We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nad&#232;ge Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche M&#233;dicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les h&#233;patites virales" (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.

הערה: פלסמיד המשמש Lifeact-mCherry הוא מתנה סוג של ד&quot;ר גיום Montagnac, Institut קירי, פריז, שנוצר לאחר 17. 1. תאים Transfection הערה: מקרופאגים RAW264.7 גדלים כדי confluency משנה בינוני שלם (RPMI (מכון ממוריאל פארק Roswell) בינוני 1640, 10 HEPES מ&quot;מ, פירובט סודיום 1 מ&quot;מ, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין ו -10% FCS ( סרום עגל עוברי)) בצלחת 100 מ&quot;מימ. הם טרנספקציה עם פלסמידים קידוד החלבונים המתויגים fluorescently ידי electroporation. באופן שגרתי כ 5 - 6 x 10 6 תאים הם transfected עם 20 מיקרוגרם או 10 מיקרוגרם של פלסמיד לכל transfection או-transfection שיתוף בהתאמה. שימו לב אמצעים אחרים של transfection מבוססים על electroporation או lipofection יכולים לשמש גישות חלופיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרדו את התאים עם מרים תא resuspend אותם 10 מ&quot;ל של מדיום התרבות ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגהתא ההשעיה XG 300, 5 דקות ב RT ב הרוטור זווית מתנדנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים 10 מ&quot;ל של מדיום מלאה בתוספת 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של גנטמיצין על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל של &quot;חיץ כביסה&quot; מתוך הערכה electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא XG 300, 5 דקות בטמפרטורת החדר ב הרוטור זווית מתנדנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכינים את תערובת DNA בטמפרטורת החדר: 120 μl 2x הצפת B, 20 מיקרוגרם של קידוד פלסמיד דנ&quot;א לחלבון של עניין, qsp 240 μl H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה בתמהיל DNA ולהעביר לתוך cuvettes electroporation 4 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate ב 250 V, 900 μF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד resuspend התאים מחומם מראש (37 ° C) בינוני מלא בתוספת גנטמיצין ו צלחתמ בצלחת 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאי transfected הלילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, להחליף את מדיום להשלים עם 10 מ&quot;ל של מדיום מיקרוסקופית סרום ללא (RPMI 1640 ללא פנול אדום, 10 HEPES מ&quot;מ, 1 פירובט נתרן מ&quot;מ, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין). </li></ol> 2. Opsonization של תאי דם אדומים הערה: כמודל של יעד חלקיקים עבור מקרופאגים, תאי דם אדום כבשים (SRBCs) משמשים. בדרך כלל, בסביבות 7 x 10 6 SRBCs לכל 35 מ&quot;מ צלחת זכוכית תחתונה משמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את SRBCs עם 100 μl של PBS 1x (בופר פוספט) /0.1% BSA (אלבומין בסרום שור) צנטריפוגות (600 XG, 4 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend SRBCs ב 100 μl של 1x PBS / 0.1% BSA ו צנטריפוגות (600 XG, 4 דק &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, לבטל את supernatant ו resuspend SRBCs ב 1x PBS / 0.1% BSA עם ארנב IgG אנטי SRBCsב תת-agglutinating ריכוז. השתמש 500 μl של תמיסה המכילה נוגדן / 5 μl של SRBCs. הערה: הריכוז תת-agglutinating של נוגדנים תואם את הריכוז הנמוך ביותר שלא לגרום התלכדות זוהתה כמו היווצרות של רשת סלולרית. באופן כללי, ריכוז agglutinating-משנה הוא 8.2 מיקרוגרם / מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של IgG אנטי SRBCs נדרש opsonize SRBCs ידי מבחן hemagglutination. סדרתי לדלל את (המניה ב 13.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) אנטי-SRBCs IgG בין 1/50 - 1 / 25,600 בתוך microplate. להוסיף 2 x 10 6 SRBCs בכל טוב. דגירת הצלחת בחושך ב RT במשך כמה שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT במשך 30 דקות עם סיבוב איטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שתי שטיפות ב 1x PBS / 0.1% BSA כמתואר לעיל, resuspend SRBCs IgG-opsonized (IgG-SRBCs) במדיום מיקרוסקופיה מחומם מראש סרום ללא (2 מ&quot;ל / צלחת). </li></ol> ציפוי של Coverslips 3. פולי-ליזין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לטפל 35 מנות מ&quot;מ זכוכית התחתונה עם 2 מ&quot;ל של פולי- L- ליזין 0.01% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הכלים פעמיים עם 2 מ&quot;ל של 1x PBS. </li></ol> 4. קיבוע ללא קוולנטי של SRBCs על מנות תחתיות זכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 2 מ&quot;ל של השעיה SRBCs לכל 35 מ&quot;מ זכוכית צלחת תחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עם הרוטור מתנדנד ב XG 500 במהלך 2 דקות על 35 מנות תחתיות זכוכית מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולשטוף פעם עם 2 מ&quot;ל של BSA 1x PBS / 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חלקיקים למשך 30 דקות עם 2 מ&quot;ל של BSA 1x PBS / 10% לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הכלים שלוש פעמים עם 2 מ&quot;ל של 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף 1x PBS עם 2 מ&quot;ל של טרום התחמם (37 ° C) בינוני מיקרוסקופית סרום ללא. </li></ol> 5. Phagocytosis דמיינו ידי TIRFM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מִיקרוֹסקוֹפּ הערה: TIRFM בוצע באמצעות מיקרוסקופ מצויד טבילה אובייקטיבית-שמן (N 100X, NA1.49), תא חימום עם 2 CO, ושני שריםle פוטון איתור מצלמות EMCCD (אלקטרונים והכפילה התקן צמוד) בשילוב עם עדשה 1.5x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני הפגישה מיקרוסקופ TIRF, להדליק את תא חימום על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר חימום הומוגנית של הבמה מיקרוסקופ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת זווית ביקורתית הערה: תוכנת Profiler הצבע ImageJ משמשת תהליך זרמי תמונה TIRF. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת תחתית זכוכית 35 מ&quot;מ המכיל opsonized SRBC עם המדיום מיקרוסקופיה סרום ללא מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרדו את התאים resuspend אותם במדיום לפני הוספתם (100 - 500 μl) בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת &quot;Live רכישת&quot; לשלוט מיקרוסקופ ולבצע עירור עם 491 ננומטר ו / או לייזר 561 ננומטר לזהות תאים המבטאים החלבונים המתויגים fluorescently. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות תא המבטא את החלבונים המתויגים fluorescently. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אותו באמצע השדה ולרכוש 500 imהגילאים באורך גל עירור אחד, עם זוויות שונות החל 0º עד 5º, עם תוספת של 0.01º (איור 2 א). הזוויות משתנות באופן אוטומטי על ידי מערכת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הזווית הקריטית המאפשרת את אור האירוע להשתקף לחלוטין בממשק הזכוכית / בינוני ליצור את הגל החולף. באמצעות תוכנת ImageJ הצבע Profiler, לפתוח את רצף תמונה על ידי לחיצה על &quot;קובץ&quot;, &quot;פתח&quot; ולבחור את הקובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור של (ROI) העניין, עם הכלי המלבני, בתא עם קרינה אחידה (תרשים 2B צהוב 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרטט את &quot;פרופיל ציר Z&quot; אומר עוצמת הקרינה הנמדדת ההחזר על ההשקעה עם פונקציה של זוויות על ציר x על ידי לחיצה על הלשונית &quot;תמונה&quot;, &quot;סטאקס&quot; בתוך התפריט הנפתח &quot;מגרש Z- ציר פרופיל&quot; (תרשים 2B אדום 2). ההערה: הזווית הקריטית היא הזווית המובילה אל maקרינת ximum לפני ירידה חדה קרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכל ערך של זווית על ציר x המעולה לזווית הקריטית במהלך הפגישה במיקרוסקופ כדי לקבל אות TIRF כמו למשל 2.00 (איור 2 ג). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת רכישה חייה, להגדיר את הפרמטרים של רכישה עם מודול &quot;עורך פרוטוקול&quot; (איור 3 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור פרוטוקול עם &quot;לולאה&quot; המהווים &quot;ערוצים רבים&quot; רכישה לרכישת אות ניאון מחלבונים של עניין באזור TIRF. הזן את זווית TIRF (למשל 2.00), את זמן החשיפה (עבור msec למשל 50) ואת עוצמת הלייזר (למשל 50%) (איור 3 ב 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג &quot;מהלך Z&quot; של מיקרומטר האובייקטיבי 3 מעל אזור TIRF להשיג רכישת אות ב epifluorescence עם כלי &quot;ערוצים רבים&quot;. הזן בזווית מתחת tהוא זווית קריטית (כמו למשל 1.00), הזמן של אקספוזיציה (50 msec) ואת עוצמת הלייזר (50%) (איור 3B, 2 ו -3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא להוסיף &quot;מהלך z&quot; של מיקרומטר האובייקטיבי 3 להלן, לחזור באזור TIRF (איור 3 ב 4). הוספת &quot;תמונת מצב&quot; של התא באור בהיר LED (דיודה פולטת אור) (איור 3 ב 5). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא תא עניין עם רמה מתונה של ביטוי חלבון מתויג fluorescently היוזם phagocytosis של SRBC על ידי הרחבת קרום הפלזמה סביב החלקיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אותו באמצע השדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הזרמת רכישת 500 - 1,000 מסגרות. בלשונית &quot;ספירת לולאה&quot;, זן &quot;750 מסגרות&quot; (איור 3 ב 1). הערה: תוכנת Profiler הצבע ImageJ משמשת תהליך זרמי תמונה TIRF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות ברצף בתוכנת J תמונה על ידי לחיצה&quot;קובץ&quot;, &quot;להרחיב&quot; ובחירת הקובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הערוצים על ידי לחיצה על הלשונית &quot;התמונה&quot;, &quot;Hyperstacks&quot; לתפריט נשלף ועל &quot;חול כדי hyperstack&quot; פונקציה. השלם את החלון הופיע: סדר: xyctz; ערוץ (ג): מספר הערוצים (לשעבר: &quot;2&quot; אם יש לך שני fluorochromes); פרוסות (z): מספר הפרוסות ציר z (לשעבר: &quot;1&quot; אם אין תנועה בציר z-); מסגרות (t): מספר התמונות המחולקות לכל מספר הערוצים; מצב תצוגה: גוונים אפורים. הערה: שני רצפי תמונות נפרדים נוצרים, מתאים לשני הערוצים השונים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+phagocytosis.">The cell biology of phagocytosis.</a> Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).</li><li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes.">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+comparative+innate+immunity:+learning+on+the+fly.">Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly.</a> Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).</li><li>Niedergang, F., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Cell Biology. 2, 751-757 (2016).</li><li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).</li><li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages.">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).</li><li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Information+processing+during+phagocytosis.">Information processing during phagocytosis.</a> Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+microbes:+complexity+in+action.">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).</li><li>Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scavenger+receptors+in+homeostasis+and+immunity.">Scavenger receptors in homeostasis and immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).</li><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+receptors,+signal+integration,+and+the+cytoskeleton.">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).</li><li>Scott, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate+hydrolysis+directs+actin+remodeling+during+phagocytosis.">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis.</a> J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).</li><li>Schlam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+3-kinase+enables+phagocytosis+of+large+particles+by+terminating+actin+assembly+through+Rac/Cdc42+GTPase-activating+proteins.">Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Nat Commun. 6, 8623 (2015).</li><li>Marion, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NF-kappaB+Signaling+Protein+Bcl10+Regulates+Actin+Dynamics+by+Controlling+AP1+and+OCRL-Bearing+Vesicles.">The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles.</a> Dev Cell. 23, 954-967 (2012).</li><li>Loovers, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phagocytosis+in+Dictyostelium+by+the+inositol+5-phosphatase+OCRL+homolog+Dd5P4.">Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4.</a> Traffic. 8, 618-628 (2007).</li><li>Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+and+cytokinesis:+do+cells+use+common+tools+to+cut+and+to+eat?+Highlights+on+common+themes+and+differences.">Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences.</a> Traffic. 14, 355-364 (2013).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+12,+Unit+12.29:+Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Curr Protoc Cytom. , (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-actin+cross-talk+contributes+to+phagosome+formation+and+closure.">Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure.</a> Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 &#176;C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice...

Phagocytosis היא פונקצית תאים עיקרית שמתחילה עם ההכרה ומחייבת של חומר על פני שטח קולטנים, אשר לאחר מכן מוביל ההפנמה השפל של חומר הבליעה. בעוד אאוקריוטים חד תאיים כגון discoideum Dictyostelium עובש אמבות להשתמש phagocytosis האכלה על חיידקים, יצורים עילאיים התפתחו עם תאים מקצועיים. המקרופאגים או תאים דנדריטים הם קו ההגנה הראשון נגד פתוגנים שונים רקמות ואיברים, והם חיוניים להפעיל את המערכת החיסונית אדפטיבית דרך הייצור מצגת אנטיגן ציטוקינים 1-4. בנסיבות מסוימות phagocytosis יכולה להתבצע על ידי תאי phagocytic הלא מקצועיים, למשל, אנדותל ותאי אפיתל. תהליך זה חשוב לשמור על הומאוסטזיס במהלך פיתוח בבגרות עבור מחזור שיפוץ רקמות בריאות. לבסוף, פגוציטים מיוחדים כגון תאי Sertoli ב testis או ברשתיתתאי אפיתל הפיגמנט הם פגוציטים חזקים מאוד 5. היווצרות של phagosome שבו השפלה של מיקרואורגניזמים או פסולת הסלולר מתרחשת מתחיל עם אשכולות של קולטנים phagocytic על פני השטח של התא phagocytic. אירועים Downstream איתות הבאים אשכולות של קולטנים opsonic כגון קולטנים Fc (FCR) או קולטני משלימים (CRS) כבר מאופיין היטב. עם זאת, ישנם גם רבים קולטנים שאינם opsonic כולל קולטנים דמוי אגרה (TLRs), לקטינים, קולטנים מנוז ואת הקולטנים נבלות. קולטנים אלה מכירים הקובעים על פני החלקיקים כגון שאריות מנוז או פוקוז, phosphatidylserine, ו lipopolysaccharides 1,6-9. פתוגן או תא פסול הכרה כרוכה קשירה באשכולות של כמה סוגים של קולטן phagocytic, אשר לאחר מכן להוביל שיפוץ יקטין אינטנסיבי וחולף. בשנת exocytosis במקביל, המוקד של תאיים תאייםts תורמת לשחרור מתח הממברנה חשוב phagocytosis יעיל של חלקיקים גדולים. אירועי האיתות המובילים דפורמציה פילמור הקרום תקטין נותחו במודלים ניסיוניים שהפעילו קולטן phagocytic יחיד. במהלך phagocytosis FCR בתיווך, יש פילמור אקטין אינטנסיבי כי מוסדרת GTPases קטן (RAC, Cdc42). בין effectors הזרם שלהם, חלבון התסמונת ויסקוט-אולדריץ &#39;(WASP) מוביל ההפעלה של החלבון-קשור יקטין 2/3 מורכבים (Arp2 / 3) כי nucleates סיבי יקטין 1,2,4,10. הייצור המקומי של phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PI (4,5) P 2) הוא חיוני עבור פילמור אקטין הראשוני שמניע היווצרות מדומות. המרה PI (3,4,5) P 3 נדרשה להארכת מדומות ו phagosome סגר 11. מסלולים כמה לתרום היעלמות PI (4,5) P 2. ניתוק הראשי של קינת פוספט phosphatidylinositolSES (PIPKIs) מן PI מעצרים phagosome (4,5) P 2 סינתזה. שנית, זה יכול להיות פוספורילציה ויאכל על פי מעמד ואני PI3K קינאזות (PI3K) והמיר ב PI (3,4,5) P 3 12. תפקיד phosphatases ו phospholipases גם כבר גלום במסחר PI (4,5) הידרוליזה P 2 והסרת F- יקטין במהלך phagocytosis בתאי יונקים וב Dictyostelium 13,14. ה- C פוספוליפאז (PLC) δ hydrolyzes PI (4,5) P 2 לתוך diacylglycerol ופוספט טריס 1,4,5--אינוזיטול. לצרכן (4,5) P 2 ו PI (3,4,5) OCRL phosphatase P 3 (תסמונת oculocerebrorenal של Lowe) גם היה מעורב היווצרות phagosome. היווצרות מקומית מדויקת של F-תקטין depolymerization החברה מוסדרת היטב במרחב ובזמן ואנחנו הראינו גיוס של תאים תאיים חשוב לספק מקומי phosphatase OCRL, ובכך לתרום depolymerization יקטין המקומי בבסיס כוס phagocytic <sup&gt; 13,15. לשם כך, השתמשנו הגדרת הניסוי המתוארת כאן. שחקני המנגנון ומולקולריים הנדרשים לסגירת phagosome ו scission הקרום להישאר מוגדרים היטב בגלל קשיי הדמית ניטור באתר של סגירת phagosome. עד לאחרונה, phagocytosis נצפתה על תאים קבוע או לחיות להפנים חלקיקים על פני הגב שלהם או על צדם, מה שהופך את ויזואליזציה בזמן של האתר של סגירת phagosome קשה. בנוסף, שיטות קיבוע יכולות לגרום הכחשה של ממברנות להטות את התוצאות על רחבת pseudopodia וסגירה. לעומת זאת, assay כי הקמנו ולתאר כאן מאפשר לנו לדמיין רחבה מדומות וצעד סגירת phagocytosis בתאים חיים 13, המבוסס על מיקרוסקופיה החזרה הגמורה (TIRFM) 16. טכניקה אופטית זו משתמשת גל חולף לרגש fluorophores באזור דק על הממשק בין שקוף כךהמכסה (coverslip) ו- (תרבית תאים בינוניים) נוזלי. העובי של עומק העירור הוא סביב 100 ננומטר מן המשטח המוצק, המאפשר הדמיה של אירועים מולקולריים קרובים קרום הפלזמה. TIRFM מאפשר יחס אות רקע גבוה, ומגביל את הקרינה מחוץ פוקוס שנאספו ואת cytotoxicity בשל התאורה של תאים. ניצול של TIRFM, פיתחנו את &quot;assay סגירת phagosome&quot; שבה coverslips מופעלים עם ליזין פולי ומצופה אז עם כדוריות דם אדומות-opsonized IgG (IgG-SRBCs). המקרופאגים להביע חלבונים מתויגים fluorescently הזמני של עניין מותרים אז לבלוע את IgG-SRBCs. בעוד תאים לנתק את חלקיקי היעד המאוגדים הלא קוולנטית אל משטח זכוכית, קצות pseudopods ניתן להבחין והקליט במצב TIRF. רכישות TIRF משולבים עם רכישות במצב epifluorescence, לאחר העברת מיקרומטר בשלב 3 לעיל, המאפשר מולualization של בסיס ספל phagocytic. תוספת של תרופות תרופתיות כגון אלה עיכוב תקטין או dynamin במהלך התהליך אפשרית גם לנתח עוד את התהליך ברמה המולקולרית. הפרוטוקול המתואר בפירוט כאן הוא עבור קו תא מקרופאג murine RAW264.7 וחלקיקי opsonized, אבל כמעט, זה יכול להיות מותאם לכל תא phagocytic אחר ועם מטרות אחרות כגון חרוזים. שיטה זו תאפשר אפיון טוב יותר של הרגולציה בזמן ובמרחב של השחקנים המולקולריים המעורבים רחבים מדומות וסגירת phagosome במהלך תהליכי phagocytic שונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-sheep red blood cells IgG</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>55806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, &#8805;98%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes 4mm</td>
			<td>Cell project</td>
			<td>EP104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrobuffer kit</td>
			<td>Cell project</td>
			<td>EB110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm TC-Treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene X-cell pulser</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C Case</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMIC&#160;</td>
			<td>TILL Photonics</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Oil-immersion objective&#160;(N 100x, NA1.49.),&#160; heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Solution 0.1%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920-100ml</td>
			<td>Dilution at 0.01% in water&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium GLUTAMAX&#160; Supplement</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no phenol red (10x500 ml)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11835-105</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep red blood cells (SRBCs)</td>
			<td>Eurobio</td>
			<td>DSGMTN00-0Q</td>
			<td>Conserved in Alsever buffer at 4&#176;C before use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

"phagosome closure assay" to visualize phagosome formation in three dimensions using total internal reflection fluorescent microscopy (tirfm)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

מערכת הניסוי המתוארת בכתב היד הזה מיוצג סכמטי באיור 1. מקרופאגים טרנספקציה RAW264.7 להביע את החלבונים של עניין התמזג תג פלורסנט ממוקמים במגע עם תאי דם אדום כבשים-opsonized IgG (SRBCs) שהיו בלתי קוולנטית קבוע על coverslip. המקרופאגים יכול לנתק את SRBC מן coverslip ל?...

Watch this Scientific Journal Video about "Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM at JoVE.com

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Assay סגירת Phagosome&quot; לדמיין גיבוש Phagosome בשלושה ממדים באמצעות סך פנימית השתקפות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

phagosome-closure-assay-to-visualize-phagosome-formation-three

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

6.4K Views.  Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité. We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

Video: "Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

הפקת חלבון סה&quot;כ ו2-D שיטות ג&#39;ל אלקטרופורזה עבור<em&gt; Burkholderia</em&gt; מינים

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לחזות ולכמת<em&gt; כלמידיה</em&gt; חלולית דינמיקת צמיחה בתאים חיים

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

חקר Phagolysosome Biogenesis בהמקרופאגים בשידור חי

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

שימוש בחלבוני ניאון כדי לפקח Dynamics Glycosome בTrypanosome האפריקאי

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

הדמיה נויטרופילים Phagosome ו הציטופלסמה באמצעות אינדיקטור pH ratiometric

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...