המטרה הכוללת של מאמר זה, היא להכין מקרופאגים ותאי דם אדומים אופוסוניזציה להדמיה של Phagocytosis על ידי מיקרוסקופיה זמן תלת מימדי לשגות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון כיצד phagocytes ללכוד ולבלוע חלקיקים. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של ספיגת חלקיקים בזמן אמת, שלא כמו במבחן נקודת קצה מסורתי יותר המאפשר רק את ההערכה אם או לא איך, חלקיק כבר לבלוע.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק עד שהם מתרגלים להליכי בידוד התא. היה לנו לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר הבנו את היתרונות של ספינינג מיקרוסקופ קונפוקל זה עבור 3D זמן לשגות הדמיה של Phagocytosis. כדי לבודד מקרופאגים הצפיים, מניחים קטטר פלסטיק 24 מד לתוך הצפאי של עכבר בן שלושה עד ארבעה חודשים, ולהשתמש מזרק פלסטיק חמישה מיליליטר כדי לשטוף את החלל פעמיים עם 4.5 מיליליטר של HBSS קר כקרח ללא סידן ומגנזיום לכל lavage.
העברת ההשעיה שאפתן לתוך צינור 14 מיליליטר פוליפרופילן עגול התחתון כפי שהוא נאסף. כאשר שתי הדגימות נקצרו, צנטריפוגה שאפה, ו resuspend התאים הצפק במיליליטר אחד של RPMI חינם ביקרבונט מלא 1640 בינוני כדי להשיג בערך שש פעמים 10 לתאים השישי לריכוז מיליליטר. לאחר מכן, כדי למלא מראש שקופיות להוסיף מיליליטר אחד של HEPES מלא בתוספת בינונית למאגר אחד של שקופית ערוץ מצופה fibronectin, ולהטות את השקופית כדי לאפשר את המדיום להיות שאפתן ממאגר במורד הזרם.
כדי להסיר בועות אוויר לא רצויות, יש להוסיף 1-2 מיליליטר של מדיום טרי לאחד משני המאגרים, ולהחיל בחוזקה מכסה מאגר. לאחר מכן להחיל לחץ אגודל קצבי על הכובע כדי לשאוב כל אוויר מתוך השקופית, הטיית השקופית לפי הצורך. כאשר כל האוויר גורש, להטות את השקופית לכיוון המדיום הלא מנוצל המכיל מאגר, ולהסיר את הכובע, כדי למנוע אוויר נשאב בחזרה לתוך התעלה.
עכשיו פיפטה פתרון התא כמה פעמים כדי להפחית את הגושים, ולהוסיף 100 microliters של התאים לערוץ אחד של השקופית עבור דגירה של שעתיים בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס בהעדר פחמן דו חמצני. בסוף הדגירה להחליף את HEPES המכיל בינוני בכל שקופית עם מדיום שלם בתוספת ביקרבונט כפי שהודגם רק. ואז למקם את התאים באינקובטור לח 37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו חמצני לתרבות הלילה שלהם.
למחרת בבוקר להעביר מיליליטר אחד של דם תורם בריא שהושג טרי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן עגול שני מיליליטר עגול. ואז צנטריפוגה הדגימה. הסר את הפלזמה ואת מעיל באפי המכיל על טבעי.
ולהעביר בזהירות 100 microliters של תאי הדם האדומים מוצצים לתוך צינור mircocentrifuge שני מיליליטר המכיל 100 microliters של מדיום HEPES מלא בתוספת. סמן את הצינור 1:1 ולהעביר ארבעה microliters של תאי הדם האדומים מדולל לתוך צינור microcentrifuge שני מיליליטר חדש המכיל שני מיליליטר של HEPES מלא בתוספת בינוני. ואז לתייג את הצינור הזה 4:2000 ולמקום שני צינורות מדגם תא דם אדום מדולל על קרח.
כדי לתייג את המקרופגים הפניוניים, החלף את מדיום ביקרבונט בכל שקופית ערוץ עם מדיומים שלמים בתוספת HEPES. לאחר מכן להטות את השקופית כדי לאפשר 100 microliters של מקרופאג עכבר מתויג פלואורסצנטי נוגדן ספציפי של עניין להתווסף טיפה חכם לפתיחת ערוץ 100 microliter של השקופית. שאפו את המדיום הזורם לתוך המאגר במורד הזרם, והדגירה את התאים במשך 20 דקות בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס בהעדר פחמן דו חמצני.
בעוד התאים צפק מסומנים בעדינות לערבב 4:2000 תאי דם אדומים מדגמים ולהעביר 400 microliters של התאים לתוך צינור microcentrifuge שני מיליליטר חדש, בבלוק אלומיניום מחומם בתוך מכסה המנוע לזרימת למינאר במשך כחמש עד שמונה דקות. כאשר התאים התחממו ל 37 מעלות צלזיוס לערבב 0.4 microliters של כתם קרום פלזמה פלואורסצנטי אדום מתאים עם התאים. ואז למקם את התאים בחזרה בבלוק החום.
לאחר חמש דקות לשטוף את התאים על ידי הוספת 1.6 מיליליטר של HEPES טרי בתוספת בינוני מלא צנטריפוגה. סובב את הצינור כדי לזהות את גלולת תאי הדם האדומים. באמצעות קצה פיפט אחד עד 1.5 מיליליטר בזהירות להסיר את supernatant בשני כרכים מבלי להפריע גלולה לערבב 2000 microliters של HEPES טרי בתוספת מדיום שלם עם התאים.
צנטריפוגה ולהשעות מחדש את גלולה ב 400 microliters של בינוני. ואז לתייג את הצינור PMS עבור כתם קרום פלזמה. בסוף 20 דקות דגירה תיוג תא הצפי לשטוף את השקופית עם מיליליטר אחד של HEPES שלם טרי בתוספת בינוני.
כדי opsonize תאי הדם האדומים להוסיף microliter אחד של העכבר IGG2B נוגדן אנטי אנושי CD235A לצינור מדגם PMS. לאחר שמונה דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב פעם בדקה העברה 100 microliters של קרום פלזמה מוכתם IGG תאי דם אדומים אופוסונים אנושיים מקרופאגים צפי המכיל שקופית ערוץ. ברגע שתאי הדם האדומים האנושיים נוספו, עלו על השקופית במיקרוסקופ קונפוקל של דיסק מסתובב.
עם אינקובטור הבמה מוגדר 37 מעלות צלזיוס ומיד להתחיל לדמיין את התאים. זמן לשגות 3D-הדמיה של מקרופאגים פלואורסצנטיים ירוקים הציג עם תאי דם אדומים פלואורסצנטיים אנושיים מאפשר הדמיה של אירועים phagocytic חלקיקים בודדים. לדוגמה, ניתן לראות את לכידתו של עכבר IGG אופוסוניזציה תא דם אדום אנושי על ידי filopodium מקרופאג'.
כמו גם, סחיטה של תא דם אדום אנושי במהלך היווצרות phagocytic. לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך להבין היטב כיצד לבודד מקרופאגים צפיוניים תושב העכבר, תאים המסומן באופן פלואורסצנטי, וחלקיקים opsonized.
