננומטר עירור ופליטת 520 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשוות את הנתונים עם עקומת הסטנדרט שנוצרה מתקני ה- DNA על פי הוראות היצרן. </li></ol> 10. סריקת אלקטרונים מיקרוסקופ קיבוע (SEM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים תחת זרימה למינרית: לאחר 4 שעות, להסיר את כל הפיגומים מהקיבול והמקום שלהם בתוך צלחת 6-היטב חדשה (בארות נפרדות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים על הספסל הפתוח: כל אחד היטב, להוסיף 2 מיליליטר של 1.5% glutaraldehyde v / v בPBS, כדי להבטיח כיסוי של הפיגום מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הצלחת למשך 30 דקות מינימום ב 4 מעלות צלזיוס במשך קיבוע תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון מקבע ולשטוף את הפיגומים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את הפיגומים עם הגדלת ריכוזים של אתנול במים מזוקקים מתחילה עם 50% v / v, ואחריו 70% v / v ו- 90% v / v. עבור כל ריכוז, submerse מלא הפיגומים בsolution (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 3 דקות. מחק את הפתרון וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליבש באתנול 100% על ידי submersing מלא הפיגומים בפתרון (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 5 דקות. מחק את הפתרון וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימי לייבש את הפיגומים באמצעות hexamethyldisilazane (HMDS) בתוך ארון קטר. לטבול את הפיגומים בHMDS (2 מיליליטר) ולהשאיר למשך 5 דקות. הסר את HMDS וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את HMDS ולאפשר הפיגומים לייבוש. הר הפיגומים של ספחי SEM זמינים מסחרי (במקרה זה ספחי נירוסטה עם כרטיסיות פחמן דבק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקל על הצפייה בSEM, מעיל הדגימות באמצעות coater זהב-גמגום למשך 2 דקות על מנת להבטיח כיסוי דק ואפילו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מקום בתוך SEM ולדמיין את פיגומי תא זרע באמצעות קרן אלקטרונים 5 קאב. </li></ol>

<ol>
	<li>Jauregui, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+to+biomaterials.+The+role+of+several+extracellular+matrix+components+in+the+attachment+of+non-transformed+fibroblasts+and+parenchymal+cells.">Cell adhesion to biomaterials. The role of several extracellular matrix components in the attachment of non-transformed fibroblasts and parenchymal cells.</a> ASAIO transactions/American Society for Artificial Internal Organs. 33 (2), 66-74 (1986).</li><li>Puca, A., Russo, G., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+Mechano-Transduction+via+Simulated+Microgravity+and+its+Effects+on+Intracellular+Trafficking+of+VEGFR's.">Properties of Mechano-Transduction via Simulated Microgravity and its Effects on Intracellular Trafficking of VEGFR's.</a> Oncotarget. 3 (4), 426 (2012).</li><li>Vincent, L., Avancena, P., Cheng, J., Rafii, S., Rabbany, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+impairs+leukemic+cell+survival+through+altering+VEGFR-2/VEGF-A+signaling+pathway.">Simulated microgravity impairs leukemic cell survival through altering VEGFR-2/VEGF-A signaling pathway.</a> Annals of biomedical engineering. 33 (10), 1405-1410 (2005).</li><li>Rungarunlert, S., Klincumhom, N., Tharasanit, T., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Turning+Lateral+Vessel+Bioreactor+Improves+Embryoid+Body+Formation+and+Cardiogenic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells.">Slow Turning Lateral Vessel Bioreactor Improves Embryoid Body Formation and Cardiogenic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Cellular Reprogramming. 15 (5), 443-458 (2013).</li><li>Wu, X., Li, S. H., Lou, L. M., Chen, Z. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effect+of+the+Microgravity+Rotating+Culture+System+on+the+Chondrogenic+Differentiation+of+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells.">The Effect of the Microgravity Rotating Culture System on the Chondrogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells.</a> Molecular biotechnology. 54 (2), 331-336 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotating+Microgravity-Bioreactor+Cultivation+Enhances+the+Hepatic+Differentiation+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+on+Biodegradable+Polymer+Scaffolds.">Rotating Microgravity-Bioreactor Cultivation Enhances the Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells on Biodegradable Polymer Scaffolds.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (21-22), 2376-2385 (2012).</li><li>Lv, Q., Deng, M., Ulery, B. D., Nair, L. S., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-ceramic+Composite+Scaffolds+for+Bioreactor-based+Bone+Engineering.">Nano-ceramic Composite Scaffolds for Bioreactor-based Bone Engineering.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 471 (8), 2422-2433 (2013).</li><li>Hammond, T. G., Hammond, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+suspension+culture:+the+rotating-wall+vessel.">Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 281 (1), F12-F25 (2001).</li><li>Bosworth, L. A., Alam, N., Wong, J. K., Downes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+2D+and+3D+electrospun+scaffolds+intended+for+tendon+repair.">Investigation of 2D and 3D electrospun scaffolds intended for tendon repair.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 24 (6), 1605-1614 (2011).</li><li>Dormer, N. H., Qiu, Y., Lydick, A. M., Allen, N. D., Mohan, N., Berkland, C. J., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+stromal+cells+in+hydroxyapatite-loaded+microsphere-based+scaffolds..">Osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in hydroxyapatite-loaded microsphere-based scaffolds..</a> Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 757-767 (2011).</li><li>Rayatpisheh, S., Heath, D. E., Shakouri, A., Rujitanaroj, P. O., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+cell+sheet+technology+and+electrospun+scaffolding+for+engineered+tubular,+aligned,+and+contractile+blood+vessels.">Combining cell sheet technology and electrospun scaffolding for engineered tubular, aligned, and contractile blood vessels.</a> Biomaterials. 35 (9), 2713-2719 (2014).</li><li>Wismer, N., Grad, S., Fortunato, G., Ferguson, S. J., Alini, M., Eglin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+electrospun+scaffolds+for+annulus+fibrosus+tissue+engineering:+effect+of+scaffold+structure+and+composition+on+annulus+fibrosus+cells+in+vitro.">Biodegradable electrospun scaffolds for annulus fibrosus tissue engineering: effect of scaffold structure and composition on annulus fibrosus cells in vitro.</a> Tissue Engineering Part A. (3-4), 672-682 (2014).</li><li>Yavin, E., Yavin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+and+culture+of+dissociated+cells+from+rat+embryo+cerebral+hemispheres+on+polylysine-coated+surface.">Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface.</a> The Journal of cell biology. 62 (2), 540-546 (1974).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guan,+of+focal+adhesion+kinase+with+its+potential+substrate+phosphatidylinositol+3-kinase.">Guan, of focal adhesion kinase with its potential substrate phosphatidylinositol 3-kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (21), 10148-10152 (1994).</li><li>Grant, D. S., Tashiro, K. -. I., Segui-Real, B., Yamada, Y., Martin, G. R., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+different+laminin+domains+mediate+the+differentiation+of+human+endothelial+cells+into+capillary-like+structures+in+vitro.">Two different laminin domains mediate the differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures in vitro.</a> Cell. 58 (5), 933-943 (1989).</li><li>Carrier, R. L., Papadaki, M., Rupnick, M., Schoen, F. J., Bursac, N., Langer, R., Freed, L. E., Vunkaj-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+tissue+engineering:+cell+seeding,+cultivation+parameters,+and+tissue+construct+characterization.">Cardiac tissue engineering: cell seeding, cultivation parameters, and tissue construct characterization.</a> Biotechnology and bioengineering. 64 (5), 580-589 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מטריצות סיבי electrospun מפוברקות מbiopolymers משמשות באופן קבוע כדי לתמוך מצורף תא ושגשוג עבור יישומים ביולוגי ו / או הנדסת רקמות 11,12. במקרים אלה, המטריצות הן לעתים קרובות סדינים דקים של סיבים בקלות לכסות את כל הבסיס של צלחת גם תרבית תאים ובכך נמצאים בקשר מלא עם תאי זרע אשר משפר מצורף תא. עם זאת, אם הפיגום הביולוגי אינו מכסה את הבסיס של הצלחת גם באופן מלא, יש סיכוי גבוה שחלק גדול מתאי זרע לא יישאר במגע עם הפיגום וסופו של דבר לא תוכל לצרף. מחקר זה בדק כמה שיטות שונות לזריעת תאים על פיגומים שאינך מכסים את הבסיס של הצלחת גם, על מנת לקבוע טכניקה מותאמת שיכול להיות מומלצת לניסויים מבוססי תאי עתיד. חמישה סט-אפים שונים נחקרו (איור 1): scaffoLDS (חוט electrospun) שנערך באמצעות מוסיף תרבית תאים בתוך צלחות גם מחייב נמוכים וגם כל הזמן תחת תנאים סטטיים או מזועזע ליום 30 בסל&quot;ד; פיגומים ממוקמים בתוך שקתות PTFE צרות והחזיקו סטטי או מזועזעים ליום 30 בסל&quot;ד; ופיגומים שוכנו בתוך כלי bioreactor מסתובבים בסל&quot;ד 9. קביעת מספר התאים שדבקו בחוטי electrospun ידי assay DNA הוכיח אחוז נמוך של קובץ מצורף לכל להגדיר קופצים זריעה (איור 2); וזה אושר גם מסריקת micrographs אלקטרונים (SEM) (איור 3). קובץ מצורף גדול תא - 30% או ~ 18060 תאים ד&quot;ר גינזבורג נצפה לחוטים שהוחזקו בתוך התרבות מוסיף תא ונתונים לתנועה רציפה. מעניין, קובץ מצורף הנמוך ביותר תא (15%) הושג עבור חוטים שנערכו על ידי התרבות מוסיף תא אבל כל הזמן תחת תנאים סטטיים, אשר הייתי מציע כי הכללת תנועת רדיאלי יש השפעה חיובית על שמירת תאים במגע עם הפיגום. עם זאת,יש לציין כי מלקחיים רציפים של הזרימה של התקשורת עשויים להיות אחראים לagglomerates התא נצפה מתמונות SEM. הצלחת שייקר נקבעה על ההגדרה הנמוכה ביותר שלה - 30 סל&quot;ד - אשר יכולה להיות מגבלה להגדרה זו. בתנועות איטיות רדיאלי עשויה לעזור למנוע או להפחית את מסכת תא וגם יכול לשפר מצורף תא כמו תאים חווים פחות כוח. ניסויים עתידיים צריכים להתמקד באופטימיזציה של המהירות שייקר האידיאלית עבור קובץ מצורף תא משופר. שילוב תנועה לחוטים שנערכו בתוך השקתות לא הביא למגמה דומה, עם שני תרחישי מניב קובץ מצורף 18% (~ 10836 תאים); למרות שזה יכול להיות בגלל הציפה החלקית של הפיגומים בתוך השקתות (נצפה לשקתות מונחות על הצלחת שייקר) כפי שהם אינם מעוגנים לבסיס. צף חלקי של הפיגום ימנע את כל תאים ששקעו לתחתית השוקת מלבוא במגע עם החומר והדבקות. לtההגדרה המסוימת שלו, השוקת שכנה בתוך צלחת פטרי וסך הכל 10 מיליליטר נפח התקשורת הוסיף. הממדים הקטנים של השוקת אומר כי הרוב המכריע של התקשורת קיים בתוך צלחת פטרי ואם יש תנועה, תאים עשויים להתרחק מן השוקת לצלחת פטרי ולהישאר לגמרי מחוץ להישג ידם של הפיגום. כדי להתגבר על מגבלות אלה, ניסויים נוספים צריכים לכלול צעד נוסף בפרוטוקול, לפיה את הקצוות של הפיגומים שהוצמדו לבסיס של השקתות באמצעות קנס-מחטים סטריליות, כיוון שזו צריכה למנוע הציפה והתנועה (במיוחד שלהם לפיגומים החשופים ל תנועת רדיאלי), שסופו של דבר צריך להוביל לעלייה במספר התאים הקשורים בפיגום. 16% מתאים שמחוברים לחוטים הנוכחיים בתוך כלי סיבוביים. למרות היותו טכניקה מבוססת היטב לתרבות 3D, בעיות לא מתעוררות עם הסרת פיגומים מהנמל העיקרי של כלי, אשר עשויים להסתיים באופן רופף ATTACתאי הד לאיבוד. כלי שניתן לפתוח באופן מלא היה למנוע את הבעיה; אלה זמינים לרכישה, אבל הם הרבה יותר יקרים מאשר כלי חד פעמי המשמשים במחקר זה. מחקר זה מדגים את הבעיות הנוכחיות עם זריעת פיגומים שאינם מכסים את כל הבסיס של צלחות גם תרבית תאים סטנדרטית. זריעת מספר תא ידוע הביאה פחות מ מצרף שלישית לפיגום, למרות שטח הפנים של הפיגום המאפשרים לכל התאים לדבוק. לכך יכולה להיות השלכות מזיקות במבחנים מבוססי תאים אחרים שעשויים להעריך את ההתאמה הביולוגית ותא-חומר / תאי תאי ההתנהגות ואינטראקציות עם הפיגום כהתקן רפואי עתידי אפשרי. מגבלות נוספות של המחקר עשויות לכלול את נקודת זמן 4 שעות - למרות היותו מספיק זמן כדי להבטיח זריעת תאים ראשונית (תאים הוכחו לצרף היטב למצעים בתוך שלושים דקות 13,14,15), זה עשוי להיות סביר בvestigate נקודות הזמן מאוחר יותר מתן תאים אינם מתרבים במסגרת זמן ארוכה יותר כמו זה שאחרת להטות את מספר התא מתחיל. הקטנת הנפח של תקשורת, במקרה זה 10 מיליליטר, יכול גם לשפר את הקשר בין התאים והפיגום וסופו של דבר להגדיל את קובץ מצורף תא. מחקרים עתידיים צריכים לקחת בחשבון גם את כדאיויות תא כתהליך של זריעת תאים יכול לגרום לניזק לתאים ו / או תא מות 16. מבחני DNA התא אינם מבחינים בין תאי קיימא ולא ברי קיימא, כמו assay מת / כגון חי, למשל, הייתי להדגיש את רמת הכדאיות. חקירה זו מעלה את מודעות למספר האמיתי של תאים שמייחסים לפיגום למרות זריעת כמות ידועה. ללימודים המסתמכים על מספר ההתחלה של תאים, חשוב מאוד שחוקרים יודעים בדיוק כמה של דמות שאכן לדבוק במצע של עניין.

פיגומים באופן שיגרתי בשלבי פיתוח ומחקר ליישומים ביולוגי והנדסת רקמות. ככזה, הם זורעים בדרך כלל עם תאים וההתנהגות במבחנה שלהם מאופיינים באמצעות מבחני הקובעים שגשוג תאים ומספר תא, למשל. בניסויים כגון אלה, קיימים הכרח כי מספר התאים הראשוני ידוע ולעתים קרובות חוקרים לקבוע את ריכוז הזריעה במונחים של מספר התאים למ&quot;ל או 2 סנטימטר. בזמן הזה הוא תרגול טוב, בעיקר למטרות בהיקף של עד, זה אינו לוקח בחשבון את המספר האמיתי של תאים שידבקו אל פני השטח הפיגום (שהוא גם תלוי במאפייני ההדבקה של פני השטח הביולוגי 1). הדבר נכון במיוחד עבור פיגומים שאינם מכסים את כל הבסיס של הצלחת גם תרבית התאים כמו תאים עלולים ליפול מהמבנה ו, בשל האופי לעתים קרובות סטטית של הניסוי, ייתכן שלעולם לא יחזרו במגע עם החומר של inteשאר. חוטי electrospun סיבים הם דוגמא טובה של פיגום שאינו מכסה את הבסיס של הבאר (איור 1 א). במקרה זה, יש להשתמש בצלחות גם מחייב נמוכים שלא היו שטופל פני השטח כדי למנוע מתאים הקשורים בשטח של הצלחת ולכן מעוותים את התוצאות של assay כל מבוסס היטב. הצלחות גם משמשות בקלות לזריעת תאים על פיגומים, אבל הם לא השיטה היחידה זמינה. מערכות תרבית תאי רוטרי, סוג של bioreactor שפותח על ידי החטיבה למדעי החיים בנאס&quot;א בשנת 1980 מאוחר, יכולות לשמש באופן דומה לזרע פיגומים בסביבה תלת-ממדית (3D) עם כביד מדומה. סוג זה של bioreactor עדיין בחירה פופולרית עם חוקרים ברחבי העולם וכבר שולב במחקרים לתא איתות 2,3, תאי גזע והנדסת רקמות 4,5 6,7. מה שעושה את bioreactor הסיבובי עדיף על צלחות גם הוא התחזוקהשל סביבת 3D, אשר מסייעת במניעת תאים מובחנים מdedifferentiating, כפי שקורה לעתים קרובות כאשר בתרבית בתוך תנאי 2D קונבנציונליים 8. מאמר זה חוקר טכניקות שונות לזריעת תאי גזע mesenchymal אנושיים על פולי electrospun (ε-caprolactone) חוטי סיבים כמפוברקים בוסוורת &#39;et al., 9 במטרה למקסם את המספר הראשוני של תאים הקשורים בפיגומים האלה בתוך תקופה של 4 שעות. לתרבות 2D, חוטים נערכו באופן מאובטח בתוך צלחות גם או פולי מחוייט (tetrafluoroethylene) שקתות (PTFE) והמשיכו בתנאים סטטיים, או מזועזע ליום 30 בסל&quot;ד. לתרבות 3D, חוטים ותאים הוחזקו בתוך כלי bioreactor מסתובבים בסל&quot;ד 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>in-house supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1117271000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>70013016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-12974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC culture media</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-28010B</td>
			<td>Warmed to 37 oC before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement mix</td>
			<td>PromoCell GmbH</td>
			<td>C-39810</td>
			<td>Add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/antimyotic mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td>Add to culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.05 %) EDTA (0.02 %)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59417C</td>
			<td>Warmed to 37 oC before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks (T75)</td>
			<td>Becton Dickinson Ltd</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding 6-well plates</td>
			<td>Costar Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well CellCrowns</td>
			<td>Scaffdex</td>
			<td>C00003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dish 50 ml deep</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE troughs</td>
			<td>in-house production</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable RCCS vessels 10 ml</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>D-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 Vessel Rotary Cell Culture System bioreactor</td>
			<td>Synthecon</td>
			<td>RCCS-4DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker plate</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SSM1</td>
			<td>Mini Orbital Shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td>Digital Bio</td>
			<td>DHC-F01</td>
			<td>Disposable C-Chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>352096, 429901</td>
			<td>15 ml and 50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>Rotafix 32 A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 3 ml</td>
			<td>Shield Medicare Ltd</td>
			<td>3039820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>40305, 47310, 40125</td>
			<td>5, 10 and 25 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson pipettes</td>
			<td>SLS</td>
			<td>F144801, F144802, F123600, F123601, F123602</td>
			<td>P2 - P1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>SLS</td>
			<td>PIP7852, PIP7834, PIP7840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro test tube 1.5 ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125.15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoGreen Assay</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td>Assay set-up in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 96-well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent plate-reader</td>
			<td>BGM Labtech</td>
			<td>FLUOstar Optima</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde 25 %</td>
			<td>TAAB Laboratories</td>
			<td>G002</td>
			<td>Made to a concentration of 1.5 % v/v in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexamethyldisilazane (HMDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>999-97-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium stubs (SEM)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>G301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon tabs (SEM)</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>G3347N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold sputter coater</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>S150B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope (SEM)</td>
			<td>Phenom World</td>
			<td>Phenom Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimizing attachment of human mesenchymal stem cells on poly(&#949;-caprolactone) electrospun yarns

מחקר לביו-חומרים והנדסת רקמות לעתים קרובות כולל במבחנה חקירות מבוססות תאים, אשר דורשות ידע ראשוני של מספר התאים מתחיל. בעוד חוקרים נפוצים התייחסות צפיפות הזריעה שלהם זה לא בהכרח מצביע על המספר האמיתי של תאים שדבקו בחומר מדובר. הדבר נכון במיוחד במקרה של חומרים, או פיגומים, שאינך מכסים את הבסיס של צלחות גם תרבית תאים סטנדרטית. מחקר זה חוקר את הקובץ המצורף הראשוני של תאי גזע אנושיים mesenchymal זורעים במספר ידוע על פולי electrospun (ε-caprolactone) חוט לאחר 4 שעות בתרבות. חוטי electrospun הוחזקו בתוך כמה סט-אפים שונים, כוללים כלי bioreactor מסתובבים בסל&quot;ד 9, תרבות מוסיף תא ממוקם בצלחות נמוכות מחייבות היטב וpolytetrafluoroethylene שקתות (PTFE) ממוקמים בתוך צלחות פטרי. שני האחרונים היו נתונים לשני תנאים סטטיים או מיקומו על צלחת שייקר (30 <spastyle = &quot;font-size: -14 פיקסלים; קו-גובה: 28px;&quot; n&gt; סל&quot;ד). לאחר דגירה 4 שעות ב 37 מעלות צלסיוס, 5% CO 2, המיקום של תאים שנזרעו נקבע על ידי assay DNA תא. פיגומים הוסרו מאריזותיהם והניחו במאגר תמוגה. חלק התקשורת הוסר באופן דומה וcentrifuged - supernatant מושלך וגלול נפרד מאגר תמוגה. תמוגה חיץ נוסף לכל כלי קיבול, או גם, וגרד לשחרר את כל תאים שעלולות להיות נוכח. Assay DNA התא נקבע אחוז התאים הנוכחיים בתוך הפיגום, התקשורת והשברים היטב. קובץ מצורף תא היה נמוך לכל הסט-אפ ניסיוני, עם קובץ מצורף הגדול ביותר (30%) לחוטים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא ונתונים לרועדים תנועה. מחקר זה מעלה את מודעות למספר האמיתי של תאים הקשורים בפיגומים בלי קשר לצפיפות זריעת תא המוצהרת.

התוצאות מדגישות את מיקומם של התאים הבאים שלאחר זריעה 4 שעות לכל ניסיוני הגדרה נחקרו. איור 2 א ממחיש את אחוז התאים שמחוברים אל פני השטח הפיגום בתקופה זו. גורם המרה של 8.5 pg / תא משמש להמרת תוכן DNA נמדד במספר תא ובכך לקבוע את אחוז התאים 10. לכל להגדיר קופצים הזריעה נחקר, אחוז המצורף תא הוא נמוך יחסית, עם דבקות הגדולה תא (30%) לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא ומזועזע ליום 30 בסל&quot;ד (הכנס אכר). הדבקות הנמוכה ביותר (15%) הייתה לפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא וכל זמן תחת תנאים סטטיים (הכנס סטטי). מספר גדול של תאים נכחו בתוך שבריר התקשורת (איור 2), בעיקר לתרבות מוסיף תא שנערך בתוך צלחות נמוכות מחייבות (הכנס סטטי) וכלי סיבוביים להיות 50% ו- 51%בהתאמה. פיגומים שנערכו בתוך השקתות הפגינו מספר גדל מתאים קיימים בתוך המחזיק עצמו - 48% מתאים לשוקת שאכר ו -50% לשוקת סטטי. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אפשר הערכה חזותית של פיגומי תא-זרע (איור 3). נציג תמונות מודגשות נוכחות מוגבלת של תאים על פני השטח הסיביים, ללא קשר לזריעת הגדרה. עם זאת, מספר גדול יותר של תאים והתא agglomerates נכחו על הפיגומים שנערכו בתוך התרבות מוסיף תא ומזועזע ליום 30 בסל&quot;ד (הכנס אכר). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig1.jpg" /> איור 1. ניסיוני סט-אפ, שבו electrospun חוט מוחזק במסגרת; (א) מוסיף תרבית תאים וצלחת גם מחייב נמוך; פולי (B) (tetrafluoroethylene) שוקת (PTFE) וצלחת פטרי; ו(ג) כלי bioreactor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52135/52135fig2.jpg" /> מיקום 2. איור של תאים 4 שעות Post-זריעה על PCL electrospun חוטים באמצעות הגדר קופצים זריעה שונה. () מדגים את אחוז התאים שצורפו לפיגום PCL (ממוצע ± סטיית תקן); (ב) מדגיש את התפשטות אחוז מיקום תא בתוך שלושה שברים - תקשורת, גם ופיגום (n = 4, הנתונים שהוצגו כ אומר ערכים). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,135 / 52135fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3. הנציגים micrographs אלקטרונים סורק עבור PCL חוטים electrospun עם תאי גזע mesenchymal האדם, 4 שעות לאחר זריעה ראשונית באמצעות ניסיוני סט-אפים שונים. (כל התמונות בהגדלה 1,000X, סרגל קנה מידה = 130 מיקרומטר.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52135/52135fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on PolyÎµ-caprolactone Electrospun Yarns at JoVE.com

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&amp;#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

optimizing-attachment-human-mesenchymal-stem-cells-on-poly

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

9.6K Views.  The University of Manchester. This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Video: Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

בידוד של גזע Mesenchymal מן האדם קרום העצם מכתשיים ואפקטים של ויטמין D על פעילות Osteogenic של תאים נגזר קרום העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used techniques for the development of in vivo cancer models have considerable limitations. Therefore, in this study, we aim to implement cell sheet technology to develop an in vivo cancer model. Hepatocellular carcinoma (HCC) is successfully developed in nude rats using cell sheets created from HCC cell line cells. The cancer cell sheets are generated through intracellular adhesion and the formation of a stratified structure, controlled by the extracellular matrix. This allows for the HCC sheet transplantation into the liver and the creation of a tumor-bearing animal model within a month. In addition, the role of mesenchymal stem cells (MSC) in the development of this cancer model is investigated. In addition to the HCC cell line sheet, another two cell sheets are created: a sheet of HCC cells and bone marrow MSCs (BMMSCs) and a sheet of HCC cells and umbilical cord MSCs (UCMSCs). Sheets that have a combination of both HCC cells and MSCs are also capable of producing a tumor-bearing animal. However, the addition of MSCs reduces the size of the formed tumor, and this adverse effect on tumor development varies depending on the used MSCs' source. This indicates that a cell sheet made of certain MSC subtypes could be utilized in tumor management and control.

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Here, we present a protocol to develop an in vivo cancer model using cell sheet technology. Such a model could be very useful for the evaluation of anticancer therapeutics.

חקר את הפוטנציאל של תא גזע Mesenchymal גיליון על הפיתוח של קרצינומה Hepatocellular In Vivo

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

ספיגת של חלקיקים חדשים מצופים השומנים, המכיל Falcarindiol על ידי גזע אנושי Mesenchymal

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

במבחנה אינדוקציה של תאי גזע עיסת שיניים אנושית לכיוון שושלות הלבלב

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...