עבודה זו נתמכת על ידי ביוטכנולוגיה ומחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC), החברה המלכותית ואוניברסיטת נוטינגהם.

.1 קביעת שינוי עוצמת הקרינה על הכריכה של נוקלאוטיד שכותרת Mant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוקלאוטיד שכותרת mant 1 מיקרומטר לkinesin 1 מיקרומטר (ריכוזים סופיים) במאגר תגובה מתאים. בדרך כלל חיץ שיועיל לצמיחת microtubule ויציבות משמש (ראה דיון). חיץ נפוץ מכיל pH6.9 piperazine-BIS-2-ethanesulfonic 80mm חומצה (צינורות), 1 המ&quot;מ MgCl 2 ואתילן גליקול 1 המ&quot;מ-BIS-2 חומצת aminoether-tetraacetic (EGTA). הערה: הריכוז של kinesin האמור בכל הפרוטוקולים מתייחס לריכוז של אתרי נוקלאוטיד מחייב (כלומר, תחומים מוטוריים). kinesins שונה להתקיים כמונומרים, הדימרים או tetramers וכך יכול להכיל אתר מחייב נוקלאוטיד יותר מאחד לכל מולקולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה (1-3 דק &#39;) ושימוש בfluorimeter סטנדרטי, למדוד את ספקטרום הפליטה למורכב kinesin-נוקלאוטיד שכותרת mant. השתמש בגל עירור של 365nm ומדד נפלט אור 400-500 ננומטר במרווחי 1nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון של 1 המ&quot;מ נוקלאוטיד שכותרת mant באותו מאגר התגובה המשמש בשלב 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ספקטרום הפליטה למדגם רק נוקלאוטיד mant, כפי שתואר לעיל (ראה שלב 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את הספקטרום לאות באורך הגל של עוצמת הקרינה שיא של הספקטרום של נוקלאוטיד mant בפתרון (כלומר, ללא kinesin) על ידי החלוקה דרך על ידי ערך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלילה הספקטרום המנורמל (למשל, איור 2) להתבונן הבדלי עוצמת הקרינה בין נכנסים mantATP ו / או נוקלאוטיד kinesin וmant קשור-mantADP בפתרון. </li></ol> 2 מדידה של קבועי האגודה ודיסוציאציה המחיר לmantATP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון של עד 20 kinesin מיקרומטר (ראה דיון) בכל Mg מתאים 2 + חיץ -חינם (למשל, 80mm צינורות pH6.9, 1mm EGTA, 0.1% Tween20), להוסיף 1dithiothreitol מ&quot;מ חומצה (סופית ריכוז) ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ו1 מ&quot;מ (ריכוז סופי) (DTT). שים לב: תוספת של Tween20 למאגר מומלצת שכן הוא מפחית / מונע אובדן חלבון kinesin של בעמודה המשמשת לחילופי חיץ (צעדים 2.3 ו3.3) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפתרון 25 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוקלאוטיד נפרד חופשי וEDTA מkinesin באמצעות טור סינון G-25 ג&#39;ל Sephadex זרימה הכבידה על פי הוראות יצרן (ראה רשימה של חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הטור עם לפחות 3 כרכי טור של חיץ -חינם מתאים Mg 2 + (ראה שלב 2.1). טען את הפתרון המכיל kinesin על הטור. הכן צינור איסוף על ידי הוספת נפח מתאים של פתרון מגנזיום כלוריד 100mm לצינור הריק, כך שהריכוז הסופי של מגנזיום כלוריד הוא 1 מ&quot;מ לאחר איסוף פתרון kinesin. תוספת מיידית של מגנזיום כלוריד עוזרת stabilise kinesin ללא נוקלאוטיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute kinesin באמצעות חיץ -חינם מתאים Mg 2 +. Kinesins אינם יציבים, כאשר ללא נוקלאוטיד ולכן חשוב לעבוד במהירות. אחסן את kinesin ללא נוקלאוטיד על קרח ולהשתמש תוך 1-2 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך או לפני הכנת kinesin ללא נוקלאוטיד, להכין סדרת ריכוז mantATP באותו מאגר התגובה כפתרון הסופי של kinesin ללא נוקלאוטיד. לקבוע את טווח ריכוזים של mantATP הנדרשים על פי הריכוז זמין של kinesin עם סדרה טיפוסית נעה 0.1-50 מיקרומטר (ראה שלב 2.5 ודיון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרת ריכוז kinesin ללא נוקלאוטיד. עבור כל ריכוז של mantATP (שלב 2.4), ריכוז של kinesin ללא נוקליאוטידים צריך להיות מוכן באופן שנוקלאוטיד שכותרת mant הוא ב 5 לעודף טוחנת 10 מתקפל מעל אתרי קישור נוקלאוטיד kinesin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את אורך גל העירור על הפסיקה-פלוw fluorimeter ל365 ננומטר ולאסוף נפלט אור ב&gt; 400 ננומטר באמצעות מסנן ארוך לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מהריכוז הנמוך ביותר של mantATP, לערבב mantATP עם ריכוז מתאים של kinesin ללא נוקלאוטיד ב1: 1 יחס V / V באמצעות הפסיקה זרימת fluorimeter (איור 3 א ו 3 ב הבלעה). הערה: המגיבים הם בדילול על ידי 50% על ערבוב. שמור לעצמך את ריכוז נוקלאוטיד שני ערבוב לפני ואחרי (כלומר, 3.0 / 1.5 מיקרומטר) כדי למנוע בלבול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את השינוי בעוצמת הקרינה שנמדדה בכל ריכוז של mantATP לפונקציה מעריכית בתוספת שורה של שיפוע שלילי מתמיד כדי להסביר photobleaching של קבוצת mant (כלומר, הקרינה = .exp 0 (k .t תצפיות) + (מ &#39;. t + ג), שבו 0 הוא משרעת, תצפיות k היא קבועות קצב וt הוא זמן, ראה איור 3 ב ודיון). מהתקפים אלה לקבועלדרג (תצפיות k) קבועות בכל ריכוז של mantATP. כל תצפיות k היא פיתול של מתמיד עמותה ודיסוציאציה שיעור (איור 1, k 1 ו k -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deconvolve קבועי עמותה ושיעור ניתוק על ידי התוויית תצפיות k נגד ריכוז mantATP (למשל, איור 3 ג). להתאים את הנתונים הללו לפונקציה לינארית (כלומר, תצפיות k = k 1 k [mantATP] + -1) כדי להשיג את יירוט השיפוע וציר y. השיפוע מייצג את השיעור קבוע לעמותת mantATP (איור 1, k 1) עם היחידות M -1 s -1. ליירט מייצג את השיעור קבוע דיסוציאציה (איור 1, k -1) עם יחידות של s -1 (ראה דיון). הערה: גישה זו יכולה להיות מיושמת גם לקבוע את קשר ADP ודיסוציאציהקבועי קצב (איור 1, k -4 וk 4) באמצעות mantADP כנוקלאוטיד. </li></ol> 3 מדידה של קצב דיסוציאציה קבוע לmantADP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון של 2 kinesin מיקרומטר במאגר תגובה מתאים (לדוגמא, 80 צינורות מ&quot;מ pH6.9, 1mm MgCl 2, 1mm EGTA, 0.1% Tween20), להוסיף 50 מיקרומטר mantADP (ריכוז סופי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 25 C o ל30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר mantADP עודף ונוקלאוטיד האחר בחינם על ידי חיץ החלפת kinesin למאגר התגובה נבחר באמצעות טור Sephadex G-25 (ראה רשימה של חומרים) על פי הוראות יצרן. תחום המוטורי kinesin צריך עכשיו להיות טעון עם mantADP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את אורך גל העירור על הפסיקה זרימת fluorimeter ל365 ננומטר ולאסוף נפלט אור ב&gt; 400 ננומטר באמצעות מסנן ארוך לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את מורכב mantADP.kinesin (~ 1μM) עם פי 50 או מולה גדולה יותרעודף r של ATP ללא תווית ב1: 1 יחס V / V באמצעות הפסיקה זרימת fluorimeter (איור 4 א ו -4 הבלעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הירידה בעוצמת הקרינה שנצפתה על פני זמן לפונקציה מעריכית יחידה בתוספת שורה של שיפוע שלילי מתמיד כדי להסביר photobleaching של קבוצת mant (כלומר, הקרינה = .exp 0 (k .t תצפיות) + (m.t + ג), שבו 0 הוא משרעת, תצפיות k היא קבועות קצב וt הוא זמן, ראה איור 4 ב ודיון). תצפיות k נקבעו מכושר זה היא שיעור קבוע לניתוק של ADP (איור 1, k 4) עם יחידות של s -1 (ראה דיון). </li></ol>

<ol>
	<li>Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+kinesin+motor+proteins.">Structures of kinesin motor proteins.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+kinesin+ATP+turnover+to+translocation+and+microtubule+regulation:+one+engine,+many+machines.">Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).</li><li>Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+pathway+for+activation+of+the+kinesin+motor+ATPase.">A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase.</a> EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).</li><li>Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conformational+changes+in+a+kinesin+motor+catalyzed+by+interaction+with+microtubules.">Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules.</a> Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).</li><li>Kikkawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch-based+mechanism+of+kinesin+motors.">Switch-based mechanism of kinesin motors.</a> Nature. 411, 439-445 (2001).</li><li>Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+the+ATP+turnover+cycle+of+microtubule+motors.">Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors.</a> Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+analogues+at+a+glance.">ATP analogues at a glance.</a> J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-13+MCAK+has+an+unconventional+ATPase+cycle+adapted+for+microtubule+depolymerization.">The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization.</a> EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).</li><li>Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+processive+ATP+hydrolysis+by+kinesin.">Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin.</a> Nature. 373, 671-676 (1995).</li><li>Sadhu, A., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+kinesin+ATPase.">A kinetic study of the kinesin ATPase.</a> J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).</li><li>Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+interaction+of+2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP+with+myosin+subfragment+1+and+actomyosin+subfragment+1:+characterization+of+two+acto-S1-ADP+complexes.">Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes.</a> Biochemistry. 30, 422-430 (1991).</li><li>Hackney, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ADP-stimulated+ADP+release+and+dissociation+of+tethered+kinesin+from+microtubules.+Implications+for+the+extent+of+processivity.">Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity.</a> Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).</li><li>Lockhart, A., Cross, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+motility+of+the+Eg5+microtubule+motor.">Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor.</a> Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).</li><li>Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATPase+pathway+that+drives+the+kinesin-14+Kar3Vik1+powerstroke.">The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke.</a> J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).</li><li>Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ATP+hydrolysis+by+monomeric+and+dimeric+kinesin.">Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin.</a> Biochemistry. 37, 800-813 (1998).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).</li><li>Goodrich, J. A., Kugel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, 69-97 (2006).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).</li><li>Olmsted, J. B., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+and+nucleotide+requirements+for+microtubule+polymerization+in+vitro.">Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro.</a> Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).</li><li>Brinkley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules:+a+brief+historical+perspective.">Microtubules: a brief historical perspective.</a> J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).</li><li>Ostap, E. M., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+kinetic+characterization+of+the+Acanthamoeba+myosin-I+ATPase.">Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase.</a> J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).</li><li>Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+the+study+of+the+p21ras+GTPase+mechanism.">Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism.</a> Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).</li><li>Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+methods+in+the+study+of+small+GTP-binding+proteins.">Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins.</a> Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים להתבוננות וניתוח של קינטיקה של מעברים בין מדינות נוקלאוטיד לkinesin. פרוטוקולים אלה לנצל את שיטת ערבוב הפסיקה זרימה המהירה בשילוב עם נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently. שיטות מסוג זה נעשו שימוש נרחב ללמוד נוקלאוטיד מחייב וניתוק עבור מגוון רחב של kinesins 9-11,13-16. השיטות שתוארו אינו מאפשר תצפית של שחרור פוספט (איור 1, שלב 3). עם זאת, הפסיקה זרימת הקרינה יכולה לשמש כדי לבחון את המעבר הזה על ידי שימוש בחלבון חישת פוספט לזוג הייצור של פוספט לשינוי עוצמת הקרינה 17. השיטות שהוצגו נוקלאוטידים שימוש שכותרתו עם methylanthraniloyl הקטן fluorophore (mant), אשר בדרך כלל מציגים עלייה בעוצמת הקרינה כאשר חייב חלבון. יתר על כן, fluorophore mant, כאשר מצומדת לאו 2 &#39;או 3&#39; העמדה בribose, לעתים קרובות יש השפעה מועטת, אם בכלל, על הכריכה, הניתוק או הידרוליזה של נוקלאוטיד 9-12. נוקלאוטידים שכותרת Mant זמינים ממקורות מסחריים (ראה רשימה של חומרים) וניתנים כתערובות של 2 &#39;ו 3&#39; המצומד כפי שהם מחדש במהירות לאזן כאשר מטוהרים להאיזומר יחיד 8. נוקלאוטידים שכותרת Mant להפוך מולקולות כתב מצוינות שבאמצעותו ניתן לצפות קינטיקה של נוקלאוטיד מחייב וניתוק. השימוש בנוקלאוטידים שכותרתו fluorescently אומר שקרא מתוך מבחני שתוארו הוא שינוי בזמן אמת בעוצמת הקרינה. זה עושה את מבחני הללו אידיאליים לפסיקת זרימת הקרינה, המאפשרת ערבוב מהיר של חומרים כימיים ותצפית בזמן אמת של שינויים בקרינה קשורים בתגובה שלאחר מכן. השילוב של הפסיקה זרימה כטכניקת ערבוב והקרינה כשיטה לגילוי מייצר מערכת שהיא EF מדגם יחסית<html> ficient. לדוגמה, כדי לרכוש את הנתונים שמוצגים באיור 3 ג דורש .8-1.0 מ&quot;ג של kinesin-13 המטוהר, MCAK, ולרכוש את הנתונים שמוצגים באיור 4 דורש ~ 0.3 מ&quot;ג של kinesin-13 המטוהר, MCAK. חסרון אחד של השימוש בmant כfluorophore הוא שהוא נוטה photobleaching. זה יכול להיות שנצפה בבידוד מkinesin קינטיקה תגובה על ידי ערבוב תמיסה של נוקלאוטיד שכותרת mant עם חיץ תגובה, בהעדר kinesin, בפסיקת הזרימה. ירידה איטית בעוצמת הקרינה הוא ציין כקבוצת mant הופכת מולבנת. על פני הטווח של לוחות זמנים בשימוש בפרוטוקולים המתוארים photobleaching של קבוצת mant מתוארת היטב על ידי פונקציה לינארית. לכן, דרך פשוטה לתקן את הנתונים עבור photobleaching היא כדי להתאים לפונקציה מעריכית עם בסיס שתואר על ידי פונקציה לינארית (כלומר, הר + ג) ולא בנקודת ההתחלה שטוחה נפוצה יותר, שתואר על ידי פרמטר אחד. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; mantATP מחייב כאשר מודדים קבועי קצב לעמותה וניתוק של mantATP (סעיף 2) ADP, אשר נשאר קשור עם האתר מחייב נוקלאוטיד kinesin בהעדר microtubules, יש להסיר. זה מאפשר לי עמותת mantATP וניתוק (איור 1, שלב 1) כדי לצפות בבידוד מניתוק ADP. כדי להשיג זאת kinesin הוא מודגרות עם לפחות עודף של פי 50 של EDTA על אתרי קישור נוקלאוטיד (שלב 2.1). EDTA sequesters יוני Mg 2 + גורמים Mg 2 + לנתק מהכיס מחייב נוקלאוטיד, וכתוצאה מכך שחרורו של נוקלאוטיד 11. לכן, בעת ביצוע צעדים 2.1-2.3, הוא חיוני, להשתמש במאגר חופשי של Mg 2 +. חלבון kinesin ללא נוקלאוטיד הוא חיץ החליף להפריד אותו משני נוקליאוטידים חופשיים ומEDTA. כדי להשיג את ההפרדה הזאת, הכבידה זרימה חד פעמית geטור סינון l מספיק והוא פשוט ומהיר לשימוש (ראה רשימה של חומרים). האינטראקציה של mantATP עם kinesin החופשי נוקלאוטיד מתבצעת בטווח של ריכוזי mantATP (שלב 2.4) כדי לאפשר deconvolution של קבועי קצב העמותה ודיסוציאציה (שלב 2.8). התאוריה מאחורי ניסויים מסוג זה מתואר היטב בהתייחסות 18. בביצוע ניסויים אלה אחד מתחיל בריכוז הנמוך ביותר של mantATP. זה מסיר את הצורך בצעדים לשטוף בין ריכוזים שונים. סביר להניח שזה יהיה צורך להתאים את הרגישות של הפסיקה זרימת fluorimeter כריכוז mantATP הוא גדל. ריכוז mantATP חייב תמיד להיות בעודף לפחות פי 5 יותר מהריכוז של אתרי קישור נוקלאוטיד kinesin לשמור על תנאים מסדר הראשונים פסאודו. עם זאת, כריכוז של mantATP הוא גדל, שינוי האות יכול להפוך מוצף כחלק של נוקלאוטיד שנקשר לkinesin ירידות. Therefoמחדש, הריכוז של kinesin הוא גדל גם עבור כל ריכוז חדש של mantATP כך שהריכוז של mantATP הוא לא גדול יותר מעודף טוחנת פי 10 על אתרי קישור נוקלאוטיד (שלב 2.6). mantADP דיסוציאציה למרות קבועי עמותה ושיעור הניתוק לmantADP ניתן לקבוע באותה השיטה שתוארה לmantATP (סעיף 2). ניתוק של ADP מkinesin ניתן לצפות ישירות על ידי טעינה מוקדמת אתר נוקלאוטיד מחייב עם mantADP (צעדים 3.1-3.3) המורכב mantADP.kinesin הוא מעורב אז עם עודף של ATP ללא תווית (שלב 3.5). ATP ללא התווית העודפת מונע rebinding של mantADP לkinesin ובכך מאפשר תגובת דיסוציאציה (איור 1, k 4) כדי לצפות במנותק מקשר של mantADP. ב assay זה הריכוז של ATP ללא תווית חייב להיות לפחות עודף טוחנת פי 50 של nucleotide אתרי קישור. התאוריה מאחורי assay זה מתואר היטב בהתייחסות 18. שיטה ישירה זה נותנת ערך מדויק יותר לשיעור הניתוק הקבוע מאשר אקסטרפולציה לציר y שתואר בשלב 2.8. הכללת microtubules גם השיטות שתוארו ניתן להשתמש כדי לקבוע את קינטיקה של נוקלאוטיד מחייב וניתוק בנוכחות microtubules. Microtubules מתוודע למזרק המכיל נוקליאוטידים לפני הערבוב בפסיקת הזרימה: המזרק התחתון באיור 3 ו -4 (ריבועים). בתצורה זו, kinesin יפגוש נוקלאוטיד באותו הזמן כפי שהוא פוגש את microtubules. microtubules התייצב משמש, שבו חייו של פולימר טובולין הוארך על ידי השימוש בשני כימי ייצוב, כגון טקסול, או אנלוגי GTP nonhydrolysable, כגון guanosine-5 &#39;- [(α, β) -methyleno] אדנוזין (GMPCPP, ראה רשימה של חומרים). ניתן להשתמש בשני מחזורים של פילמור טובולין עם GMPCPP לעשות microtubules שיכול להיות מאוחסן במשך חודשים רבים ב9,19 חנקן נוזליים. השימוש בmicrotubules מוכן מראש מקטין באופן משמעותי את הקשיים המעשיים בביצוע מבחני אלה. כדי לכלול microtubules במבחנים, זה חשוב להשתמש במאגר תגובה מתאים ליציבות microtubule. החיץ של בחירה הוא צינורות מבוססים, עם החיץ הנפוץ ביותר המכיל 80 pH מ&quot;מ צינורות 6.9, 1 מ&quot;מ MgCl 2 ו 1 מ&quot;מ EGTA (המכונה BRB80) 20,21. השיטות שתוארו אינן מוגבלות לשימוש עם kinesins, אך יכולות להיות מותאמת ומיושמות על כל חלבון מחייב נוקלאוטיד. לדוגמא, בשיטות דומות הוחלו על מחזור מחזור ATP של בני משפחת שרירן של מנועים מולקולריים 12,22 והשימוש בנוקליאוטידים guanosine mant שכותרתו משתרע נוסףשיטות מסוג זה לGTP hydrolyzing חלבונים 23,24.

Kinesins הוא superfamily של חלבונים מאופיינים בתחום מוטורי שמור ביותר 1. תחום המוטורי kinesin אינטראקציה עם microtubules באופן נוקלאוטיד תלוי. בני משפחת kinesin להציג מגוון רחב של פונקציות מkinesins translocating, אשר נושא מטען באופן מכוון לאורך microtubules, לkinesins מחייב סוף microtubule translocating שאינו, המסדיר דינמיקת microtubule 2,3. Kinesins להשתמש המחזור-5&#39;-טריפוספט adensosine (ATP) כדי לווסת את האינטראקציה שלהם עם microtubule שלד תא 4-6. קונפורמציה של תחום המוטורי kinesin ולכן הזיקה שלה לmicrotubule תלויה במצבו נוקלאוטיד: ATP, יכול להיות מחויב ADP, ADP.Pi או לא נוקלאוטיד (איור 1). כדי להבין את המנגנון המולקולרי של kinesin, נדרשת הבנה של הקשר בין מחזור ATP והאינטראקציה microtubule.refore, מטרה העיקרית בתחום kinesin היא לאפיין את התכונות פונקציונליות של מדינות נוקלאוטיד שונות וקינטיקה של המעברים ביניהם הן בנוכחות והיעדרות של microtubules. <img alt="איור 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> איור 1 מחזור מחזור ATP הפשוט ביותר לkinesin מורכב מארבעה מצבים אפשריים: (Φ) ללא נוקלאוטיד, ATP-מחויב, ADP.P אני -bound וכרוך-ADP כל אחד מארבעת המעברים מאופיין בקדימה ו. קבוע לאחור שיעור (x k וk -x בהתאמה). כדי להבין כיצד המחזור הכימי של מחזור ATP הוא מצמידים את המחזור המכני של האינטראקציה microtubule, יש לקבוע שצעד במחזור מחזור ATP הוא שיעור הגבלה בהעדר microtubules ולאחר מכן לקבוע כיצד המחזור משתנה על ידי הנוכחות של microtubules. מחזור מחזור ATP הפשוט ביותר מורכב מארבעת שלבי כימיקלים פרט: (1) ATP מחייב את האתר הריק (Φ מציין את האתר הריק, כלומר kinesin ללא נוקלאוטיד,); מחשוף ATP (2); ניתוק פוספט ו( 4) ניתוק ADP (איור 1) (3). צעד שער הגבלה קובע את השיעור קבוע למחזור מחזור ATP המלא. לכן, כדי לקבוע איזה צעד הוא שיעור הגבלה בכל שינויי הפרט חייב להימדד ובהשוואה לשיעור קבוע למחזור השלם. שיטות למדידה מתמדת שיעור מחזור הכולל מחזור ATP אינם מתוארות כאן, אבל ניתן למצוא בהתייחסות .7 כאן אנו מתארים שיטות שבה ניתן לקבוע קבועי קצב לצעדים כימיים בודדים. ישנן מספר השיטות זמינות ללמוד מעברים בודדים במחזור מחזור של חלבון hydrolyzing נוקלאוטיד. השיטות שהוצגו כאן לקחת advantagדואר של המאפיינים של נוקלאוטידים שכותרתו עם methylanthraniloyl fluorophore, בדרך כלל מכונה mant, המציג שינוי בעוצמת הקרינה על קישור לחלבון 8. קבוצת mant משמשת כי גודלו הקטן אומר ש, כאשר מצמידים לריבוז (איור 2 א), שהוא בדרך כלל יש השפעה מועטת, אם בכלל, על קינטיקה של נוקלאוטיד מחייב או הידרוליזה 9-12. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים המתארים את השימוש של נוקלאוטידים שכותרת mant, בשיתוף עם הפסיקה זרימת הקרינה, כדי לאפשר תצפית של נוקלאוטיד מחייב וניתוק במחזור מחזור ATP של kinesin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:279px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;triphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-202</td>
			<td style="width:279px;">mantATP</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-201</td>
			<td style="width:279px;">mantADP</td>
		</tr>
		<tr height="134">
			<td height="134" style="height:134px;width:220px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:147px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;"># 10519979001</td>
			<td style="width:279px;">The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&#160;mM in 100&#160;mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260&#160;nm (e = 15400&#160;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&#160;oC.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP120-500</td>
			<td style="width:279px;">0.5&#160;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:220px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:147px;">Melford</td>
			<td style="width:136px;">MB1015</td>
			<td style="width:279px;">1&#160;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">NAP-5 column</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;"># 17-0853</td>
			<td style="width:279px;">G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:220px;">GMPCPP</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-405</td>
			<td style="width:279px;">nonhydrolysable analogue of GTP</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:220px;">Stopped-flow fluorimeter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Applied Photophysics</td>
			<td style="width:136px;">SX20</td>
			<td style="width:279px;">A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&#160;-&#160;100&#160;s to be monitored.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

Superfamily kinesin של חלבוני מנוע microtubule הקשורים לשתף תחום מוטורי אופייני ששני hydrolyses ATP ונקשר microtubules. Kinesins להציג הבדלים לאורך superfamily הן במחזור ATP ובאינטראקצית microtubule. הבדלים אלה להתאים kinesins הספציפי לפונקציות שונות, כגון הובלת מטענים, microtubule הזזה, depolymerization microtubule וייצוב microtubule. כדי להבין את מנגנון פעולה של kinesin זה חשוב להבין איך המחזור הכימי של מחזור ATP הוא מצמידים את המחזור המכני של האינטראקציה microtubule. לנתח את מחזור מחזור ATP, גישה אחת היא לנצל נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently לדמיין צעדים בודדים במחזור. קביעת קינטיקה של כל מעבר נוקלאוטיד במחזור מחזור ATP מאפשרת צעד שער הגבלה או צעדים למחזור השלם להיות מזוהה. לkinesin, חשוב לדעת את צעד שער הגבלה, בהיעדר microtubules, כצעד זה הנו בדרך כלל מואץ פי כמה וכמה אלף כאשר kinesin אינטראקציה עם microtubules. המחזור בהעדר microtubules השוואה אז לזה בנוכחותו של microtubules להבין מחזור המחזור של kinesin ATP באופן מלא. קינטיקה של מעברי נוקלאוטיד הבודדים היא בדרך כלל מהר מדי להתבונן על ידי ערבוב ידני מגיבים, במיוחד בנוכחות microtubules. מכשיר ערבוב מהיר, כגון הפסיקה זרימת fluorimeter, המאפשר קינטיקה להיות שנצפתה על לוחות זמנים של קטן כמו כמה אלפיות שנייה, ניתן להשתמש בו כדי לפקח על מעברים כאלה. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים שבערבוב מהיר של חומרים כימיים על ידי הפסיקה זרימה משמש יחד עם נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently לנתח את מחזור מחזור ATP של kinesin.

עלייה בעוצמת הקרינה של קבוצת mant הוא ציין בדרך כלל על הכריכה של נוקלאוטיד שכותרת mant לkinesin. עם זאת, סדר הגודל של שינוי אות כזה תלוי בkinesin המסוים בשאלה. לכן, כדאי לבצע מדידות שיווי משקל כדי לאשר את שני הנוכחות ועצמה של שינוי עוצמת הקרינה לפני שממשיך למבחנים קינטית. ספקטרום הקרינה נציג לmantATP וmantADP, שניהם בפתרון ובמורכב עם kinesin-13, MCAK, מוצג באיור 2. נתונים אלה מדגישים את עליית עוצמת הקרינה המוצגת על ידי שני mantATP וmantADP על הכריכה לMCAK. השינוי בעוצמת הקרינה על הכריכה של נוקלאוטיד mant לkinesin משמש לדיווח על הקשר והניתוק של שני ATP וADP (סעיפים 2 ו -3). במקרה של MCAK, הבדל עוצמת הקרינה הוא ציין בין mantATP.kinesin וmantADP.kinesin <sup&gt; 9. איור 3 א מציג את התגובה המתרחשת על ערבוב mantATP עם kinesin ללא נוקלאוטיד. נציגי נתונים הממחישים את העלייה בעוצמת הקרינה המתרחשת על הכריכה של mantATP לkinesin-13, MCAK מוצג באיור 3 ב. נתונים מהסוג שמוצג באיור 3 ב נאספים בטווח של ריכוזי mantATP. עלילה של קבועי קצב (תצפיות יא) נקבעו לעומת ריכוז mantATP מוצגת באיור 3 ג. התאמת נתונים אלה לפונקציה לינארית (כלומר, תצפיות k = k 1 [mantATP] + K -1) מאפשר deconvolution של קבועי קצב שתורמים לk תצפיות (שלב 2.8). לכן, k 1 ו k מאפשר הקביעה של שתי העמותה והשיעור קבוע דיסוציאציה לmantATP (איור 1, <eמ &#39;&gt; -1 בהתאמה). איור 4 א מתאר את התגובה המתרחשת על ערבוב mantADP.kinesin עם עודף של ATP ללא תווית. הנתונים באיור 4 מראה את ירידת עוצמת הקרינה נצפתה עבור mantADP על ניתוק מkinesin-13, MCAK. על ידי התאמת נתונים לפונקציה מעריכית (שלב 3.6) שיעור הקבוע לניתוק של mantADP נקבע ישירות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> נוקלאוטידים איור 2 שכותרתו עם methylanthraniloyl fluorophore (mant) משמשים כדי לבודד את הפעולות בודדות במחזור מחזור ATP. מבנה (A) של mantATP מראה את המיקום של fluorophore mant מצומדת לאו 2 &#39;או 3&#39; עמדה בריבוז. ספקטרום הקרינה מנורמל לmantATP וmantADP בפתרון (mAXP) (ב) וmantATPד mantADP בקומפלקס עם kinesin MCAK (mATP + MCAK וmADP + MCAK). ספקטרום mantATP הם מנורמלים לקרינה על המקסימום לmantATP בפתרון ואת ספקטרום mantADP הם מנורמלים לקרינה על המקסימום לmantADP בפתרון. הספקטרום של נוקלאוטידים mant מעורבבים עם MCAK נאספים בהודעת ערבוב 1 דקות. הריכוז של חומרים כימיים והגדרות fluorimeter כמתואר בפרוטוקול הצעדים 1.1 ו1.2. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> מדידת .3 איור של קבוע קצב עמותה של mantATP. (א) סכמטי המתאר את התגובה שלוקחת הודעה מקום ערבוב על ידי הפסיקה זרימה: mantATP (mATP) נקשר לחינם נוקלאוטיד-kinesin. עוצמת הקרינה של עליות קבוצת mant על ​​כריכה לחלבון. (ב) שינוי אות הקרינה (השחורה) שנצפתה על ערבוב mantATP (ז 25) עם MCAK (נו 5 M<html> -Cleotide חופשי,). הנתונים אלה הוא בכושר (אדום המקווקו) לפונקציה אחת מעריכי בתוספת שורה של שיפוע שלילי קבוע, המהווה photobleaching של fluorophore mant (ראה דיון) הבלעה:. תוכן של המזרקים לפני הערבוב על הפסיקה זרימת fluorimeter. קבועים (C) שיעור (תצפיות k) שנקבעו לתגובה של mantATP עם MCAK ללא נוקלאוטיד זממו נגד ריכוז של mantATP. עלילה זו תהיה אזור ליניארי עם השיפוע להיות קבוע שיעור עמותה (איור 1, k 1) עם יחידות של M -1 s -1 וy ליירט להיות קבוע שיעור דיסוציאציה (איור 1, k -1) עם יחידות של s -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> gether.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" /> . איור 4 מדידה של קבוע קצב דיסוציאציה לmantADP () סכמטי המתאר את התגובה שלוקחת הודעה מקום ערבוב על ידי הפסיקה זרימה: kinesin מראש עם mantADP מדולל לעודף של ATP ללא תווית. mantADP מתנער הוא הוחלף על ידי ATP ללא תווית, ובכך למנוע את תגובתו האחורית של עמותת mantADP (ראה דיון). עוצמת הקרינה של קבוצת mant יורדת על ניתוק מהחלבון. ירידת פלואורסצנטי (B) שנצפתה על הניתוק של mantADP מkinesin MCAK. אות הקרינה (השחורה) היא בכושר (אדום המקווקו) לאחד מעריכי בתוספת שורה של שיפוע שלילי מתמיד כדי להסביר photobleaching של קבוצת mant (ראה דיון). קבוע השיעור שנקבע הוא שיעור קבוע לניתוק של mantADP (איור 1, k4) הבלעה:.. תוכן של המזרקים לפני הערבוב על הפסיקה זרימת fluorimeter <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins at JoVE.com

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Kinesins מתאפיין באינטראקצית נוקלאוטיד תלוי עם microtubules: מחזור של מחזור ATP מצמידים את מעגל האינטראקציה microtubule. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לנתח את קינטיקה של מעברי נוקלאוטיד בודדים במחזור מחזור ATP של kinesin באמצעות נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently והפסיקה זרימת הקרינה.

שימוש בנוקלאוטידים פסיקת זרימת הקרינה ותווית לניתוח מחזור מחזור ATP של Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Research

JoVE Journal

Chemistry

15.4K Views.  University of Nottingham.  Kinesins מתאפיין באינטראקצית נוקלאוטיד תלוי עם microtubules: מחזור של מחזור ATP מצמידים את מעגל האינטראקציה microtubule. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לנתח את קינטיקה של מעברי נוקלאוטיד בודדים במחזור מחזור ATP של kinesin באמצעות נוקלאוטידים שכותרתו fluorescently והפסי?...

Video: Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of molecular iodine to samarium metal in THF.1,2-3 It is a mild and selective single electron reductant and its versatility is a result of its ability to initiate a wide range of reductions including C-C bond-forming and cascade or sequential reactions. SmI2 can reduce a variety of functional groups including sulfoxides and sulfones, phosphine oxides, epoxides, alkyl and aryl halides, carbonyls, and conjugated double bonds.2-12 One of the fascinating features of SmI-2-mediated reactions is the ability to manipulate the outcome of reactions through the selective use of cosolvents or additives. In most instances, additives are essential in controlling the rate of reduction and the chemo- or stereoselectivity of reactions.13-14 Additives commonly utilized to fine tune the reactivity of SmI2 can be classified into three major groups: (1) Lewis bases (HMPA, other electron-donor ligands, chelating ethers, etc.), (2) proton sources (alcohols, water etc.), and (3) inorganic additives (Ni(acac)2, FeCl3, etc).3
Understanding the mechanism of SmI2 reactions and the role of the additives enables utilization of the full potential of the reagent in organic synthesis. The Sm-Barbier reaction is chosen to illustrate the synthetic importance and mechanistic role of two common additives: HMPA and Ni(II) in this reaction. The Sm-Barbier reaction is similar to the traditional Grignard reaction with the only difference being that the alkyl halide, carbonyl, and Sm reductant are mixed simultaneously in one pot.1,15 Examples of Sm-mediated Barbier reactions with a range of coupling partners have been reported,1,3,7,10,12 and have been utilized in key steps of the synthesis of large natural products.16,17 Previous studies on the effect of additives on SmI2 reactions have shown that HMPA enhances the reduction potential of SmI2 by coordinating to the samarium metal center, producing a more powerful,13-14,18 sterically encumbered reductant19-21 and in some cases playing an integral role in post electron-transfer steps facilitating subsequent bond-forming events.22 In the Sm-Barbier reaction, HMPA has been shown to additionally activate the alkyl halide by forming a complex in a pre-equilibrium step.23
Ni(II) salts are a catalytic additive used frequently in Sm-mediated transformations.24-27 Though critical for success, the mechanistic role of Ni(II) was not known in these reactions. Recently it has been shown that SmI2 reduces Ni(II) to Ni(0), and the reaction is then carried out through organometallic Ni(0) chemistry.28
These mechanistic studies highlight that although the same Barbier product is obtained, the use of different additives in the SmI2 reaction drastically alters the mechanistic pathway of the reaction. The protocol for running these SmI2-initiated reactions is described.

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

A straightforward procedure for the preparation of samarium diiodide (SmI2) in THF is described. The role of two main additives namely hexamethylphosphoramide (HMPA) and Ni(acac)2 in Sm mediated reactions is demonstrated in the Sm-Barbier reaction.

הכנה ושימוש של סמריום Diiodide (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) בסינתזה אורגנית: התפקיד מכניסטית של HMPA ומלחי ניקל (השני) בתגובת Barbier סמריום

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

קביעת המישורים המחייבים קרח של חלבונים נגד קיפאון על ידי זיקה למטוס קרח מבוסס פלואורסצנטיות

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

השימוש בגז כרומטוגרפיה לנתח הלחנה שינויים של חומצות שומן ברקמות חולדה כבד במהלך הריון

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

ניטור קרינה מבוססת פעילות PAD4 באמצעות אנלוגי מצע פרו-הקרינה

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Preparation and Use of Carbonyl-decorated Carbenes in the Activation of White Phosphorus

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures in multi-gram scale quantities. The goal of this manuscript is to clearly detail how to handle and prepare these unique carbenes such that a synthetic chemist of any skill level can work with them. The two carbenes described are a diamidocarbene (DAC, carbene 1) and a monoamidoaminocarbene (MAAC 2). These carbenes are highly electron-deficient and as such display reactivity profiles that are atypical of more traditional N-heterocyclic carbenes. Additionally, these two carbenes only differ in their electrophilic character and not their steric parameters, making them ideal for studying how carbene electronics influence reactivity. To demonstrate this phenomenon, we are also describing the activation of white phosphorus (P4) using these carbenes. Depending on the carbene used, two very different phosphorus-containing compounds can be isolated. When the DAC 1 is used, a tris(phosphaalkenyl)phosphane can be isolated as the exclusive product. Remarkably however, when MAAC 2 is added to P4 under identical reaction conditions, an unexpected carbene-supported P8&#160;allotrope of phosphorus is isolated exclusively. Mechanistic studies demonstrate that this carbene-supported P8allotrope forms via a [2+2] cycloaddition dimerization of a transient diphosphene which has been trapped by treatment with 2,3-dimethyl-1,3-butadiene.

Here, we present a protocol for the synthesis of two carbonyl-decorated carbenes. The protocol makes these interesting compounds readily available to chemists of all skill levels. In addition to the synthesis of these two carbenes, their use in the activation of white phosphorus is also described.

הכנה ושימוש בקרבנים מעוטרים קרבוניל בהפעלה של זרחן לבן

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET radiopharmaceuticals. Due to their multi-day biological half-life, antibodies must be labeled with positron-emitting radionuclides with relatively long physical decay half-lives. Traditionally, the positron-emitting isotopes 124I (t1/2 = 4.18 d), 86Y (t1/2 = 14.7 hr), and 64Cu (t1/2 = 12.7 hr) have been used to label antibodies for PET imaging. More recently, however, the field has witnessed a dramatic increase in the use of the positron-emitting radiometal 89Zr in antibody-based PET imaging agents. 89Zr is a nearly ideal radioisotope for PET imaging with immunoconjugates, as it possesses a physical half-life (t1/2 = 78.4 hr) that is compatible with the in vivo pharmacokinetics of antibodies and emits a relatively low energy positron that produces high resolution images. Furthermore, antibodies can be straightforwardly labeled with 89Zr using the siderophore-derived chelator desferrioxamine (DFO). In this protocol, the prostate-specific membrane antigen targeting antibody J591 will be used as a model system to illustrate (1) the bioconjugation of the bifunctional chelator DFO-isothiocyanate to an antibody, (2) the radiosynthesis and purification of a 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate, and (3) in vivo PET imaging with an 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in a murine model of cancer.

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Bioconjugation וRadiosynthesis של<sup&gt; 89</sup&gt; נוגדנים שכותרתו ZR-DFO

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

ויזואליזציה של ספקטרומטריית אמביינט המוני עם השימוש של צילומי שליארן

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Radiolabeling היעיל של חלקיקי זהב על ידי שימוש<sup&gt; 125</sup&gt; שכותרתו לי אזיד תותבת קבוצה

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

הכנה והערכה של<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc שכותרתו Tridentate chelates לחינוך קדם-מיקוד שימוש Bioorthogonal לכימיה

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...