The authors thank Dr. Lynda Partridge for the provision of advice and laboratory facilities.

1) הכנה של קו נייד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיתוח קו תא RBL-2H3.1 להביע α FcεRI סוסים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות שימוש בטכניקות תרבית רקמה בסיסיות לשורות תאי monolayer, transfect תאי RBL-2H3.1 הורים באמצעות פלסמיד pEE6, נושא את גן סוס FcεRIα (GenBank: Y18204.1) 28. הוסף 2 מיקרוגרם μl -1 של פלסמיד דנ&quot;א 0.8 מיליליטר של תאים בצפיפות של 1.2 x10 7 מיליליטר תאים -1. Electroporate התאים ב 250 V 960 μF באמצעות electrocuvette 0.4 סנטימטר ואז דגירה מייד על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התאים שהשתנו באמצעות מדיה המכילה 0.4 גרם של סולפט G418 geneticin, אז למיין תאי חיים שנותרו באמצעות FACS על ידי תיוגם עם נוגדני IgE ניאון. השתמש בRBL-2H3.1 וכתוצאה מכך להביע את שורת תאי FcεRIα סוסים לחקירה 2, 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגישות נוגדן פרה-assay: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; קציר RBL-2H3.1 לבטא בתאי FcεRIα סוסים מצלחת פטרי ומחוברות. לשטוף לאחר מכן מחדש להשעות את התאים בתקשורת ובתרבות לצפיפות תאים של -1 מיליליטר 5x10 5 תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את IgE המעניינים את התאים מושעים לריכוז סופי של 1 מיליליטר -1 ng, אז צלחת של תאים 100 μl לצלחת גם 96 בטורים 1-6 ו לדגור על 37 ° C + 5% CO 2 + 90% לחות היחסית במשך 16 שעות. לאחר זמן הדגירה, ולפני ביצוע assay השחרור, לבדוק את הבארות תחת מיקרוסקופ לconfluency היטב ודבקות תא. </li></ol></li></ol> 2) השחרור Assay: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטיפת התאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ שחרור חם (25 צינורות מ&quot;מ, 120 נתרן כלורי מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ כלוריד האשלגן, 0.04 מגנזיום כלוריד מ&quot;מ, וסידן כלורי 1 מ&quot;מ) בשעה 37 ° C כדי לאפשר לשטיפת תאים עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים על ידי מצליף את הצלחת להסיר תקשורת סלולארי והוספת 100 μl חם, 37 מעלות צלזיוס, חיץ שחרור. חזור פעמיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתגר אנטיגן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול סדרתי של אנטיגן (ניפ-HSA או DNP-HSA) של 0 מיליליטר ng -1, 0.1 מיליליטר ng ml -1, 1 ננוגרם -1, 10 מיליליטר ng -1, 100 מיליליטר ng -1, 1,000 מיליליטר ng -1, 10,000 מיליליטר ng -1 במאגר שחרור וחם על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף התא השני, לבטל את התקשורת והוחלף בפתרוני אנטיגן 100 μl. ודא שיש לי בארות באותה השורה (A1-6 לדוגמא) את אותו ריכוז אנטיגן הוסיף להם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את בקרה שלילית בשורה על ידי הוספת 0 אנטיגן -1 מיליליטר ng. להוסיף ריכוז אנטיגן הגדלת את השורות (BG) ואחריו חיץ Triton-X (5% Triton X-100) בתאי H שורה לlyse התאים לשמש כביקורת חיובית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, כדי לאפשר לתאים לשחרר מתווכים שלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת בקרות ופרט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, להעביר 50 μl של supernatant תא למחצית השנייה של הצלחת (בארות A1-6 לבארות A7-12, וכו &#39;). מחק את 50 μl הנותר של supernatant ולהחליף עם 50 μl של חיץ Triton-X כדי לאפשר המדידה של כמות מתווכים שפורסמו בכל טוב בטורים 7-12 כאחוז מהמתווכים הכולל בתוך התאים בעמודה 1-6 . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובסטרט: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של מצע β-hexosaminidase (50 4 nitrophenyl-N-אצטיל-β-D-glucosaminide הערוך DMSO המדולל עד 2 מ&quot;מ-ידי הוספתו למאגר ציטראט 0.2 M חומצת לימון ו -0.2 M נתרן אצטט, pH מ&quot;מ 4.5) לכל הבארות לאפשרה ההמרה של המצע עד 4 nitrophenol-ידי אנזים β-hexosaminidase. דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li></ol><img alt="איור 2.4.1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig241.jpg" width = &quot;400&quot; /&gt; <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפסקת התגובה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התגובה על ידי חיץ הוספת 150 μl טריס (1 M טריס- HCl, pH 9) לכל אחד גם pH הגבוה של החיץ מפסיק את התגובה והופך את 4 nitrophenol-לצבע צהוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריאה וניתוח התוצאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצלחת באמצעות ספקטרופוטומטר צלחת ב 405 ננומטר כדי למדוד את הספיגה של הצבע הצהוב. מחושב אחוז β-hexosaminidase שוחרר תוך שימוש בנוסחא הבאה: </li></ol></li></ol><img alt="איור 2.6.1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52222/52222fig261.jpg" width="100" /><ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליישם את הנוסחה הזאת היטב כל אחד, לאחר שממוצע נלקח לכל שורה. A1 ו- A7 מייצגים את המיקום של הבארות בצלחת גם 96. לשרטט גרף של אחוז שחרור β-hexosaminidase (מתאים לסך שחרור מתווך) אגאיאנטיגן NST ריכוז 2, 3. </li></ol>

<ol><li>Taudou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Alpha+Chain+of+Human+Fc%CE%B5RI+in+Transfected+Rat+Basophilic+Leukemia+Cells%3A+Functional+Activation+after+Sensitization+with+Human+Mite-Specific+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE.</a> Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).</li>
<li>Sabban, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+of+an+in+Vitro+Model+System+for+Studying+the+Interaction+of+EquuscaballusIgE+with+Its+High-Affinity+Fc%CE%B5RI+Receptor%22">Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor</a>. , The University of Sheffield. Sheffield. (2011).</li>
<li>Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+Vitro+Model+System+for+Studying+the+Interaction+of+EquuscaballusIgE+with+Its+High-Affinity+Receptor+Fc%CE%B5RI%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 153 (1-2), 6-10 (2013).</li>
<li>Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IgE+mediates+stimulus+secretion+coupling+in+rat+basophilic+leukemia+cells+transfected+with+the+a+chain+of+the+human+high-affinity+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor.</a> Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).</li>
<li>Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+canine-human+Fc+IgE+chimeric+antibodies+for+the+determination+of+the+canine+IgE+domain+of+interaction+with+Fc%CE%B5RI%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22MolImmunol%22%5BJournal%5D)">Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα.</a> MolImmunol. 45 (8), 2262-2268 (2008).</li>
<li>Rashid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Diagnostic+and+therapeutic+applications+of+rat+basophilic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MolImmunol%22%5BJournal%5D)">Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells.</a> MolImmunol. 52 (3-4), 224-228 (2012).</li>
<li>Cohen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+in+antiquity%3A+the+Ebers+Papyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy+Proc%22%5BJournal%5D)">Asthma in antiquity: the Ebers Papyrus.</a> Allergy Proc. 13 (3), 147-154 (1992).</li>
<li>Dudler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+link+between+catalytic+activity%2C+IgE-independent+mast+cell+activation%2C+and+allergenicity+of+bee+venom+phospholipase+A2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2.</a> J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).</li>
<li>Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+allergens+stimulate+the+release+of+mediators+of+the+allergic+response+from+cells+of+mast+cell+lineage+in+the+absence+of+sensitization+with+antigen-specific+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE.</a> Eur J Immunol. 26 (12), 2972-2980 (1996).</li>
<li>Smyth, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+molecular+basis+of+pro-allergenic+effects+of+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke.</a> Environ Sci Technol. 34 (7), 1370-1374 (2000).</li>
<li>Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27hygiene+hypothesis%27+for+autoimmune+and+allergic+diseases%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22ClinExpImmunol%22%5BJournal%5D)">The 'hygiene hypothesis' for autoimmune and allergic diseases: an update.</a> ClinExpImmunol. 160 (1), 1-9 (2010).</li>
<li>Eder, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+environmental+and+genetic+factors+on+allergen-specific+immunoglobulin-E+levels+in+sera+from+Lipizzan+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses.</a> Equine Vet J. 33 (7), 714-720 (2001).</li>
<li>Cook, W. R., Rossdale, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syndrome+of+%27Broken+Wind%27+in+the+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The syndrome of 'Broken Wind' in the horse.</a> Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).</li>
<li>Eyre, P., Lewis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+systemic+anaphylaxis+in+the+horse%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Acute systemic anaphylaxis in the horse.</a> Br. J. Pharmacol. 48 (3), 426-437 (1973).</li>
<li>Bruggink, M. Global betting stable, but some countries suffer recession. , International Federation of Horseracing Authorities. Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.horseracingintfed.com/Default.asp?section=Resources&area=0&story=664">http://www.horseracingintfed.com/Default.asp?section=Resources&area=0&story=664</a> (2009).</li>
<li>Wagner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE+in+horses%3A+occurrence+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">IgE in horses: occurrence in health and disease.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 132 (1), 21-23 (2009).</li>
<li>Hellberg, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+insect+bite+hypersensitivity%3A+immunoblot+analysis+of+IgE+and+IgG+subclass+responses+to+Culicoidesnubeculosus+salivary+gland+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 113 (1-2), 99-112 (2006).</li>
<li>Schaffartzik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+insect+bite+hypersensitivity%3A+what+do+we+know%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Equine insect bite hypersensitivity: what do we know.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 147 (3-4), 113-126 (2012).</li>
<li>Künzle, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE-bearing+cells+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+and+allergen-specific+IgE+levels+in+sera+from+RAO-affected+horses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+A+PhysiolPatholClin+Med%22%5BJournal%5D)">IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses.</a> J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54 (1), 40-47 (2007).</li>
<li>Tahon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+allergy+tests+compared+to+intradermal+testing+in+horses+with+recurrent+airway+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction.</a> Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).</li>
<li>Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+anti-equine+IgE+antibodies+with+specificity+for+different+epitopes+on+the+immunoglobulin+heavy+chain+of+native+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 92 (1-2), 45-60 (2003).</li>
<li>Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+monoclonal+antibodies+specific+for+native+equine+IgE+and+their+application+to+monitor+total+serum+IgE+responses+in+Icelandic+and+non-Icelandic+horses+with+insect+bite+dermal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 112 (3-4), 156-170 (2006).</li>
<li>McAleese, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+the+extra-cellular+part+of+the+alpha+chain+of+the+equine+high-affinity+IgE+receptor+and+its+use+in+the+detection+of+IgE%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+ImmunolImmunopathol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE.</a> Vet ImmunolImmunopathol. 110 (1-2), 187-191 (2006).</li>
<li>Ledin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+therapeutic+antibody+responses+against+IgE+in+dogs%2C+an+animal+species+with+exceptionally+high+plasma+IgE+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels.</a> Vaccine. 24 (1), 66-74 (2006).</li>
<li>Siraganian, R. P., Hook, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+release+and+assay+methods+for+the+study+of+human+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Manual+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Histamine release and assay methods for the study of human allergy.</a> Manual of Clinical Immunology. , American Society for Microbiology. Washington, D. C. (1980).</li>
<li>Neuberger, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hapten-specific+chimaericIgE+antibody+with+human+physiological+effector+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function.</a> Nature. 314 (6008), 268-270 (1985).</li>
<li>Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Protein+Phosphorylation+and+Ca2%2B+Mobilization+in+a+low+secreting+variant+of+the+rat+basophilic+leukemia+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line.</a> The Journal of Biological Chemistry. 269 (30), 19300-19306 (1994).</li>
<li>McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+sequencing+of+the+horse+and+sheep+high-affinity+IgE+receptor+alpha+chain+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA.</a> Immunogenetics. 1 (51), 878-881 (2000).</li>
<li>Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. , The University of Sheffield. (2010).</li>
<li>Sabban, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+pan-anti-allergy+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22JIBTVA%22%5BJournal%5D)">Towards a pan-anti-allergy vaccine.</a> JIBTVA. 2 (2), 15-27 (2013).</li>
<li>Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+bioassay+to+detect+reaginic+antibodies+from+the+serum+of+horses+affected+with+recurrent+airway+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction.</a> Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).</li>
</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests in this paper.

לסיכום תוצאות מחקר זה הראו שכאשר תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα סוסים הם רגישים עם IgE סוסים ולערער על ידי אנטיגן, הם נותנים שחרור מתווך שיא של 36.68% ± 4.88% מהסכום הכולל של מתווך בתוך תאים, בהשוואה לRBL-2H3.1 תאי הורים לא מביעים FcεRIα סוסים. כך assay זה מס...

אלרגיה ידועה כבר אלף שנים. טיפול באסתמה תואר בטקסט הרפואי המצרי העתיק המכונה פפירוס אברס (~ לפנה&quot;ס 1550) ודן בתרופות צמחיות לטיפול בזה 7. אלרגיה היום מסווגת כתגובה רגישות יתר מהסוג I, שבו סוג T התא עוזר 2 (TH 2) הזרוע של מערכת החיסון מנווטת את הייצור של נוגדני אימונוגלובולין E (IgE) בתגובה לאנטיגנים סביבתיים הנקראים אלרגנים. אלה הם חומרים מגוונים שאינטראקציה בדרך כלל עם תאים במערכת החיסונית ולהמריץ את הסינתזה והפרשה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל interleukin-4 וinterleukin-13 8, 9 כאל חלקיקים בחלקיקי עשן סיגריות או דיזל אשר משפרות סינתזת IgE 10. העלייה בגילויים אלרגיים במדינות מתועשות ב -50 השנים האחרונות, שיוחסה לשילוב של ההשפעהמזהמים סביבתיים ומגמה לסביבה יותר מחוטא, המשלבים להעביר את התגובה החיסונית כלפי פרופיל שלט על ידי TH 2 ציטוקינים, כפי שהוצע על ידי &quot;היגיינה השערה &#39;11. כפי שצוין לעיל, בני האדם אינם יונקים רק נגוע באלרגיה. יש לציין סוסים וכלבים גם יכולים לפתח תגובות אלרגיות קלאסיות ומחקר על ידי 12 הראה כי, כמו אצל בני אדם, אלרגיה לסוסים מיוחסת לגורמים גנטיים וסביבתיים. כתוצאה מכך, בעלי החיים הללו מהווים מודל טוב ללימוד יחסי הגומלין בין גורמים הגנטיים וסביבתיים של אלרגיה, ההתקדמות שלה מרגישות למחלה, ואסטרטגיות התערבות אפשריות פעם אחת ביטויים קליניים שהגדרתם ב בשנת 1887, Stömmer היה האדם הראשון שתאר את הדמיון בין האדם ואסטמה סוסי 13, ההשפעה של היסטמין על מערכת לב וכלי דם הסוסים היאדומה מאוד לזו של בני אדם 14. סוסים הם גם אבן הפינה של התעשייה מרוצי הסוסים, שהוא בשווי $ 72000000000 עם מחזור הימורים של 115 מליארד דולרים בשנה 15. רוב סוסי מרוץ העכשוויים הם צאצאים של המספר הקטן של סוסים ערביים הגזעיים על ידי ליידי אן בלאנט מהשינה 1878 ואילך. סוסי מרוץ מודרניים בדרך כלל ממולדים כדי לבחור ליכולות ביצועים. הם נוטים להפרעות גנטיות, שאחד מהם היא הרגישות שלהם להר תגובות אלרגיות. יש להם גם 1000 פעמים רמות גבוהות יותר IgE בסרום יותר אפילו בני האדם 16 ביותר אלרגי קשה. תגובות אלרגיות סוסים בדרך כלל באות לידי ביטוי כרגישות יתר עקיצת חרק (IBH) 17, 18. תוצאות IBH בדלקת עור כתוצאה מעקיצות חרקים מהוות בסוג Culicoides. צורה נוספת של מחלה אלרגית סוסים היא חסימות בדרכי נשימה חוזרות ונשנות (Rao), זה באו לידי ביטוי בבריאות ובדרכי הנשימה. הוא מאופיין על ידי צפצופים ומעבדהנשימה כבדה. לשכה לביקורת מתרחשת בדרך כלל בתגובה לעצב נבגים, ורמות IgE לאלרגן ספציפי גבוהות נרשמו בסוסים שסבלו מלשכה לביקורת במחקר אחד 19 למרות שחקירה עוד לא אישרה 20 זה. מחקרים על אלרגיה לסוסים סובבים סביב הניסיון בניטור ונטרול IgE סוסים על ידי פיתוח נוגדנים נגד סוסים IgE חד שבטיים (מבז) 21, 22. יתר על כן המחקר של 23 דן בייצור של תחומים תאיים של α של גבוהה-זיקת קולט Fc הסוסים קולט שרשרת (FcεRIα) בניסיון לזהות ולכמת בסרום סוסי IgE. במחקר נלווה על ידי 24 Ledin דן בגישה חדשה שמטרתה לנטרל IgE בסרום על ידי תחול במערכת החיסון בimmunogen עצמי שאינם עצמי /. כל המחקרים הללו, עם זאת, היו חסרים assay יעיל על מנת לבחון את הבטיחות ויעילות של הפרוטוקולים שלהם. במאמר זה, אנחנו עכשיו נציג נתונים כאלה sys assayTEM החלים על המחקר של אסטרטגיות אבחון וטיפול רלוונטיות למערכת הסוסים, שבו שחרור β-hexosaminidase, כמדד לdegranulation מתווך תא, הוערך על תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα סוסים. פרוטוקול זה מבוסס על פרסומים קודמים 25, 4, 5, 2, 3 המתארים את ההנדסה של תאי RBL transfected עם הגן המקודד את תחום מחייב IgE של קולט גבוה הזיקה לIgE ממינים שונים. הפרוטוקול מסביר כיצד לבצע assay שחרור β-hexosaminidase, שתוצאותיה מוצגות כממוצע ± סטיית תקן של ניסויים בשלושה עותקים. Assay השחרור היה ראשון שפותח על ידי Siraganian והוק 25 ללמוד אלרגיה אנושית. קבוצת המעבדה בראשותו של ד&quot;ר ראובן Siraganian גם פיתחה את קו תא RBL. תאי RBL אלו פותחו להביע FcεRIα האדם והפרוטוקול פורסם על ידי 4. החלק האחרוןשל assay הגיע עם הפיתוח של פלסמיד PSV בנייר על ידי נויברגר 26 אשר תאר את הייצור של נוגדני IgE על ידי שיבוט גן השרשרת הכבד שלו במורד הזרם של גן עכברי לאזור משתנה IgE שמכוון את hapten 4-הידרוקסי-3 -nitro-phenacetyl (NP), הנוגדן כימרי וכתוצאה מכך היה פונקציונלי מלא. היכולת לפתח כל IgE מיקוד אותו hapten, גם בעת שיבוט לקולטן שלו על פני השטח של תאי RBL הביאו סטנדרטיזציה של assay שהופך אותו פרוטוקול שימושי כדי למדוד את degranulation של תאי זופילים. Assay עושה יש יתרונות וחסרונות. היתרונות של assay הוא ההסתגלות שלה לשימוש בכל מערכת יונקים, המעבדה שלנו ובכך השתמשה בו כדי לבדוק את degranulation במערכות אנושיות, כלבים וסוסים, וזה הוא בר השגה רק על ידי סינתזת IgE של האורגניזם ושיבוט לקולטן שלו על פני השטח של תאי RBL. מצד השני,החסרונות של assay הוא שתאי RBL רגישים מאוד לשינויים תרמיים, מכאניים וPH, מה שהופך אותם לתת וריאציה של רמות degranulation בתוך אותו assay. הוא כך מומלץ בחום שהמבחנים תמיד חוזרים על עצמם בtriplicates ולאחר מכן ממוצע שנלקח מהם. יתר על כן, תאי RBL נוטים להעביר לפנוטיפ שאינו משחרר אם הם נשארים בתרבית רקמה לזמנים ממושכים (&gt; 10 שבועות) 27, מה שהופך את התחזוקה שלהם מסורבלת. הם גם נוטים לזיהומים על ידי חיידקי mycoplasma, שאינם גלויים לעין מיקרוסקופ אור ולא לשנות את המורפולוגיה של התא, אך בצורה קיצונית ישנו את רמות degranulation. כך בדיקות mycoplasma רגילות יש צורך.

<table><tbody><tr><td>RBL-2H3.1 Expressing Equine Fc&amp;epsilon;RI&amp;alpha;</td><td>-</td><td>-</td><td>Produced in the lab</td></tr><tr><td>Equine IgE anti NIP-HSA</td><td>-</td><td>-</td><td>Produced in the lab</td></tr><tr><td>96 Well Plate</td><td>Sigma</td><td>CLS3595</td><td>-</td></tr><tr><td>Multi Channel Pipette</td><td>Anachem</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Galaxy R</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid</td><td>Cambridge Research Biochemicals</td><td>N-1070-1</td><td>NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab</td></tr><tr><td>Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A6661</td><td>Abbreviated DNP-HSA</td></tr><tr><td>Plate Spectrophotometer</td><td>Anthos Labtec HT2</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pipes</td><td>Sigma</td><td>P1851</td><td>-</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>-</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>-</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>-</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>-</td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>-</td></tr><tr><td>4-nitrophenyl N-acetyl-&amp;beta;-D-glucosaminide</td><td>Sigma</td><td>N9376</td><td>Stock solution called &amp;beta;-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>-</td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>Sigma</td><td>251275</td><td>-</td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma</td><td>S7670</td><td>-</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>-</td></tr></tbody></table>

development of an in vitro model system for studying the interaction of equus caballus ige with its high-affinity receptor fc&#949;ri

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and Fc&#949;RI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine Fc&#949;RI&#945; was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine &#945;-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat &#946;- and &#947;-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine Fc&#949;RI&#945; transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using &#946;-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% &#177; 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.

תאי RBL-2H3.1 הורים ואלה transfected עם גן קולט FcεRIα הסוסים היו רגישים ראשון עם העכבר IgE אנטי DNP-HSA וקראו תיגר עם אנטיגן DNP-HSA. עכבר IgE נקשר לקולטן החולדה אנדוגני בשני שורות התאים ובכך פועל כשליטה על מנת לבחון את כדאיות השחרור של שני שורות התאים לשחרר מתווכים (איור 1). זוהי ?...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcÃŽÂµRI at JoVE.com

Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor Fc&#949;RI

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine Fc&#949;RI&#945; gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

פיתוח<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת מודל לחקר האינטראקציה של<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE עם קולטן גבוה הזיקה שלה FcεRI

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (Fc&#949;RI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated ...

development-an-vitro-model-system-for-studying-interaction-equus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Views.  King Abdulaziz University. The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Video: Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Neuroscience

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and cytotoxicity, driven by Fc&#947;RIIIa (CD16) expressed on natural killer (NK) cells. These observations have led to research focusing on methods to increase Fc receptor-mediated events, which include removal of a fucose moiety found on the Fc portion of the antibody. Further studies have elucidated the mechanistic changes in signaling, cellular processes, and cytotoxic characteristics that increase ADCC activity with afucosylated antibodies. Additionally, other studies have shown the potential benefits of these antibodies in combination with small molecule inhibitors. These experiments demonstrated the molecular and cellular mechanisms underlying the benefits of using afucosylated antibodies in combination settings. Many of these observations were based on an artificial in vitro activation assay in which the Fc&#947;RIIIa on human NK cells was activated by therapeutic antibodies. This assay provided the flexibility to study downstream effector NK cell functions, such as cytokine production and degranulation. In addition, this assay has been used to interrogate signaling pathways and identify molecules that can be modulated or used as biomarkers. Finally, other therapeutic molecules (i.e., small molecule inhibitors) have been added to the system to provide insights into the combination of these therapeutics with therapeutic antibodies, which is essential in the current clinical space. This manuscript aims to provide a technical foundation for performing this artificial human NK cell activation assay. The protocol demonstrates key steps for cell activation as well as potential downstream applications that range from functional readouts to more mechanistic observations.

A protocol for studying Fc&#947;RIIIa-driven events by therapeutic antibodies in human natural killer cells is described here. This artificial stimulation platform permits the interrogation of downstream effector functions such as degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the Fc&#947;RIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

הערכה של אירועי תאי רוצח טבעי אנושי המונעים על ידי מעורבות FcγRIIIa בנוכחות נוגדנים טיפוליים

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and ...

הקמת מונולייר דו-ממדי מתרבית אנטרואידית אילית בקר תלת מימדית

Generation of a Bovine Primary Enteroid-Derived Two-Dimensional Monolayer Culture System for Applications in Translational Biomedical Research

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating drug efficacy and toxicity, and tissue bioengineering. However, applying these models for the described reasons may be limited because of the three-dimensional (3D) nature of these models. For example, using 3D enteroid culture systems to study digestive diseases is challenging due to the inaccessibility of the intestinal lumen and its secreted substances. Indeed, stimulation of 3D organoids with pathogens requires either luminal microinjection, mechanical disruption of the 3D structure, or generation of apical-out enteroids. Moreover, these organoids cannot be co-cultured with immune and stromal cells, limiting in-depth mechanistic analysis into pathophysiological dynamics. To circumvent this, we optimized a bovine primary cell two-dimensional (2D) enteroid-derived monolayer culture system, allowing co-culture with other relevant cell types. Ileal crypts isolated from healthy adult cattle were cultured to generate 3D organoids that were cryopreserved for future use. A 2D monolayer was created using revived 3D enteroids that were passaged and disrupted to yield single cells, which were seeded on basement membrane extract-coated transwell cell culture inserts, thereby exposing their apical surface. The intestinal monolayer polarity, cellular differentiation, and barrier function were characterized using immunofluorescence microscopy and measuring transepithelial electrical resistance. Stimulation of the apical surface of the monolayer revealed the expected functionality of the monolayer, as demonstrated by cytokine secretion from both apical and basal compartments. The described 2D enteroid-derived monolayer model holds great promise in investigating host-pathogen interactions and intestinal physiology, drug development, and regenerative medicine.

מחבר זרקור: מודל אנטרואידים מתקדם לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן 

Enteroids are emerging as a novel model for studying tissue physiology and pathophysiology, drug development, and regenerative medicine. Here, we describe a bovine primary cell 2D enteroid-derived culture system that permits co-culture with relevant tissue cell types. This model offers a translational advantage for gastrointestinal research modeling.

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי

Organoid cell culture systems can recapitulate the complexity observed in tissues, making them useful in studying host-pathogen interactions, evaluating ...

פיתוח

Summary

Explore More Videos

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

הערכה של אירועי תאי רוצח טבעי אנושי המונעים על ידי מעורבות FcγRIIIa בנוכחות נוגדנים טיפוליים

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי