Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

שיבוט 1. של wild-type-tagged tdTomato ו Motorless KIF5B חלבונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבר את cDNAs עבור wild-type האדם וחלבונים KIF5B motorless באמצעות פריימרים בטבלה 1, DNA פולימרז תקי (5 יחידות עבור 100 μl), תמהיל dNTP (2 מ&quot;מ לכל deoxynucleotide) חיץ 10X שלה במשך 30 מחזורים. כל מחזור מורכב צעד denaturation (95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות), צעד חישול (45 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות) ו צעד ארכה (72 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את מוצר ה- DNA מוגבר עם נפח שווה של פנול / כלורופורם (1: 1). הערה: פנול הוא דליק ועלול לגרום לכוויות. כלורופורם מהווים סכנה. יש להימנע ממגע ישיר עם אותם ולהשתמש בהם תחת במנדף כימי. לחלופין, מוצרי ה- PCR יכול להיות מטוהר על ידי ערכות שונות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על 18,000 XG ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 1 דקה. מעבירים את הפתרון מימית לצינור חדש ולחלץ עם נפח שווה של כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְסוֹבֵבב 18,000 XG ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 0.5 דקות. מעביר את הפתרון מימי לצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את בתמיסה מימית עם נפח לעשירית 3 M Na-אצטט ושני כרכים של אתנול אבסולוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על 18,000 XG ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מחק את הפתרון המימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור DNA עם שתי נפח של אתנול 75%. מחק את פתרון המימי ואוויר יבש גלולת DNA בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. Resuspend גלולה DNA ב -34 מים μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר המוצרים המוגברים נפח הסופי של 40 μl עם הגבלת אנזימי סאלי (10 יחידות) ו BamHI (10 יחידות) ו -4 μl של חיץ 10X שלהם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי שעות. פתור את המוצרים מתעכל ג&#39;ל agarose (1.0% ב 100 V) המכיל (מ&quot;ל 0.2 מיקרוגרם /) ethidium ברומיד. הערה: ברומיד Ethidium הוא mutagen חזק והוא יכול להיספג דרך העור. לכן, חשוב להימנע ממגע ישיר או עקיף wה- i ethidium ברומיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הערוצים המתאימים לניקוי לפי עמודות. לשקול את הג&#39;ל agarose המכיל את קטע DNA. ואז לפזר אותו למאגר solubilization (300 μl עבור 0.1 גרם) ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון הביא לעמודה ספין ב microcentrifuge בטמפרטורת החדר למשך 5 שניות. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העמודה עם חיץ solubilization 0.5 מ&quot;ל על ידי חזרה על שלב 1.5. לשטוף את העמודה שוב עם חיץ 0.75 מ&quot;ל לשטוף על ידי חזרה על שלב 1.5. ספין בעמודה למשך 2 דקות כדי להיפטר למאגר לשטוף הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute שבר DNA עם 50 מים μl ידי חזרה צעד 1.5. להעריך את הריכוז של קטע DNA על ידי הפעלת aliquot של זה נגד סולם גודל ה- DNA ג&#39;ל agarose (1.0% ב 100 V) המכיל ברומיד ethidium (0.2 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור את המוצרים מטוהרים (כ -100 ng) עם וקטור ptdTomato-C1 17 (כ -100 ng) מתעכל בעבר עם הדואר באותו הגבלה אנזימים 10 μl באמצעות האנזים T4 DNA (2,000 יחידות) ו 1 μl 10X חיץ קשירת בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות. הערה: סוג-בר מוטציה motorless מכיל חומצות אמינו מ 2 כדי 963 ו 584 כדי 963, בהתאמה. בעבר, מוטצית KIF5B motorless גדולה שמשה לזיהוי תפקידיו 9. מוטצית KIF5B motorless קטנה שמשה המחקרים הנוכחיים להגדיל את רמות הביטוי שלה. </li></ol> 2. מיקרוסקופי Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים חיים או דימות פלואורסצנטי עקיף עם הגדלה או מתחת 40X, זרע 0.2-0.3 מיליון תאים הלה ב 1 מ&quot;ל בינוני שלם [בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS)] בכל טוב של צלחת שש היטב. לגדול ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מחקרים immunofluorescence עקיף עם בהגדלה מעל 40X, לשטוף כוסות כיסוי (18 מ&quot;מ x 18 מ&quot;מ; 1.5 עובי) בקצרה אתנול אבסולוטי ואוויר-לייבש אותםהבארות של צלחת שש היטב, בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 0.2-0.3 מיליון תאים ב 1 מ&quot;ל להשלים בינוני DMEM בכל טוב של צלחת שש היטב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת קומפלקס Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, בתוך ארון בטיחות ביולוגית, לדלל 0.6 מיקרוגרם (סה&quot;כ) של פלסמיד ביטוי wild-type-tagged tdTomato או KIF5B motorless בנוכחות או בהיעדר פלסמיד ביטוי חלבון מועמד מטענים (pTagCFP-c-myc 5 ) עם המדיום transfection 0.1 מ&quot;ל צינור 1.6 מ&quot;ל microcentrifuge. הערה: וקטור pTagCFP-c-myc מבטא את c-myc-tagged TagCFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.8 μl של מגיב transfection עד בינוני 0.1 מ&quot;ל transfection ב עוד צינור 1.6 מ&quot;ל microcentrifuge. בדרך כלל, להכין תערובת אב של מגיב transfection מדולל מספיק 12 דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות, בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מגיב transfection 0.1 מ&quot;ל מדולל אל DNAs 0.1 מ&quot;ל מדולל. מִיx את התוכן על ידי היפוך הצינורות. ספין צינורות במשך 5 שניות ב microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 45 דקות, בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמי התאים שנזרעו עם בופר פוספט (PBS) במהלך תקופת הדגירה של ההיווצרות של מתחם transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום של תאים זורעים בכל טוב עם 0.8 מ&quot;ל בינוני transfection מחומם מראש. החזר את הצלחות אל האינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 45 דקות, להוסיף 0.2 מ&quot;ל של המתחם מגיב DNA / transfection (מוכן בשלב 2.3) dropwise היטב כל הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Rock the צלחת 6 היטב בעדינות במשך 5 שניות, לפני שהם מוחזרים החממה ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6-8 שעות, להחליף בינוני עם מדיום DMEM המלא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור דימות פלואורסצנטי Live- תא 18 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 16 ​​שעות של נוספיםt 37 ° C, להוסיף את הכתם intercalating DNA Hoechst 33342 למדיום לריכוז סופי של 1 מיקרומטר. הערה: Hoechst 33342 הוא צבע intercalating תא חדיר, DNA כי כתמי גרעין התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאי transfected במשך 10 דקות בחממה על 37 מעלות צלזיוס לפני לבחון אותם על מנת לתת ביטוי חלבוני ניאון על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מטרת 40X. הסטים מסנן DAPI, CFP, FITC ו Cy3 הם (ננומטר Ex350 / Em460 ננומטר), (ננומטר Ex436 / Em480 ננומטר), (ננומטר Ex470 / Em525 ננומטר) ו- (ננומטר Ex545 / Em605 ננומטר), בהתאמה. הערה: אם הרקע הוא גבוה בשל פלואורסצנציה אוטומטית של מדיום DMEM המלא, בינוני ללא פנול אדום משמש. </li></ol></li></ol> 3. מחקרי Immunofluorescence עקיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון Paraformaldehyde <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול אבקת paraformaldehyde (4 גרם לכל 100 מ&quot;ל PBS) ולהוסיף אותו PBS. הערה: Paraformaldehyde הוא מוצק דליק וכן hazar הסרטן פוטנציאליד. זה מעצבן את העיניים, דרכי הנשימה והעור. לכן, חשוב להימנע ממגע עם או שאיפה של paraformaldehyde. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת NaOH לפתרון (150 μl 10 N NaOH / 100 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הפתרון על 37 42 ° C במשך 2-3 שעות עם רעד מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל- pH 7.0 ידי הוספת חומצה אצטית קרחונית לפתרון (כ -75 μl / 100 מ&quot;ל) לאחר אבקת paraformaldehyde נמס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יעד חלבונים מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה נוספת עבור 16 שעות ב 37 ° C, לשטוף את התאים transfected בטמפרטורת החדר פעם עם PBS על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם 1 מ&quot;ל של שהוכן זה עתה, פתרון paraformaldehyde 4% בכל טוב. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם PBS פעם על ידי מתערבל במשך 5 שניות צלחת שש היטב. מחק את הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם 1 מ&quot;ל של 0.1% Triton-X 100 (PBS) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. detergent Triton-X 100 יהיה permeabilize קרום תא כדי לאפשר גישה של נוגדני המטרות התאיות שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם PBS ארבע פעמים על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות בכל פעם. מחק את הפתרון לאחר כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם 1 מ&quot;ל של נוגדנים ראשוניים (נוגדן ארנבת c-myc או נוגדן עכבר p53; 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) בתוך FBS 10% בפתרון PBS בטמפרטורת החדר על ידי נדנדה עבור 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS ארבע פעמים על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות בכל פעם. מחק את הפתרון לאחר כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 1 מ&quot;ל של נוגדנים משני ניאון מצומדות צבע (נוגדן 488 מצומדות נגד ארנב או אנטי עכבר IgG אלקסה פלואוריד; 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב 10% FBS ב PBS בטמפרטורת החדר בחושך ידי נדנדה עבור 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם PBS ארבע פעמים על ידי מתערבל את הצלחת שש היטב במשך 5 שניות בכל פעם. מחק את הפתרון לאחר כל שטיפה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרעיני מכתים שמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; דגירה התאים עם 1 מ&quot;ל של צבע intercalating DNA 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב PBS בטמפרטורת החדר, בחושך במשך 10 דקות. עבור לשלב 3.4 כשאף משקפי כיסוי מנוצלים. הערה: DAPI הוא צבע intercalating DNA כי כתמי גרעין התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 10 μl של פתרון גובר על כל שקופית מיקרוסקופ. הר כל זכוכית מכסה על הפתרון גובר על שקופיות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך הלילה האפל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצוות של משקפי הכיסוי עם לק. מניחים בחושך בתוך במנדף לילה להסיר את האדים לק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ פלואורסצנטי 19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המטרה 40X. הסטים מסנן DAPI, CFP, FITC ו Cy3 הם (ננומטר Ex350 / Em460 ננומטר), (ננומטר Ex436 / Em480 ננומטר), (ננומטר Ex470 / Em525 ננומטר) ו- (ננומטר Ex545 / Em605 ננומטר), בהתאמה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li><li>Yu, Y., Feng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin+family+proteins+in+tumorigenesis+and+progression:+potential+biomarkers+and+molecular+targets+for+cancer+therapy.">The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy.</a> Cancer. 116, 5150-5160 (2010).</li><li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+control:+regulation+of+kinesin+motors.">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+c-MYC+by+Kinesin-1+for+proteasomal+degradation+in+the+cytoplasm.">Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm.</a> Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).</li><li>Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant-negative+myosin+Va+impairs+retrograde+but+not+anterograde+axonal+transport+of+large+dense+core+vesicles.">Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles.</a> Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).</li><li>Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+and+CRMP-2+complex+is+transported+via+Kinesin-1.">Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1.</a> J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).</li><li>Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+is+required+for+the+transport+of+fragile+X+mental+retardation+protein+(FMRP)+granules.">Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules.</a> Biol Cell. 106, 57-71 (2014).</li><li>Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Kif5B+in+axonal+localization+of+Kv1+K(+)+channels.">The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels.</a> Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).</li><li>Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+interacts+with+Rab8a+on+a+tubular+network+containing+EHD1+and+EHD3.">Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3.</a> Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).</li><li>Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+functional+coupling+of+kinesin-1A+and+dynein+motors+in+the+bidirectional+transport+of+neurofilaments.">Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments.</a> Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).</li><li>Zadeh, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif5b+is+an+essential+forward+trafficking+motor+for+the+Kv1.5+cardiac+potassium+channel.">Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel.</a> J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).</li><li>Su, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF5B+promotes+the+forward+transport+and+axonal+function+of+the+voltage-gated+sodium+channel+Nav1.8.">KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8.</a> J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).</li><li>Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daxx+functions+as+a+scaffold+of+a+protein+assembly+constituted+by+GLUT4,+JNK1+and+KIF5B.">Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B.</a> . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).</li><li>Cho, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+kinesin-binding+domain+of+RanBP2+to+KIF5B+and+KIF5C+determines+mitochondria+localization+and+function.">Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function.</a> Traffic. 8, 1722-1735 (2007).</li><li>Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+receptor,+p180,+interacts+with+kinesin+heavy+chain,+KIF5B.">The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B.</a> Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging.">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).</li><li>Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+kinesin+activity+from+structure-based+computer+screening.">Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening.</a> Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).</li><li>Zhang, Y., Xiong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+p53+ubiquitination+and+nuclear+export+by+MDM2+and+ARF.">Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF.</a> Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).</li><li>Michael, D., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p53-Mdm2+module+and+the+ubiquitin+system.">The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system.</a> Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).</li><li>Kneussel, M., Wagner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+at+neuronal+synapses:+drivers+of+membrane+transport+and+actin+dynamics.">Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).</li><li>Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+family:+unconventional+roles+of+actin-dependent+molecular+motors+in+immune+cells.">The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells.</a> J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).</li></ol>

פרסום והפקה וגישה חופשית של מאמר זה הוא שילם על ידי רוש.

השיטה המתוארת מנצלת את המאפיינים של מוטצית KIF5B motorless, אשר חסרה את היכולת לנוע לאורך microtubules, אך שומרת לעצמה את היכולת ליצור דימרים עם KIF5B wild-type, ובכך לאפשר את חלבון tetrameric לקיים אינטראקציה עם אותם חלבוני המטען כמו wild-type KIF5B. KIF5B Motorless, ולכן, משמש מוטציה וצורות שליליות דומיננטיות mislocalized אגרגטים עם המטענים שלה. שיטה זו מוכחת לזהות את המטען Kinesin-1 c-myc (איור 1) 5. במאמר זה, באותו מוטציה KIF5B motorless שימש לזיהוי p53 כעוד מטען הפוטנציאל של Kinesin-1 (איור 2). זה מראה כי המתודולוגיה אינו ריאלי לזהות מטענים אחרים של Kinesin-1. יתר על כן, את הספציפיות של המוטציה מסופקת על ידי חוסר ההשפעה של המוטציה על חלבון הבקרה השלילי c-Fos (איור 3). בפרוטוקול זה, tdTomato מתויג-טאי ברPE או חלבון KIF5B motorless הוא coexpressed עם חלבון אחר מטען מועמד חלבון מתויג ניאון. במקרה זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי Live- תא הדמיה מבוצעים. ההיווצרות של אגרגטים ניתן לייחס ידי הדמית זמן לשגות. לחלופין, חלבון מתויג tdTomato מתבטא לבד ואת חלבון מטען המועמד ברמות הפיזיולוגיות שלה היא דמיינה ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עקיפה באמצעות נוגדנים ספציפיים. TdTomato חלבון פלואורסצנטי נבחר הבהירות שלה בצילום 17. אם הרקע הוא גבוה בשל פלואורסצנציה אוטומטית של מדיום DMEM המלא, בינוני ללא פנול אדום משמש. מוטצית KIF5B motorless יוצרת דימרים עם KIF5B wild-type stoichiometrically. לכן, חשוב להביע כמות מספקת של מוטצית KIF5B motorless ליצירת דימרים עם עמיתו wild-type כדי לעכב את התפקיד וכדי ליצור אגרגטים. כדי לטפל בבעיה זו, אופטימיזציה של expression של מוטציה motorless חיוני. זו מושג באמצעות מוטצית motorless קטנה המכילה את תחום dimerization. בנוסף, אופטימיזציה של מגיב ופרוטוקול transfection המתאימים גם הכרחית. משך הדגירה של תאים הלה עם מגיב DNA / transfection היה מותאם בתאים הלה לביטוי של חלבונים אקסוגני כדאיות התא. משך הדגירה ייתכן שיהיה צורך מותאם במיוחד שורות תאים אחרות. לקבלה בהגדלה בין 4X ל 40X, לא משקפי כיסוי נדרשים. תאים יכול להיבחן ישירות במי קידוחים. לכן, במקרה זה, הפרוטוקול הוא זול ונוח. לקבלה בהגדלה מעל 40X, תאים גדל על משקפי כיסוי הבארות, לאחר מכתים, הם רכובים על שקופיות מיקרוסקופ לבדיקה תחת מטרות-טבילת שמן. תצפית של אגרגטים של חלבון KIF5B motorless היא מוגבלת על ידי גודל של הציטופלסמה. נקל לזהות אתאגרגטים בתאי יונקים רבים. עם זאת, הוא יחסית קשה להתבונן המצרפים בתאים עצביים כאשר היקף בציטופלסמה קטן סביב הגרעינים והן neurites. הפרוטוקול משמש כדי להראות את הקשר בין KIF5B והמטענים שלה בנוסף שמרי in vivo השנייה היברידי מבחני נפתח ביוכימיים 13-16. כל אלה מבחני לקבוע את הקשר בתנאים פיזיים שונים ותוצאותיהם יכולים להשלים אחד את השני. יתר על כן, היתרון של assay הקרינה הזאת על מבחני אחרים היא שזה יכול להראות את הסדרת לוקליזציה subcellular של מטענים ידי KIF5B (איורים 1 ו -2). הפרוטוקול אינו מוגבל KIF5B וניתן להשתמש בו כדי לזהות מטעני חלבוני מנועים אחרים, כגון כמה מנועי kinesin אחרים 3 וחלק מנועי השרירן 23,24 בשימוש בתחבורה תאית של מטענים 3. חלבונים המנועים אלה מכילים גם תחומי מנוע לתנועה לאורך microtubules עבור מנועי kinesin ו microfilaments עבור מנועי שרירן, ומגזרי סליל מפותלים עבור oligomerization. רובם יוצרים homodimers 3,23. לכן, אסטרטגיה דומה ניתן ליישם אותם על ידי יצירת המוטציות השליליות הדומיננטיות motorless שלהם לזהות המטענים שלהם.

Kinesin-1 הוא חלבון מנוע שמתווך תחבורת האנטרוגרד של המטענים שלה 1,2. זהו heterotetramer של שתי יחידות המשנה של Kinesin אור שרשרת 1 (KLC1) ושתי יחידות משנה של שרשרות כבדות Kinesin (KHCs). KIF5B 1, KHC, מכיל תחום רכב בבית שלה N-terminal, אשר hydrolyzes ATP ו ממיר את האנרגיה הכימית לאנרגיה מכנית לתנועה לאורך microtubules. באזור C-terminal שלה מכיל את תחום dimerization כי אינטראקציה עם KLC1, אשר מקשר עם מטענים. Kinesin-1 משלוחי מטענים כגון שלפוחית, אברונים mRNAs 3,4. לאחרונה, KIF5B הוצגה להובלת גורם שעתוק גרעיני c-myc השפלה proteosomal בציטופלסמה 5. שלוש מתודולוגיות (מעכב כימי, siRNA / shRNA ו מוטציה שלילית דומיננטית) שמשו לעכב פונקצית Kinesin-1. כולם המושרה צבירה של c-myc בציטופלסמה. לחישוב על פי השיטה האחרון, c-myc הושפע רק על ידי negat הדומיננטיive מוטציה של KIF5B, אבל לא על ידי זה של חלבון אחר מנוע קשור KIF5A, הדבר המצביע כי המוטציה לא להשפעות כלליות על הרכיבים התאיים (כמו שיבוש microtubule) או על הצטברות חלבון. המוטציה השלילית הדומיננטית של KIF5B גם לא השפיעה גורם שעתוק אחר, דבר המצביע על כך זה לא להשפעות כלליות על גורמי שעתוק. במקום זאת, הוא טוען כי המוטציה השלילית הדומיננטית מפעילה השפעות ספציפיות על המטענים שלה. שימוש מוטציות שליליות דומיננטיות נפוץ בתחום חלבוני מנוע. מוטציות motorless דומה kinesins ו myosins שימשו בעבר. הם שימשו בעיקר כדי להדגים את ההשפעות של מוטציות על localizations subcellular של מטענים שלהם או על תפקודים תאיים 6-12. פחות דגש הושם על הקשר המרחבי בין מוטנטים המטענים המושפעים מהם. עם זאת, בכמה מקרים, המוטציות נצפו לשתף למקם עם ca שלהם6,10 rgos. האינטראקציה בין KIF5B והחלבונים הקשורים אליו אושרה בעבר על ידי שמרי in vivo assay השני היברידי מבחני הנפתח ביוכימיות כגון שיתוף immunoprecipitation וב מבחני נפתח במבחנת 13-16. במאמר זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשיטה חזותי נוסף מתואר לזהות חלבוני מטען KIF5B. השיטה עושה שימוש מוטצית KIF5B motorless שפועלת מוטציה שלילית דומיננטית. גוגל מאגד בציטופלסמה ומשרת צבירה של המטענים שלה. התיוג של wild-type ו מוטציה KIF5B motorless עם חלבון פלואורסצנטי tdTomato 17 מאפשרת הדמיה שלהם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חלבוני KIF5B מתויגים יכולים להיות שותף הביע עם חלבון מועמד התמזג חלבון פלואורסצנטי שונה עם תכונות ספקטרליות מופרדות כראוי מתג KIF5B. החלבונים מתויגים הם נצפו ישירות בתאים חייםתחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אינדוקציה של אגרגציה של החלבונים המועמדים על ידי מוטצית KIF5B motorless תאשר כי חלבון המועמד הוא מטען in vivo של KIF5B. יתר על כן, חלבוני KIF5B מתויג tdTomato יכולים להתבטא לבד בתאים ללמוד והשפיעו על חלבוני מטען אנדוגני. מאוחר יותר, מיקרוסקופיה immunofluorescence מתנהלת שבו תאי transfected הם קבועים מוכתם נוגדן ספציפי נגד חלבון מועמד אנדוגני, ואחריו נוגדנים משני מתאימים מצומדות עם פלורסנט לצבוע. במקרה זה, חלבון מועמד אנדוגני ברמה הפיזיולוגית שלו נלמד. מוטציות motorless דומות חלבוני מנועים אחרים יכולות להיות מוכן לזהות המטענים שלהם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="620">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">absolute ethanol (200 proof)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">BP2818</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM-I (transfection medium)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, para</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">10342020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">12111424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Quick Gel Extraction kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K210012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">c-MYC rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td align="right">5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p53 mouse antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescent microscope&#160;</td>
			<td colspan="2">Olympus IX71_Fluoview</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer software for imaging</td>
			<td>&#160;cellSens&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

אקסוגני הביע KIF5B wild-type הופיע בצורה הומוגנית בציטופלסמה, בעוד c-myc הופיע בעיקר בגרעין (איור 1 א). עם זאת, מוטציה KIF5B motorless יצרו אגרגטים ב (איור 1 א) בציטופלסמה. אגרגציה של KIF5B motorless המושרה צבירה של c-myc. אחוז התאים המבטאים מצטברים TagCFP מתויג c-myc ב התאים המבטאים KIF5B wild-type היה נמוך. עם זאת, זה היה משמעותית גבוה יותר כאשר KIF5B motorless היה שיתוף הביע (איור 1 א). שיתוף לוקליזציה שנצפה KIF5B מוטציה עם c-myc (איור 1) עולה כי KIF5B מסדיר את לוקליזציה subcellular של c-myc ו c-myc הוא מטען של Kinesin-1. בקרות שליליות שבו המבנים התבטאו לבד כלולים ב- הפאנל התחתון של איור 1A. התוצאות מראות כי אין דרך לדמם משמעותי emissio הקרינהn. KIF5B motorless הנגרמת גם אגרגציה של c-myc אנדוגני (איור 1B) ואת p53 גורם שעתוק (איור 2), המציין כי c-myc ו- p53 הם המטענים של Kinesin-1 ו KIF5B מסדיר את לוקליזציה subcellular של שני חלבונים אנדוגניים. יחד עם התוצאות כי מעכב Kinesin-1 עלה lactone בנגל (RBL) 20 גורם להיווצרות מינים משקל מולקולרי גבוה הן c-myc ו- p53 5, p53 עשוי מטען של Kinesin-1. מעניין לציין כי p53 גורם שעתוק הגרעיני, כמו c-myc, מיוצא גם מהגרעין אל הציטופלסמה שפל proteasomal 21,22. התנועה של גורמי שעתוק על ידי KIF5B מופיע להיות ספציפי כי הביטוי של מוטציה KIF5B motorless לא השפיע על לוקליזציה subcellular c-Fos או לגרום לו לצבור (איור 3). הנתונים לעיל מוכיחים כי methoד מועסק בפרסום זה מאפשר זיהוי-הסגולי הגבוהה של מטעני Kinesin-1. אסטרטגיה דומה ניתן להחיל חלבוני מנועים אחרים גם כן. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> איור 1: הביטוי של מוטציה KIF5B motorless גורם צבירה c-myc בציטופלסמה (א) תאים הלה היו transfected עם tdTomato מתויג wild-type (WT) KIF5B (אדום) ו TagCFP מתויג c-myc (כחול).. tdTomato מתויג WT KIF5B הופיע בעיקר בציטופלסמה, בעוד TagCFP מתויג c-myc הופיע בעיקר בגרעין. עם זאת, מוטציה KIF5B motorless מתויג tdTomato (אדום) יצרו אגרגטים filamentous או punctate בציטופלסמה. הביטוי של KIF5B motorless המושרה צבירה של c-myc. KIF5B המוטציה ו c-myc השותף המקומי יחד (ורוד). אחוזים של תאים (%) המציין אגרגטים של CFP-c-myc (%) מוצגים. התוצאות מוצגות כפיממוצע ± סטיית תקן (N = 3). בקרות שליליות עם ביטוי של חלבוני KIF5B tdTomato מתויג או TagCFP מתויג c-myc יחד עם וקטורים ריקים (V) מוצגות בפנל התחתון. (ב) תוצאות דומות התקבלו עם c-myc אנדוגני (ירוק) כאשר tdTomato מתויג WT או חלבונים KIF5B motorless (אדום) באו לידי ביטוי. מוטצית KIF5B motorless מתויגת tdTomato יצרה אגרגטים בציטופלסמה מושרה אגרגציה של c-myc אנדוגני. שני סוגי אגרגטים שותף מקומי יחד בציטופלסמה (כתום). הגרעינים הוכתמו לצבוע Hoechst 33342 או DAPI. סרגל קנה מידה; 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> איור 2: הביטוי של מוטצית KIF5B motorless גורם צבירת p53 אנדוגני tהוא בציטופלסמה. בתאים הלה, wild-type אקסוגניים-tagged tdTomato (WT) KIF5B (אדום) הופיע בעיקר בציטופלסמה, בעוד p53 אנדוגני (ירוק) הופיע בעיקר בגרעין. לעומת זאת, מוטצית KIF5B motorless מתויג tdTomato (אדום) יצרה אגרגטים בציטופלסמה. הביטוי של KIF5B motorless המושרה צבירה של p53, וכתוצאה מכך את שיתוף לוקליזציה של KIF5B ו- p53 בציטופלסמה (צהוב). הניסוי בוצע שלוש פעמים. הגרעינים הוכתמו DAPI לצבוע. סרגל קנה מידה; 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> איור 3:. הביטוי של מוטציה KIF5B motorless לא לגרום צבירה של c-Fos בציטופלסמה tdTomato מתויג wild-type (WT) KIF5B (אדום) הופיע<html> בעיקר בציטופלסמה של תאי הלה, תוך EGFP-ג-Fos (ירוק) הופיע בעיקר בגרעין. נהפוך הוא, מוטציה KIF5B motorless מתויג tdTomato (אדום) יצרו אגרגטים בציטופלסמה. הביטוי של KIF5B motorless לא להשרות את ההצטברות של c-Fos. הניסוי בוצע ארבע פעמים. הגרעינים של תאים הוכתמו DAPI לצבוע. סרגל קנה מידה; 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פריימר הגב, המשותף </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &quot; </td></tr><tr><td> פריימר wild-type KIF5B קדימה </td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &quot; </td></tr><tr><td> פריימר motorless KIF5B קדימה </td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &quot; </td></tr></tbody></table>: לשמור-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; טבלה 1: רצפים פריימר עבור שיבוט wild-type וחלבונים KIF5B motorless.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

כאן, פרוטוקול מוצג לזהות מטענים Kinesin-1. מוטציה motorless של שרשרת כבדה Kinesin-1 (KIF5B) אגרגטים בציטופלסמה ומשרה צבירה של מטענים שלה. אגרגטים שניהם מזוהים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אסטרטגיה דומה יכולה להיות מועסקת על מנת לזהות מטעני חלבוני מנועים אחרים.

זיהוי של Kinesin-1 מטענים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

identification-of-kinesin-1-cargos-using-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Views.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  כאן, פרוטוקול מוצג לזהות מטענים Kinesin-1. מוטציה motorless של שרשרת כבדה Kinesin-1 (KIF5B) אגרגטים בציטופלסמה ומשרה צבירה של מטענים שלה. אגרגטים שניהם מזוהים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אסטרטגיה דומה יכולה להיות מועסקת על מנת לזהות מטעני חלבוני מנועים אחר...

Video: Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

ניתוח של Autophagy ב<em&gt; Chrysogenum Penicillium</em&gt; על ידי שימוש ברפידות רעב בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...