The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).

הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש עבור יישומים רבים כגון כימות של פילמור phagocytosis ויקטין הכמשמש בעבודה שפורסמה בעבר שלנו 12. הפרוטוקול משאיל את עצמו למגוון רחב של שינוי, וסוגי תאי טבלה 1 וחלקיקים נוצלו בהצלחה בלימודים האחרונים. שימוש סטנדרטי של פרוטוקול זה לכימות של פילמור phagocytosis או אקטין מתואר בתרשים 1. <img alt="תרשים 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram1.jpg" width="600" /> תרשים 1:. תרשים של assay fluorometric לכימות של פילמור phagocytosis ויקטין לאחר התאים מצופה, טופלו, ואפשרו לדבוק, חלקיקים שכותרתו עם הקרינה ירוקה (FITC) מתווספים לתאים לphagocytosis. תגובה הוא נעצר על ידי trypan או antibiלשטוף otic (כדי למנוע חלקיקים-הפנים שאינם) והקיבעון מתבצע עם paraformaldehyde 4%. תאים הם מוכתמים לאחר מכן עם תווית אדומה ניאון אקטין (phalloidin rhodamine) ותווית כחולה ניאון (DAPI). אינדקסים של phagocytosis ופילמור יקטינו לכמת כמו יחס של יחידות הקרינה היחסית של ירוק / כחול (FITC / DAPI), או הקרינה אדומה / כחולה (rhodamine / DAPI). 1. ציפוי ותאי טיפול הערה: לפני תחילת, לשקול הפעלת הטיפולים עם לפחות 4 משכפל טכני, וכוללת את הפקדים הבאים בפריסת הצלחת: תאים בלבד (בלא כתם, עם DAPI לבד או rhodamine לבד) וחלקיקים בלבד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל את כל התוספת של חומרים כימיים בצעדים 1-4 במנדף תרבית תאים סטריליים כדי להגן על הדגימות מזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקרופאגים צלחת (קו תא J774 עכברי) בצלחת 96-היטב ב1-5 x 10 4 תאים ב -50 μl (לכל טוב)<html> של תוספת תקשורת שחומם מראש. צלחות אידיאליים לשיטה זו הן 96-גם צלחות שחורות עם תחתית שקופה או שחורה, תלוי ביכולות קורא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקשורת בתוספת, להשתמש בחום של 10% מומת FBS כדי למנוע הפרעה של מפל משלים, ופניצילין 1% / סטרפטומיצין (אם לא באמצעות חיידקים חיים לphagocytosis). אם תאים חסיד באמצעות לאפשר 1-2 שעות להידבקות, ולתאים שאינם חסיד, ספין למטה הצלחת עם תאים במשך 10 דקות ב 500 x גרם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אגוניסטים / יריבים רצויים או שליטה ברכב בריכוז 2x (resuspended ב PBS או יותר עדיף, בתקשורת בתוספת) ב -50 μl עבור נפח סופי של 100 μl (1x) ו דגירה של כמות רצויה של זמן. מאגרי פיפטה ומגיב רב-ערוצי יאפשר עיבוד המהיר ביותר. </li></ol> 2. Opsonization של חלקיקי פלורסנט ftp_upload / 52,195 / &quot;width =&quot; 500 52195table1.jpg &quot;/&gt; סוגי תאים נבדקו וחלקיקי ניאון בניתוח fluorometric של phagocytosis ופילמור אקטין טבלה 1 מדגימה שילובים של סוגי תאים (שורות תאים, ותאים ראשוניים) שהקבוצה שלנו השתמשה באמצעות שיטת fluorometric: טבלה 1.. מלבד מסתכל על phagocytosis ופילמור אקטין על ידי תאים מסוג בר, יש לנו גם כמה מנוצלת של חלקיקים אלה לבדיקה של phagocytosis על ידי תאי transfected להביע GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק). גם הקרינה של התאים transfected עם פלסמידים המכילים כתבי ניאון יכולה לשמש כסמן סלולארי בנוסף לDAPI אגדה בטבלה. - פילמור אקטין; P - phagocytosis; PT - phagocytosis ידי GFP שכותרתו תאי transfected; OPDex - opsonized חרוז dextran; HKOP - חום הרוגים opsonized. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שחלקיקים ותוויות ניאון מוגנים מפני אור בכל העת, during עיבוד, כביסה, כמו גם במהלך הדגירה על מנת למנוע photobleaching <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלקיקים יבשים, לשקול את חיידקים נהרגו חום ניאון opsonized (HKOP) (E2861: זן E. coli K-12), תוך שימוש במפרטים של היצרן. תשמור על עצמך כדי לוודא שהחשבונות ההמוניים במשך 10: 1 - 20: 1 חיידקים: יחס תא (או לפחות 10: 1 - נפוצה בכימות של phagocytosis) 13,14. מספר החלקיקים יכול להיות מסופק על ידי היצרן או נקבע באמצעות couting דילולים סדרתי של 1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון מניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 50 μl PBS ו מערבולת דקה 1 בהגדרה הגבוהה ביותר. ודא vortexing הנכון (כאן ובכל רחבי הפרוטוקול) כחלקיקים נוטים לצבור אשר עשוי להשפיע יעילות של opsonization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חלקיקים בתרחיף כגון חרוזים dextran ככותרתו fluorescently (חרוזים DEX), מערבולת פתרון מניות דקות 1, לקחת 50 μl של השעיה או בהתאם לריכוז חרוז בד הנפחetermine הר של חרוזים כדי להקל על 10: 1 חרוז: יחס תא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של מגיב opsonizing לחלקיקים ונמרץ מערבולת עוד דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה החלקיקים עם opsonizing מגיב על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, צנטריפוגות החלקיקים במשך 5 דקות ב 500 XG, ולהסיר את supernant מכיל מגיב opsonizing עודף. לשטוף את החלקיקים על ידי הוספה של PBS 100 μl, מערבולת resuspend גלולה, וcentrifugate במשך 5 דקות ב 500 x גרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים אלה שתי פעמים כדי להבטיח opsonization וההסרה של נוגדן מאוגד נכונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון העבודה של חלקיקי opsonized ידי resuspending ב 5 מיליליטר של תקשורת (מספיק לצלחת אחת 96-היטב) ולאחסן הרחק מאור עד בנוסף לתאים. </li></ol> 3. phagocytosis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פתרון העבודה של חלקיקים במאגר מגיב סטרילי. מכאן, להוסיף 5056; l של חלקיקי opsonized לתאים מוכנים בשלב 1 (לריכוז סופי של 50 ng / ml) ולאפשר phagocytosis להתרחש בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים. מודגמים להלן שתי שיטות של phagocytosis שניתן להעריך בשיטה זו (תרשים 2). </li></ol><img alt="תרשים 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52195/52195diagram2.jpg" width="600" /> תרשים 2:. השוואה של phagocytosis הרציף לעומת לסנכרן phagocytosis הרציף מציינת הפנמה מתמשכת של חלקיקים לאורך זמן כפי שהם מגיעים לאט את התאים על תחתית הבאר. צעד מנוגד סנכרון (צנטריפוגה) מאלץ את החלקיקים לשקוע לתחתית, שיפור הקשר עם חלקיקי התא, ושהוביל להפנמה מיידית על ידי התאים. phagocytosis המסונכרן הוא תהליך מהיר שמהירות רבה יותר מפנימים חלקicles בשל תא המוגבר: קשר חלקיקים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיטה רציפה phagocytosis (תרשים 2) המאפשר לתאי phagocytose רציפות חיידקי opsonized כפי שהם שוקעים לאט לתחתית ובאים במגע עם תאים, לנצל מסגרות זמן ארוכות יותר כדי לאפשר לחיידקים להגיע לתחתית הבאר ולקבל ב לגעת בתאים. אם ביצוע ניסוי timecourse, להוסיף חיידקים במרווחי זמן שונים ולעצור את כל הצלחת של תגובות באותו הזמן על מנת לשפר את מהירות העיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשיטה המסונכרן phagocytosis (תרשים 2) שמשפרת את החלקיקים: תא קשר באמצעות צנטריפוגה, ספין למטה כל הצלחת המכילה תאים וחלקיקים (5 דק &#39;ב 500 XG) ברגע שהחלקיקים מתווספים, כדי להקל על סנכרון של כל נקודות הזמן ו כדי לזרז את החלקיקים: האינטראקציה תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את מהלך הזמן החל מייד לאחר השלמת centriצעד fugation. אם ביצוע ניסוי כמובן זמן, לעצור כל נקודת זמן באופן עצמאי במרווחי זמן שונים כמפורט להלן. </li></ol></li></ol></li></ol> הערה: שיטת phagocytosis המסונכרן היא קצת יותר מייגע מקודמתה, אבל מספקת מדד phagocytic גבוה יותר בזמן קצר יותר. 4. phagocytosis הפסקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים חסיד, להסיר את supernatant ולהוסיף 50 μl של כחול trypan מדולל עם PBS (דילול 1: 2), על מנת לכבות הקרינה של חיידקים-הפנים שאינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים שאינם חסיד, ספין למטה הצלחת ולהסיר supernatant. הוסף 50 μl של trypan הכחול בדילול מלא. ודא צנטריפוגות הצלחת ב( 5-10 דקות ב 500 XG) בין כל שטיפה על מנת למזער את אובדן התא ומאפשר שטיפה נאותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה trypan, לשטוף תאים פעמיים עם PBS כדי להסיר כל trypan שייר (עד PBS הוסר מהבאר הופכת ברורה). Trypan הוכח כדי להרוות את הקרינה 15,16 של, חלקיקי חיידקי חום נהרג הלא הפנימו שכותרתו fluorescently, אך לא לחיידקים חיים או חרוזים OPDex. לחיידקים חיים, כולל שטיפה עם אנטיביוטיקה כמו פניצילין, סטרפטומיצין, גנטמיצין או במקום לשטוף trypan כדי למנוע תופעות של בלבול של הקרינה מחלקיקים-הפנים שאינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים עם של paraformaldehyde 4% 100 μl, ודגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר, ולאחר מכן לשטוף עם PBS (בכל טוב 100 μl לכל שטיפה). בשלב זה, לשמור את התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע, או להמשיך ישירות מכתים וכימות. הערה: כל השלבים הבאים מהווים הקדמת שלב זה יכול להיעשות מחוץ למכסת מנוע תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל הנוזל ולהוסיף 50 μl של DAPI ב -5 / מיליליטר ng מחדש בPBS. לאפשר 5 דקות לצביעה, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS. בעקבות הצעד לשטוף, להוסיף 50 μl של PBS על כל phagocytosis היטב והשיא. </li&gt; </ol> 5. אקטין מכתים הערה: בנוסף לphagocytosis, שיטת fluorometric תאפשר כימות של פילמור אקטין על ידי מדידת עוצמת אקטין, אשר מצטמצם בעיכוב של lamellipodia, pseudopodiae, וקרום פורע כתוצאה מטיפול במעכבים (איור 1 א). זהו צעד אופציונאלי, אם עניין בכימות של פילמור אקטין בנוסף לphagocytosis. אם פילמור אקטין הוא המטרה הסופית, תוך שימוש בחלקיקי ניאון לphagocytosis הוא אופציונאלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות קיבעון paraformaldehyde (שלב 4.3), לשטוף את הצלחת פעמיים עם PBS לכל גם 100 μl לכל שטיפה. הוסף 50 μl של 0.1% Triton X-100 ב PBS עבור permeabilization ו דגירה -5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את פי 2 Triton X-100 0.1% עם PBS (כאמור לעיל), ולחסום עם 1% אלבומין בסרום שור (BSA) במשך 20 דקות כדי למנוע מחייב הלא ספציפית של label. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות חסימה, להסיר את פתרון BSA ולהוסיף phalloidin rhodamine מייד. כדי להכין את פתרון העבודה של כתם rhodamine, שימוש בפתרון methanoic (המסופק על ידי היצרן) 100 μl ב 5 מיליליטר של PBS (מספיק לצלחת אחת). מהפתרון עובד להוסיף 50 μl לכל גם דגירה של 20 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: בעקבות צעדי הכביסה ומכתים DAPI כמו בשלב 4.4 תאים יהיו מוכנים לכימות. </li></ol> 6. כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את phagocytosis באמצעות קורא צלחת ניאון ירוק הקרינה שיא, באמצעות מסנן עירור ב λ = 488 ננומטר ומסנן פליטה בקרינת λ = 518 ננומטר, וכחולה באמצעות מסנן עירור ב λ = 355 nm ומסנן פליטה בλ = 460 nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את פילמור אקטין באמצעות קורא צלחת ניאון, הקרינה כחולה שיא באמצעות λ = 355 וλ = 460 nm שפעת (כאמור לעיל), ואדום ננומטרorescence באמצעות מסנן עירור ב λ = 584 nm וλ = 620 nm מסנן פליטה. הערה: Orbital או איתור מרכזי מקובלת להקלטה. סוגים מסוימים של תאים לאסוף יותר לקצה גם מהמרכז, שבו הקלטת מסלול מקרה יכולה להיות יתרון. בפרט, ממוצע של שלוש נקודות מסביב למסלול יכול לשמש גם כדי להשיג תוצאות מדויקות יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את RFU הכולל של הקרינה ירוקה או אדומה על ידי קריאת הקרינה כחולה (מDAPI), בהתאם לתווית החלקיק או phagocytic לעומת כימות אקטין (תרשים 1). בשל שונות צלחת לצלחת גבוהות, להשתמש במדדים יחסי (כגון ביחס לt = 0 שליטה), כדי להמחיש הטוב ביותר מגמות שנצפו וכדי להקל על ניתוח סטטיסטי אמין יותר. </li></ol>

<ol>
	<li>Murphy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Janeway's Immunobiology. , (2012).</li><li>Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromotion+of+cemented+and+uncemented+femoral+components.">Micromotion of cemented and uncemented femoral components.</a> The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).</li><li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+malaria+by+enhanced+phagocytosis+of+erythrocytes+in+LMP7-deficient+mice.">Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice.</a> PloS One. 8 (3), 59633 (2013).</li><li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes.">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PloS One. 7 (3), 32621 (2012).</li><li>Al-Bader, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+trehalose+biosynthesis+in+Aspergillus+fumigatus+development,+stress+response,+and+virulence.">Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence.</a> Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).</li><li>Acosta-Iborra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+oxygen+sensing+modulates+antigen+presentation+and+phagocytic+functions+involving+IFN-gamma+production+through+the+HIF-1+alpha+transcription+factor.">Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor.</a> Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).</li><li>Ojielo, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+phagocytosis+and+clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+lung+following+bone+marrow+transplantation.">Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation.</a> Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).</li><li>Neu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14-dependent+monocyte+isolation+enhances+phagocytosis+of+listeria+monocytogenes+by+proinflammatory,+GM-CSF-derived+macrophages.">CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages.</a> PloS One. 8 (6), 66898 (2013).</li><li>Sokolovska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+caspase-1+by+the+NLRP3+inflammasome+regulates+the+NADPH+oxidase+NOX2+to+control+phagosome+function.">Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function.</a> Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).</li><li>Janko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRP/anti-CRP+antibodies+assembly+on+the+surfaces+of+cell+remnants+switches+their+phagocytic+clearance+toward+inflammation.">CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).</li><li>Clatworthy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+lupus+erythematosus-associated+defects+in+the+inhibitory+receptor+FcgammaRIIb+reduce+susceptibility+to+malaria.">Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).</li><li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphine+decreases+bacterial+phagocytosis+by+inhibiting+actin+polymerization+through+cAMP-,+Rac-1-,+and+p38+MAPK-dependent+mechanisms.">Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms.</a> The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).</li><li>Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemophagocytic+macrophages+harbor+Salmonella+enterica+during+persistent+infection.">Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).</li><li>Xue, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+gene+transfer+and+expression+in+cord+blood-derived+CD34++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+by+a+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposon+system.">Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system.</a> Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).</li><li>Hed, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+distinguishing+ingested+from+adhering+particles.+Methods+in+Enzymology.">Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology.</a> 132. , 198-204 (1986).</li><li>Scott, A. J., Woods, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+internalization+of+Histoplasma+capsulatum+by+mammalian+cell+lines+using+a+fluorometric+microplate+assay.">Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay.</a> Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

מגבלות עיקריות של טכניקת fluorometric הן שונות ניסיוני כמו גם אובדן תא הקשורים לכביסה ושימוש בתאים שאינם חסיד נרחבים. שונות הוא ציינה בעיקר בשל השינוי בחלקיקי ניאון כמו המשקל וpipetting במהלך תקופת ההכנה של מניות הפתרון הוא לא דרך של שמירה...

כימות של אות ניאון כבר בשימוש נרחב במגוון רחב של שיטות מדעיות החל PCR, cytometry זרימה, מיקרוסקופיה confocal, וסריג ניתוח זמנית ELISA. יש הדמיה הקרינה וכימות יישום רחב והוא יכול להיות כלי נהדר לניתוח כמותי של תהליכים תאיים שונים. שימוש בסמני ניאון והאות שלהם כבר מהפכה בעשור האחרון, והופעתה של קוראי צלחת ניאון יש להקל כימות תפוקה הגבוה של הקרינה הנפלטת במהלך תהליכים תאיים. ניתוח Fluorometric יכול לשמש כלי נהדר בכימות של phagocytosis. Phagocytosis נחקר מאז גילוי phagocytes ידי Metchnikoff בשנת 1800 1. במהלך השנים, במגוון שיטות כבר נוצל כדי לבחון תהליך חשוב זה חיוני להגנה חיסונית מולדת נגד פלישת חיידקים, נגיפיות, פטריות וטפילות פתוגנים 2-5. שיטות קודמות של מיקרוסקופיה כימות מנוצל וטכניקות stereological כדי להמחיש תאים הphagocytosing, שהיו לכמת אז על ידי ספירה של חלקיקים הפנימו (ידני או עם שימוש בתוכנה) 6-8. חסרונות מסוימים לבאמצעות מיקרוסקופ לבד לניתוח כמותי הם שספירה ידנית של חיידקים היא עבודה אינטנסיבית ונוטה יותר להטית משקיף. שיטה נוספת המשמשת בכימות של phagocytosis היא טכניקת המיקרוביולוגית של ציפוי של חיידקים מהתא lysates (להלן phagocytosis) על צלחות תרבית חיידקים, אך שיטה זו יכולה להיכשל לתת דין וחשבון למנגנונים ונוכחות של חיידקים הפנימו באופן חלקי bactericidal. שיטה זו היא עוד יותר עבודה אינטנסיבית בהשוואה למיקרוסקופיה ולוקחת כמה ימים כדי לנתח. נראה cytometry זרימה להיות דרך המהירה והיעילה ביותר לכימות phagocytosis ונוצל על ידי קבוצות רבות 9-11, אבל העלות הגבוהה נפוצה הקשורים במחוונים דרושים לניתוח עושה את זה בשיטה יקרה ביותר בהשוואה למבחנים שהוזכרו קודם לכן. שיטת fluorometric היא אלטרנטיבה טובה לcytometry זרימה לניתוח של הפנמת חלקיקים שכן הוא מציע כימות משוחד של ציוד הקרינה באמצעות שאינו כעלותו. יתרונות נוספים אחרים של fluorometry הם יעילות גבוהה, ויכולות תפוקה גבוהות לכימות הקרינה הנפלטת על ידי שכותרתו החלקיקים הפנימו. יתרונות של fluorometry ניתן להסיק לכימות של תהליכים אחרים מאשר phagocytosis. לדוגמא, ניתוח fluorometric ניתן ליישם ללמוד כל תהליך מוביל לשינויים בביטוי של תאית או קולטני קרום הנכנס, שינויים בתא חדירות / כדאיות, יעילות transfection, ואפנון בפילמור אקטין. חיסרון אחד של טכניקת fluorometric הוא ש, בהתאם לתוויות שימוש, ייתכנו גבוהניסוי לניסוי שונות אשר בדרך כלל ניתן לפתור על ידי הוכחת נתונים באמצעות כימות יחסי, כגון שינוי קיפול או עליית אחוזים מהשליטה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="820">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:131px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">1-&#956;m yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">F8852</td>
			<td style="width:255px;">combine 50&#956;l with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;">Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2861</td>
			<td style="width:255px;">reconstitute (5 mg) in 50&#956;l of PBS and combine with 50&#956;l opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Opsonizing reagent</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">E2870</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Rhodamine phalloidin</td>
			<td style="width:131px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">R415</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15250-061</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:315px;">RPMI Cell growth media&#160;</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Fluorescent plate reader-Fluostar Omega</td>
			<td style="width:131px;">BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td style="width:131px;">Fischer Scientific</td>
			<td>AA433689M</td>
			<td style="width:255px;">dilute to 4% before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:315px;">96 well plates</td>
			<td style="width:131px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">655097</td>
			<td style="width:255px;">clear or black or clear bottom - black plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Multichannel pipette (8-12 channels)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Reagent reservoirs</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">1x PBS</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">Microfuge tubes (0.6 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:315px;">&#160;Conicles (10 ml)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization

המטרה של ניתוח fluorometric היא לשמש ככלי עזר יעילים, חסכוני, תפוקה גבוהה של ניתוח phagocytosis ותהליכים תאיים אחרים. טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגי תאים, שני חסיד ולא חסיד, לבחון מגוון רחב של תכונות הסלולר. כאשר לומדים phagocytosis, טכניקת fluorometric מנצלת סוגי תאי phagocytic כגון מקרופאגים, וחלקיקי opsonized שכותרתו fluorescently הקרינה שיכולים להיות כבוי בנוכחות trypan הכחולה. בעקבות ציפוי של מקרופאגים חסיד ב96-גם צלחות, חלקיקי ניאון (ירוק או אדום) מנוהלים ותאים מותר phagocytose לכמויות שונות של זמן. בעקבות הפנמה של חלקיקי ניאון, תאים נשטפים עם trypan כחול, המאפשר הכחדה של אות ניאון מחיידקים אשר לא הפנימו, או שהם רק הקפדה על פני התא. בעקבות לשטוף trypan, תאים נשטפים עם PBS, קבועה,nd מגואלות DAPI (תווית ניאון כחולה גרעינית), המשמש לסימון גרעינים של תאים. על ידי כימות fluorometric פשוט באמצעות קריאת צלחת גרעינית (כחולה) או חלקיקי הקרינה (אדום / ירוקה) אנחנו יכולים לבחון את היחס של יחידות יחסית הקרינה של ירוק: כחולות ולקבוע מדד phagocytic מעיד על כמות חיידקי ניאון הפנימו לכל תא. משך assay באמצעות טפטפות שיטה ורבות ערוצים 96-גם לשטיפה, מסוף phagocytosis לסיים רכישת נתונים, הוא פחות מ 45 דקות. Cytometry זרימה יכולה לשמש באופן דומה, אך היתרון של fluorometry הוא התפוקה הגבוהה שלה, שיטה מהירה של הערכה עם מניפולציה מינימאלית של דגימות וכימות מהיר של עוצמת ניאון לכל תא. ניתן ליישם אסטרטגיות דומות לתאים שאינם חסיד, שכותרתו חיידקים חי, פילמור אקטין, ובעצם כל תהליך ניצול הקרינה. לכן, fluorometry היא שיטה מבטיחה עבור העלות נמוכה, הגבוה throughpיכולות ut במחקר של תהליכים תאיים.

שתי דרכים עיקריות לכימות phagocytosis ופילמור אקטין לאחר מכן באמצעות פרוטוקול זה היא להתבונן phagocytosis רציף או מסונכרן. ניתוח מיקרוסקופי (איור 1) מדגים תמונות ניאון דומות למה שfluorometer הוא ההקלטה (ראה גם תרשים 1). באיור 1 הן ?...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization at JoVE.com

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

high-throughput-fluorometric-technique-for-assessment-macrophage

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.5K Views.  University of Minnesota. Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Video: High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

הקרנת תפוקה גבוהה לספקטרום רחב כימיים מעכבי RNA וירוסים

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia Coli כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the removal of dead cells or foreign particles, and in the resolution of inflammatory responses and tissue remodeling, processes that are mediated by various surface receptors of the AMs. Here, we report methods for the analysis of the phagocytic function of AMs using in vitro and in vivo assays and experimental strategies to differentiate between the pattern recognition receptor-, complement receptor-, and Fc gamma receptor-mediated phagocytosis. Finally, we discuss a method to establish and characterize a P. aeruginosa pneumonia model in mice to assess bacterial clearance in vivo. These assays represent the most common methods to evaluate AM functions and can also be used to study macrophage function and bacterial clearance in other organs.

Here we report common methods to analyze the phagocytic function of murine alveolar macrophages and bacterial clearance from the lung. These methods study in vitro phagocytosis of fluorescein isothiocyanate beads and in vivo phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. We also describe a method for clearing P. aeruginosa in mice.

מקרופאג מכתשי Phagocytosis ואישור חיידקים בעכברים

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

בהערכת Vivo של מכתשי מקרופאג Efferocytosis בעקבות חשיפת האוזון

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.