עבודה זו נתמכה על ידי עמיתי American Heart Association Predoctoral כדי JLI ו National Institutes of הית מענק R01AR056624.

א יחיד פולימר Electrospinning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הכנת פתרון electrospinning, להפוך 0.5% wt פתרון של photoinitiator, Irgacure 2959 (I2959), במים deionized ידי המסת על 37 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים. שלב זה אינו הכרחי אם פולימר photoreactive לא נמצא בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים חומצה היאלורונית methacrylated (MeHA, ראה Burdick et al. לסינתזה), פולי (אתילן אוקסיד) (PEO, 900 KDA), ו - I2959 במים deionized להכין פתרון סופי עם ריכוז של 2% wt MeHA, 3% wt PEO, ו 0.05% wt I2959. השתמש מערבולת לערבב עד הפתרון ברור. סוג הפולימר וריכוז, כמו גם בשימוש ממס ניתן לשנות בשלב זה תלוי התכונות הרצויות הפיגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התמיסה לתוך מזרק וצרף מד 18, 6 אינץ&#39; ארוכה, סוף מחט קהה עד הסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנית מזרק משאבה להוציא בשיעור של 1.2 מ&quot;ל / שעה. הכנס את מחט המזרק לתוך המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את ההובלה מקורקע של מקור מתח גבוה חשמל מנגנון האיסוף. כדי לאסוף באופן אקראי סיבים מופץ להשתמש לוחית מתכת שטוחה, או להשתמש mandrel מסתובב ב ~ 10 m / s לאסוף סיבים מיושר. צרף להוביל מטען חשמלי חיובי אל המחט. ראה איור 1 עבור סכמטי של המנגנון electrospinning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המחט או מכשיר לאיסוף, כזה שיש מרחק 15 ס&quot;מ בין השניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את זרימת על משאבת מזרק. כאשר נוזל הוא מדמיין על קצה המחט, להפעיל את מקור הכוח לקבוע את מתח kV 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף תושלם (מתוך מספר דקות עבור שכבות דקות, עד עד 24 שעות על מחצלת עבה), להסיר את הפיגום מן המנגנון אוסף ולאחסן אותו תחת ואקום לילה על מנת להבטיח הסרה מלאה של הממס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את המורפולוגיה סיבים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), פיגום נציג מוצג באיור 1 עבור שני מבנים בציר הבלתי מזדהות. </li></ol> הערה: זרימת קצב דגימה, מרחק למכשיר אוסף, מתח תלויים בשילוב פולימר ממס חייב להיות מותאם עבור כל מערכת, בדרך כלל על ידי התבוננות מורפולוגיה פיגום עם SEM. ב Photocrosslinking ו Photopatterning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור 5mm דגימות X 5 מ&quot;מ מהמזרן הפיגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו crosslinking ידי הצבת כל פיגום על נייר מכוסה שקופיות הזכוכית, הצבת photomask ישירות על הפיגום, עם מכסה זכוכית שקופית נקי גזיר בשני הקצוות עם קליפים קלסר. הערה: ארבעה דוגמאות ניתן לעשות זאת בבת אחת, ללא שקיפות דפוס יכול לשמש crosslinking אם דפוס לא רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר פיגום להגדיר בתא חנקן. חשוב לשמור לבנות ללא חמצן, אשר יכול לעכב crosslinking. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום הפיגום ההתקנה בחדר חנקן תחת ~ 10 mW / cm 2 365 ננומטר אור עם מתאם collimating במשך 5 דקות. ראה סכמטי באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל פיגום ומניחים צלחת 12 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של מים לתוך הבאר deionized כל parafilm את הצלחת על מנת למנוע אידוי של המים מקום 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. להחליף את המים שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו היווצרות נקבוביות תחת מיקרוסקופ אור (ראה לדוגמה איור 2). פיגומים כעת מוכן לשימוש. </li></ol> הערה: Photocrosslinking אינו הכרחי עבור סוגים רבים של פולימרים, אולם photopatterning ניתן להשתמש רק עם פולימרים photoreactive. ג Dual פולימר Electrospinning עם ויזואליזציה פלורסנט Fiber <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 5% wt פתרון של PEO (200 KDA) באתנול 90%. מערבבים בסל&quot;ד 700 ב 50 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות לפני electrospinning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון PEO כדי מזרק ולהוסיף DAPI ריכוז סופי של ריכוז מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​10 בפתרון electrospinning. לעטוף את המזרק בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון אותו תיאר A2 צעד, אלא גם להוסיף methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B (MeRho, 683.24 g / mol) לצורך ריכוז סופי של 25 מיקרומטר בפתרון electrospinning. לעטוף את המזרק בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להשתמש נייר דבק כדי לאבטח coverslips זכוכית methacrylated (ראה Khademhosseini et al.) אל פני השטח של mandrel. הערה: סיבים יהיה קשור coverslips זכוכית methacrylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קצה אחד של פיסת זמן של 5 מ&quot;מ צינורות סיליקון עם קבצים מצורפים luer מנעול אחד מזרקים וחבר את הקצה השני מחט. הכנס את המזרק לתוך משאבת מזרק ולשים את המחט דרך החור האיכר. חזור עם המזרק איכר אחרים באתר ההפך mandrel. האברים לתרגם את length של mandrel ו משמשים כדי להבטיח חלוקה שווה של פולימרים הן הפיגום וכתוצאה מכך. ראה סכמטי באיור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את הפרמטרים שתוארו בסעיף כראוי לפי טבלה 1. ודא טיפים מחט הם התרכזו mandrel. טבלה 1. Dual פולימר Electrospinning פרמטרים <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מזרק </td><td> האיכר אל המחט עצה (ס&quot;מ) </td><td> מחט עצה כדי mandrel (ס&quot;מ) </td><td> קצב הזרימה (מ&quot;ל / שעה) </td><td> יישומי מתח (kV) </td></tr><tr><td> MeHA </td><td> 6 </td><td> 15 </td><td> 1.2 </td><td> 22 </td></tr><tr><td> PEO </td><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 15 </td></tr></tbody></table> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם הכל מיושר כמו שצריך, לכבות את האורות ולהדליק mandrel לבין משאבות מזרק. הסר את רדיד אלומיניום מן המזרקים. כאשר נוזל גלוי על קצות המחטים שניהם, בו זמנית להפעיל את ספקי כוח לחבר האברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אוסף שלם, לכבות את ספקי כוח mandrel ונתק את האברים. הסר בזהירות את coverslips קלטת באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את הסיבים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסננים עבור rhodamine ו DAPI. ראו דוגמה באיור 3. הערה: סיבים פלורסנט ברורים ביותר כדי להציג כאשר electrospun לתקופות קצרות של זמן (&lt;3 דקות), לעומת זאת, תהליך זה יכול להתארך למשך פרק זמן בלתי מוגבל כדי ליצור מבנים עבה יותר, במיוחד ללא שימוש coverslips זכוכית . </li></ol> ד מתזמן תאים על פיגומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום כל coverslip עם electrospun מצורף לתוך פולימר יחיד היטב צלחת בגודל מתאים היטב. הערה: אינטראקציות הסלולר עם הסיבים גלויים בקלות על ידי electrospinning על coverslips זכוכית methacrylated. כמו כן, MeRho יכול שוב לשמש ראיה סיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פיגומים ב PBS לילה על מנת להבטיח הסרה מלאה של ממס וכל leachable אפשרי לפי מוצרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS מהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקר את הפיגומים, למקם אותם מתחת לפנס קוטל חידקים במנדף זרימה למינרית במשך 30 דקות. אם פיגום מלא הוא להיות seeded, להעיף את הפיגום על מקום מתחת לפנס קוטל חידקים לעוד 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע תרבית תאים סטנדרטיים להכין ההשעיה תא מרוכזים בצפיפות התא הרצוי (לדוגמא: 6000 תאים -2 ס&quot;מ). לדוגמה, השתמש ב 100 מ&quot;ל של השעיה התא 22 מ&quot;מ X 22 מ&quot;מ coverslip. מקום בחממה במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הכמות המתאימה של התקשורת בתרבות התא היטב כל אחד. מניחים את הפיגומים בחזרה לתוך החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם התאים באמצעות ערכת Live / Dead זמינים מסחרית. הערה: סוגים אחרים של מכתים התא, כגון DAPI (גרעין התא) ו phalloidin שכותרתו fluorescently (סיבי אקטין מתח) יכול להיות מיושם כדי להמחיש את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את התאים סיבים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד מסננים עבור TRITC ו FITC. ראו דוגמה באיור 4. </li></ol> נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure1tmb.jpg" border="0" alt="איור 1" /> באיור 1. סכמטי המדגים את ההתקנה למכשיר ליצירת פיגום הבלתי מזדהות (למעלה) ו מיושר היווצרות הפיגום (התחתון). סריקה דוגמה אלקטרונים מיקרוסקופית תמונות של כל סוג של פיגום מוצגים. בר סולם = 5μm. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure2tmb.jpg" border="0" alt="איור 2" /> איור 2. סכמטי של שיטת דפוסים. דפוסי נוצרות על ידי הצבת photomask בין מקור האור לבין הפיגום במהלך photocrosslinking ואז שטיפת פולימר unreacted. Photomask ו SEM התמונה של פיגומים לאחר היווצרות lyophilization הנקבוביות. בר סולם = 100 מיקרומטר. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure3tmb.jpg" alt="איור 3" border="0" /> איור 3 סכמטי של ההתקנה electrospinning רב פולימר פרמטרים עיבוד הכרחי, כמו גם תמונת פלורסנט נציג מתערובת של שתי האוכלוסיות סיבים (לדוגמה: אדום וכחול MeHA PEO). Electrospun שהיו בעת ובעונה אחת כדי ליצור רב פיגום פולימרי . בר סולם = 100 מיקרומטר. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure3.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות versio גדולn של הדמות 3. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure4tmb.jpg" border="0" alt="איור 4" /> איור 4. דוגמה חיה / המלח מכתים תמונה של אדם בתאי גזע mesenchymal ויחסי הגומלין שלהם עם סיבים electrospun. בר סולם = 100 מיקרומטר. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure4.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 4.

<ol>
	<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks.">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li><li>Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers.">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).</li><li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications.">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li><li>Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolding+of+photocrosslinkable+hyaluronic+acid+for+cell+encapsulation+and+entrapment.">Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment.</a> J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).</li><li>Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+on+the+Straight+and+Narrow:+The+Mechanics+of+Nanofibrous+Assemblies+for+Fiber-Reinforced+Tissue+Regeneration.">Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).</li><li>Sill, T. J., Von Recum, H. a. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning:+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multi-scale+and+photopatterned+porosity.">Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity.</a> , (2009).</li></ol>

Electrospinning שימש להכין פיגומים סיבי פולימרים. Photocrosslinkable פיגומים מבוסס על חומצה היאלורונית שימשו דוגמה להמחשה, שבו חשיפה לאור דרוש crosslinking. עם השימוש macromers תגובתי, כגון MeHA, ערוצים הוכיחו בעבר הפצה סלולרית משופרת שולבו פיגומים עם השימוש במסכה במהלך photocrosslinking כדי ליצור פיגו...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DAPI</td>
<td> Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEO 200 kDa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences</td>
<td>17503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEO 900 kDa</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>189456</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591-100</td>
<td>Prepare stock solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead Stain Kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells)</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>Equipment</td>
<td>KD Scientific</td>
<td>KDS100</td>
<td>Two are needed for dual polymer spinning</td>
</tr>
<tr>
<td>Power Source</td>
<td>Equipment</td>
<td>Gamma High Voltage</td>
<td>ES30P-5W</td>
<td>Two are needed for dual polymer spinning</td>
</tr>
<tr>
<td>Motor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Triem Electric Motors, Inc</td>
<td>0132022-15</td>
<td>Must attach to a custom built mandrel</td>
</tr>
<tr>
<td>Tachometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Network Tool Warehouse</td>
<td>ESI-330</td>
<td>Use to monitor mandrel speed</td>
</tr>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51135K151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Lock Female Adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51525K293</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Lock Male Adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51525K143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needles</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14-825-16H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Corning</td>
<td>2875-22</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture

כמו בתחום הנדסת רקמות מתפתחת, יש ביקוש עצום כדי לייצר חומרים מתאימים יותר וטכניקות עיבוד על מנת לענות על הדרישות (למשל, מכניקת כלי הדם) של איברים ורקמות יותר מורכב. Electrospinning היא טכניקה פופולרית כדי ליצור פיגומים סיבי המחקות את הארכיטקטורה ואת קנה המידה של גודל המטריצה ​​תאיים הילידים. אלה פיגומים סיבי מועילות גם מצעים תרבית תאים מאז הסיבים ניתן להשתמש כדי לכוון התנהגות הסלולר, כולל התמיינות בתאי גזע (ראה סקירות נרחבות על ידי Mauck<em&gt; Et al.</em&gt; ו סיל<em&gt; Et al.</em&gt; למידע נוסף). במאמר זה, אנו מתארים את התהליך הכללי של electrospinning פולימרים כדוגמה, electrospin חומצה היאלורונית תגובתי מסוגל crosslinking עם חשיפה לאור (ראה Ifkovits<em&gt; Et al.</em&gt; לסקירה על חומרים photocrosslinkable). כמו כן, אנו מציגים את יכולות עיבוד נוסף כגון photopatterning ורב פולימר היווצרות הפיגום. Photopatterning יכול לשמש כדי ליצור פיגומים עם ערוצי ורב היקף נקבוביות להגדיל את חדירת הסלולר והפצה רקמות. Multi-פולימר פיגומים מועילים יותר לכוון את התכונות (מכניקה השפלה) של פיגום, כולל נקבוביות המותאמים חדירת הסלולר. יתר על כן, הטכניקות האלה ניתן להרחיב כוללים מגוון רחב של פולימרים macromers תגובתי כדי ליצור פיגומים מורכבים המספקים את הרמזים הדרושים לפיתוח מוצלח בונה רקמות מהונדסות.

Watch this Scientific Journal Video about Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture at JoVE.com

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

תהליך electrospinning פולימרים של הנדסת רקמות והתרבות תא מופנית במאמר זה. באופן ספציפי, electrospinning של macromers photoreactive עם יכולות עיבוד נוסף של photopatterning ורב פולימר electrospinning מתואר.

Electrospinning פיגומים פולימר סיבי עבור הנדסת רקמות ותרבות Cell

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

electrospinning-fibrous-polymer-scaffolds-for-tissue-engineering-cell

Research

JoVE Journal

Biology

21.4K Views.  University of Pennsylvania. תהליך electrospinning פולימרים של הנדסת רקמות והתרבות תא מופנית במאמר זה. באופן ספציפי, electrospinning של macromers photoreactive עם יכולות עיבוד נוסף של photopatterning ורב פולימר electrospinning מתואר.

Video: Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Experimental Approaches to Tissue Engineering

גישות ניסויית כדי הנדסת רקמות

Micro-scale Engineering for Cell Biology

מיקרו בקנה מידה הנדסה לביולוגיה של התא

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabrication של שבב בגודל פיגומים לעיבוד תלת ממדי נייד

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Interview: Bioreactors and Surfaced-Modified 3D-Scaffolds for Stem Cell Research

A Nature Editorial in 2003 asked the question "Good-bye, flat biology?" What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems, mainly monolayer cultures, often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.
The last generation of CellChips -- micro-thermoformed containers -- a specific technology was developed, which offers the additional possibility to modify the whole surface of the 3D formed containers. This allows a surface-patterning on a submicron scale with distinct signalling molecules. Sensors and signal electrodes may be incorporated. Applications range from basic research in cell biology to toxicology and pharmacology. Using biodegradable polymers, clinical applications become a possibility. Furthermore, the last generation of micro-thermoformed chips has been optimized to allow for cheap mass production.

In the past many in vitro culture systems -- mainly monolayer cultures -- often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.

ראיון: bioreactors ועלו-Modified-3D פיגומים למחקר בתאי גזע

A Nature Editorial in 2003 asked the question  "Good-bye, flat biology?"  What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems,  ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

הנדסה Cell-חדיר חלבון

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

מערכת culturing איריס תאים פיגמנט אפיתל לחקר התחדשות עדשה של ניוט

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

התמרה של תאים אנושיים עם Lentivirus פולימר-ומורכבת Ecotropic עבור Enhanced biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...