מחקר נתמך על ידי משרד החקלאות, ARS קריס: 3625-32000-104 וחקלאות ומזון מחקר יוזמה התחרותי גרנט לא. 2011-67015-30736 מהמכון הלאומי USDA של מזון וחקלאות. אנו מודים ג&#39;סיקה פולוק, אמה Frimml-מורגן, שלי צימרמן, קריסטין בס, ברוס פש, מולי Stafne, אלן ג&#39;נסן, וטרייסי פורטר לקבלת הסיוע הטכני המעולה שלהם, כמו גם רבקה מדיסון, דאג יואינג, קייטי פייה, ג&#39;יי סטפן, דוד Lubbers , רובין Zeisness, ודוד Panthen לטיפול וטיפול המעולה של בעלי חיים.

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

ייצור IFN-γ במבחני ELISPOT תרבותיים לטווח הארוך הוא בדרך כלל עקב Trinidad &amp; בבני אדם, אבל איך תגובה זו מתפתחת בתרבות הוא הבין היטב. אם Trinidad &amp; נמצא במחזור ולהרחיב במבחנה, או אם תגובות Trinidad &amp; נובעות מבידול של מפעיל ותאי Tem לTrinidad &amp; בתרבות אינו ידוע. עם זאת, מחקרים עם דגימות מבני האדם מצאו כי יש תאי CD4 + T מvivo לשעבר ומבחני ELISPOT IFN-γ התרבותי ארוך טווח ספציפיות epitope שאינן קשורות, רומזים כי תגובות Trinidad &amp; לא לפתח מתאי מפעיל 28. ברור, את משך התגובה עשוי להשתנות, אבל אם אישור הפתוגן מושגת, סופו של דבר שניהם vivo לשעבר ותגובות Trinidad &amp; לרדת. כמו כן, תגובות של תרבויות ארוכת טווח שנמדדו בתחילת וזמן רב לאחר תחול אנטיגני (כאשר תגובת מפעיל היא נמוכה יותר) מוצג לתאם, המציין כי במחזור אוכלוסיות Trinidad &amp; המוקדם וארוך לאחר אנטיתחול genic נשאר קשור in vivo. מצד שני, עוצמת תגובת vivo לשעבר אינה מופיעה להיות קשורה לעוצמת תגובת הזיכרון 29. תוצאות אלו מצביעות על כך שתגובות γ-IFN תרבותיים לטווח ארוך כתוצאה מהתרחבות ELISPOT במבחנה של TCM ודעיכה קשורה של תגובות מפעיל במדגם, ולא ההתמיינות של תאי מפעיל לפנוטיפ TCM. עם הבקר, את התרומה היחסית של תת מפעיל וזיכרון לתגובות זוהתה על ידי מבחני ELISPOT IFN-γ לטווח הארוך אינה ידועה. מחקרים שנעשה לאחרונה מצביעים על מתאם בין החיסון עורר תגובות לטווח ארוך בתרבית γ-IFN ELISPOT והגנה מפני זיהום הניסיון הבא עם מ &#39; בוביס 23-24. זה כבר דווח כי תגובות חלשות לטווח ארוך IFN-γ ELISPOT לחיסון קשורים להיעדר ההגנה 30. שניהם חיים ולהרוגחיסוני אד לגרום תגובות ELISPOT vivo IFN-γ דומות לשעבר, אבל חיסון BCG עם החיה מעורר תגובות חזקות לטווח ארוך בתרבית γ-IFN ELISPOT מאשר לעשות הכנות חיסון נהרגו. מעניין לציין, חיסונים חיים הם הגנה תוך ניסוחים נהרגו אינם מספקים הגנה מפני אתגר עם mycobacteria הארסית שחפת 31-32, 33. הערכה של תגובות Trinidad &amp; היא גם אפשרית על ידי מיון תאים אלה מPBMC. העשרה ישירה של TCM מPBMC, לעומת זאת, דורשת מכשירים יקרים, מאומנים אישי וקשה כמו תאים אלה אינם רבים בזרם הדם. תרבות לטווח הארוך של PBMC מספקת העשרה של TCM על TEM ותאי מפעיל ללא מכשירים יקרים; עם זאת, מכיוון שאוכלוסיות תאי T אלה הרחיבו במבחנה הם עשויים להיות פחות נציג של תגובות זיכרון in vivo. אפשר לגשת לתגובות זיכרון IFN-γ (באמצעות התרבות לטווח הארוך או סוג Trinidad &amp;ing אסטרטגיות) על ידי מבחני אחרים מאשר ELISPOT כגון: ELISAs ציטוקינים 34, מערכי חרוז ציטוקינים (CBA), מכתים תאיים (ICS), או מערכי חלבון ציטוקינים (רו&quot;ח). שיטות אלה; עם זאת, בדרך כלל פחות רגישים מאשר ELISPOT מבחני 35. יתרון של ELISPOT הוא היכולת שלה לזהות את הלכידה המיידית של ציטוקינים זמן קצר לאחר שחרורו מניעת דילול בsupernatant והשפלה על ידי מחשוף האנזימטית או ספיגת ציטוקינים על ידי תאים אחרים. מבחני ELISPOT לזהות תאים בודדים ייצור ציטוקינים לספק תוצאות מדויקות אפילו באות נמוכה לתרחישי רעש (כלומר, תגובות ספציפיות נמוכות) 35. כמו כן, עם ICS, זיהוי של ציטוקינים לפני השחרור עלול לגרום לזיהוי מוטעה של תאים מייצרים ציטוקינים (למשל., בשל אפנון לאחר translational לפני או במהלך תהליך ההפרשה) 34. מעכבי התחבורה מועסקים במבחני ICS כדי למזער הפרשת ציטוקיניםבמהלך גירוי אנטיגן (המכונה חלבוני תחנת Golgi) להגביל את משך הזמן של גירוי תא בשל רעילות התא של חלבונים אלה סופו של דבר משפיעים על ייצור ציטוקינים 35. עם זאת אמרה - CBA, רו&quot;ח וICS טכניקות שימושיות למדידת ציטוקינים מרובים בו זמנית ו / או לקביעת ביטוי סמן תא שטח (כלומר, עם ICS.). לכן, שיטות אלה יכולים לשמש בשילוב עם assay ELISPOT γ-IFN 36. בעוד שמחקרי יעילות חיסון שחפת הבקר קודמים נמדדו תגובות Trinidad &amp; באמצעות assay ELISPOT, זיהוי של תגובות Trinidad &amp; על ידי טכניקות אחרות צפוי להניב תוצאות דומות. חשוב לציין, assay ELISPOT הוא פחות יקר ופשוטה לביצוע מאשר CBA, טכניקות רו&quot;ח וניתוח ICS 34. ספירה ידנית של SFC היא אלטרנטיבה לספירה אוטומטית, וניתן לאחסן צלחות ELISPOT ב RT לתקופה ארוכה של זמן עם אובדן איכות מינימאלי, לפני או אחרי הנקודה גounting 37. תגובת γ-IFN התרבותית ארוך טווח ELISPOT יושמה להעריך תגובות זיכרון על ידי אדם, ובקר בעת הערכת תגובות חיסון שחפת 14-16,31-32,33. תגובות TCM גם הם הניחו לשחק תפקידים משמעותיים בתגובות מארח לכמה סוכנים אחרים זיהומיות של בקר, כגון:. mycoides Mycoplasma mycoides subsp 42, Anaplasma marginale 38 ווירוס syncytial נשימה שור 39. פוטנציאלי, assay ELISPOT לטווח הארוך עשוי להיות מותאם לבעלי חי מינים, ציטוקינים וזיהומים אחרים. יישומים רחבים יותר אלה יהיו שימושיים במיוחד עבור יישומי אימונולוגיה וטרינרים בשל זמינות מוגבלת של חומרים כימיים מסוימים. תגובות TCM הן חיוניות להגנה מפני זיהומים כמה, אבל מדידה אותם מוקדם לאחר הדבקה / חיסון (לחיזוי תוצאת מחלה או יעילות חיסון) may להיות מסורבל. ניתוח של התגובה החיסונית תחת vivo לשעבר ותנאי גירוי אנטיגני קצרים יותר לעתים קרובות מייצג תגובות מפעיל, בשל החפיפה של תגובות וזכרון מפעיל, במיוחד בתחילת היווצרות זיכרון חיסונית. בהקשר של מחלות כרוניות שבעומס אנטיגן הוא מתמשך, תגובות vivo לשעבר תהיה להעריך תגובות תא מפעיל או שילוב של תגובות זיכרון ותא מפעיל. Assay γ-IFN התרבותי ארוך טווח ELISPOT, שתואר כאן, סביר להניח מאפשר המדידה של תגובות Trinidad &amp; ולא תא T מפעיל או תגובות של תאי CD4 + בשילוב. לסיכום, assay γ-IFN התרבותי ארוך טווח ELISPOT מספק גישה רבת ערך להערכת תגובות זיכרון תא T וכבר מועסק בהצלחה על מנת להעריך את תגובות של כמה מיני זיכרון למגוון רחב של סוכני זיהומים 12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.

תאי מפעיל וT הזיכרון נוצרים באמצעות תיכנות ההתפתחותי של תאי CD4 + T הנאיביים לאחר הכרת אנטיגן. התמיינות של תאי CD4 + T הנאיביים לתאי ציטוקינים הפקה דורשת הכרת הפתוגן על ידי תאי מערכת חיסון מולדים, הצגת אנטיגן לתאי T, שיתוף גירוי ושינויי תעתיק וכתוצאה מכך ייצור ציטוקינים מקוטב. לדוגמא: תאי הצגת אנטיגן לייצר אינטרלוקין (IL) -12 בתגובה לפתוגנים תאיים, אשר, יחד עם הכרת אנטיגן, מקדם התמיינות של תאי T לעוזר T 1 תאים (Th1) 1,2 על ידי איתות באמצעות מתמר אות ומפעיל של שעתוק 4 (STAT4) ו- T-תיבה לידי ביטוי בתאי T (T-הימור), שמוביל להפעלת תא, IL-2 ייצור, הרחבה משובט ואינטרפרון (IFN) ייצור -γ 3,4. אם הזיהום נשלט, עד 95% מתאי T שנוצרו בשלב ההרחבה בוטלו (כלומר, התכווצותתאי שלב) וT הזיכרון יישארו, לפעמים לכל חיים 5. Sallusto et al. 6, חשפו שני תת תפקודי שונים של תאי T זיכרון בבני אדם המבוססים על הביטוי של קולטנים ביות בלוטה לימפה. תאי T הזיכרון מרכזי (TCM) להביע את קולט chemokine CC (CCR) -7 וCD45RO וממוקמים בעיקר באזורי T-cell של איברי הלימפה משניים. TCM מוגבל תפקוד מפעיל, סף הפעלה נמוך ולשמור על ייצור IL-2 גבוה ויכולת שגשוג. תאי T זיכרון מפעיל (TEM) להביע CD45RO, חסרים קולטני CCR7 ותצוגה לביות לרקמות היקפיים או מודלקות. תאי מפעיל אינם מבטאים גם CCR7 או CD45RO אבל מייד לייצר ציטוקינים מפעיל, כגון IFN-γ, בעת הכרת אנטיגן. מבחני שחרור IFN-γ (IGRA) משמשים לאבחון של שור ושחפת אדם 7. Mycobacterium וביס הוא הסוכן העיקרי של שחפת הבקר (BTB) תוך CA האנושיSES של שחפת נגרמים בעיקר על ידי שחפת Mycobacterium. עם בדיקות אלה, כל דם או תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) מומרצים עם אנטיגנים mycobacterial ל16-24 שעות וייצור IFN-γ בתוך supernatant נמדד על ידי ELISA או באמצעות זיהוי של תאים מייצרים IFN-γ תוך שימוש בטכניקות ELISPOT. כתוצאה מתקופת הגירוי הקצרה (כלומר., 16 עד 24 שעות) וייצור ציטוקינים מהיר, מבחני vivo לשעבר לזהות בעיקר תגובות מפעיל וTEM. זה אושר על ידי ניתוח התזרים cytometric של אוכלוסיות תאים בתרבויות אלה 8-10. Vivo לשעבר תגובות IFN-γ כלולים באופן שיגרתי בהערכת פנל תגובה החיסונית של חיסוני שחפת, לרבות אלה המשמשים להערכת תגובות על ידי בקר. רוב חיסוני שחפת הבקר יעילים לעורר תגובת IFN-γ ספציפי, אך לא את כל החיסונים שגורמים לתגובות IFN-γ הם protectivדואר. כמו כן, הרמות של IFN-γ שהושרו על ידי חיסון, כפי שנמדד לפני הזיהום, לא בהכרח תואמות את ההגנה. לדוגמא, ייתכן שיש לי זני BCG שונים יכולות שונות כדי לגרום לvivo לשעבר תגובת IFN-γ, למרות רמות הגנה דומות 11. לפיכך, vivo לשעבר IGRAs הם בעלי ערך לאבחון שחפת ולגישה חיסוני חיסון; עם זאת, השימוש בם כמנבאים של יעילות חיסון הוא מוגבל. תגובות TCM לחיסון, לעומת זאת, ניתן להשתמש כדי לחזות את יעילות חיסון, כפי שהודגמו עם זיהום בנגיף הכשל החיסוני סימיאן (SIV) בפרימטים לא אנושיים 12,13, שחפת בעכברי 14 ומלריה בבני האדם 15,16. לאחר תגובה חיסונית יעילה וכתוצאה מכך אישור הפתוגן, TCM נשמרים ולספק הגנה לזיהום שני סופו של דבר על ידי אותו הסוכן. יוצא דופן בולטת לתרחיש זה היא מ &#39; infe שחפתסיפורת של בני אדם שבו חולים שקבלו טיפול אנטי-mycobacterial מרפא רגישות לזיהום מחדש 17,18. בנוסף, אירועים המסדירים זיכרון חיסוני במהלך זיהומים כרוניים, שבו גירוי אנטיגני נמשך, אינם מובנות היטב 19. במהלך זיהומים כרוניים, כגון בוירוס כשל חיסוני אנושי (HIV) ושחפת, תגובת Trinidad &amp; משמעותית קשורה לתוצאה חיובית (לדוגמא, חביון עם שחפת ותת-קליניים עם HIV) 20,21. מספר מחקרים בעכברים ובבני אדם הראו כי מבחני ELISPOT לטווח ארוך בתרבית IFN-γ למדוד תגובות Trinidad &amp; 16,20-22. עם assay זה, PBMCs בתרבית בהפחתת ריכוז של אנטיגן במשך 10 עד 14 ימים, ומאפשר תגובות מפעיל לשיא ולדעוך; הקלת Trinidad &amp; לבדל ולהרחיב בתוך התרבות. מבחני ELISPOT לטווח ארוך בתרבית IFN-γ יש גם שימשו בוטרינריםמחקר, עדיין הפנוטיפ של תאים להגיב כבר קשה להעריך בשל חוסר של חומרים כימיים קריטיים, במיוחד נוגדן לCCR7. חיסוני שחפת הבקר יעילים [למשל. באמצעות מנה אחת של מ &#39; בוביס Bacille Calmette גרן (BCG), BCG אחרי חיסון-וקטורים נגיפיים Antigen 85A מקטע, או M מוחלש. וביס ΔRD1] לעורר תגובה לטווח ארוך בתרבית γ-IFN ELISPOT הבאה חיסון המתואמים עם הגנה (כלומר, נטל mycobacterial נמוך וירידה ב הפתולוגיה הקשורים TB) נגד האתגר הבא עם מ &#39;הארסי בוביס 23,24. יתר על כן, מספרם של תאי IFN-γ-מפריש אנטיגן הספציפי בתוך תרבויות PBMC לטווח ארוך הם גבוהים יותר בגיל 12 חודשים, אך להקטין ב 24 חודשים לאחר חיסון BCG של עגלים בילוד, מקשר עם התואר של פוסט זיהוי הגנה מ &#39; אתגר בוביס 25. בתרחיש זה, IFN-γ ELISPOT התרבותית היאכלי חשוב n לניבוי יעילות חיסון, מתן אמצעים כדי לתעדף מועמדי חיסון לניסויי יעילות עלות גבוהה. בנוסף, ניתן להתאים טכניקות ELISPOT תרבותית עבור מארחים, פתוגנים וציטוקינים שונים על ידי שינוי אנטיגנים או נוגדנים למגוון רחב של מטרות בתחומי מחקר שונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sodium citrate (dihydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Citric acid (monohydrate)</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dextrose</td>
			<td rowspan="2">Various</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISPOT PVDF plate</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC &#8211; AP KIT Standard</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>AK-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Blue Alkaline Phosphatase Substrate Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag85A</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0004.3</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB 10.4</td>
			<td>Lionex</td>
			<td>LRP-0061.6</td>
			<td>23, 24, 25, 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPDb</td>
			<td>Prionics AG</td>
			<td>7600055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rESAT-6:CFP10</td>
			<td>Kind gift Dr. Minion, Iastate</td>
			<td></td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783B</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947; Biotinylated Clone CC330</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2112</td>
			<td>23, 24, 25, 27,&#160; 37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD4 Clone CC8</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1653GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine CD45RO Clone IL116A</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA2434GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-human CCR7 Clone 3D12</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab95665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-bovine IFN-&#947;-Pe Clone CC302</td>
			<td>Serotec</td>
			<td>MCA1783PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti- mouse IgG2a- Alexa Fluor 350</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG3 APC-CY7</td>
			<td>SouthernBiotechnology</td>
			<td>1080-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG-APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm&#8482;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrefeldinA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pokeweed Mitogen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinat human Interleukin 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7908</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay for assessing effector and memory t cell responses in cattle

תאי מפעיל וT הזיכרון נוצרים באמצעות תיכנות ההתפתחותי של תאים נאיביים הבאות הכרת אנטיגן. אם הזיהום נשלט עד 95% מתאי T שנוצרו בשלב ההרחבה בוטלו (כלומר., שלב התכווצות) ותאי T הזיכרון יישארו, לפעמים לכל חיים. בבני אדם, שני תת תפקודי שונים של תאי T זיכרון תוארו מבוססת על הביטוי של קולטנים ביות בלוטה לימפה. תאי T זיכרון מרכזי לבטא קולט CC chemokine 7 וCD45RO וממוקמים בעיקר באזורי T-cell של איברי הלימפה משניים. תאי T זיכרון מפעיל להביע CD45RO, חסרים קולטני CCR7 ותצוגה הקשורים ביות הלימפוציטים לרקמות היקפית או מודלקות. תאי מפעיל T אינם מבטאים גם CCR7 או CD45RO אלא על מפגש עם ציטוקינים מפעיל תוצרת אנטיגן, כגון אינטרפרון-γ. מבחני שחרור אינטרפרון-γ משמשים לאבחון של שור ושחפת אדם ולזהות בעיקר מפעיל ותגובות תא T זיכרון מפעיל. תגובות תא T הזיכרון מרכזית על ידי תאי CD4 + T כדי חיסון, לעומת זאת, ניתן להשתמש כדי לחזות את יעילות חיסון, כפי שהודגמו עם זיהום קופי וירוס הכשל החיסוני של קופים שאינם בני אדם, שחפת בעכברים, ומלריה בבני אדם. מספר מחקרים בעכברים ובבני אדם, כמו גם נתונים שלא פורסמו בבקר, הוכיחו כי מבחני ELISPOT אינטרפרון-γ למדוד תגובות תא T זיכרון מרכזי. עם assay זה, תאי הדם היקפיים mononuclear בתרבית בהפחתת ריכוז של אנטיגן במשך 10 עד 14 ימים (לטווח ארוך תרבות), המאפשר תגובות מפעיל לשיא ולדעוך; הקלת תאי T הזיכרון מרכזיים לבדל ולהרחיב בתוך התרבות.

כ זיהום פוסט-תרסיס של חודש אחד עם מ &#39; בוביס (10 4 יחידות מושבה יוצרים), PBMCs מנגוע (n = 8) ובעלי חיים ביקורת (n = 8) היו בתרבית בנוכחות של אנטיגנים וIL-2 במשך 13 ימים. פיתוח של תגובות Trinidad &amp; לאחר ההדבקה נקבע באמצעות assay ELISPOT IFN-γ. נציג TCM (בנוכחות או עדר של נגמ&quot;שים) לשעבר vivo IFN-γ תגובות ELISPOT מבעלי חיים נגועים (שלושה בעלי חיים) ושאינם נגועים בבעלי חיים (בעלי חיים אחד) מוצגים באיור 1. IFN-γ מוצלח לטווח ארוך תוצאות ELISPOT assay בתאי ייצור IFN-γ (ספוט-יצירת תאים, SFC) בתנאי מגורה וליד העדר תגובה מבעלי חיים הנגועים שאינם ובתנאים שאינם מגורה. כמו כן, תגובה של תאי T חזק צריכה להתרחש בתגובה לPWM. מענה ספציפי למ &#39; בוביס הוערך על ידי PPD-B או rESAT-6: גירוי אנטיגני CFP10. כפי שניתן לראות באיור<html> 1, TCM חזק וvivo לשעבר תגובות לPPD-B וrESAT-6: CFP10 אותרו מכל שלוש מ &#39; בוביס -infected בעלי חיים. מינימאלי ללא TCM ותגובות vivo לשעבר התגלו מחית השליטה. כמו כן, הנוכחות של נגמ&quot;שים נדרשה לתגובות Trinidad &amp; אופטימליות על ידי בעלי חיים נגועים, כפי שהודגמה על ידי תגובות מופחתות במידה ניכרת על ידי תאים בתרבית לטווח ארוך, בהעדר נגמ&quot;שים אוטולוגית. תגובת IFN-γ על ידי PBMCs ממ &#39; בוביס נגוע ובעלי חיים נגועים שאינם מוצגים באיור 2. מספר SFCs מכל חיה חושב כממוצע של SFCs בדגימות כפולות בתגובה לPPD-B מינוס התגובה המתאימה לתקשורת בלבד. תגובות נאמדו עבור 10 6 תאים. תגובות שונות (P &lt;0.05) המבוסס על זיהום מעמד, נוכחות או עדר של נגמ&quot;שים ומשך התרבות (, לעומת vivo לשעבר תרבות תרבות לטווח ארוך כלומר.). <table border="0" cellpaddin</html style=";text-align:right;direction:rtl">= Cellspacing &quot;0&quot; ז = &quot;0&quot;&gt; <colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> רכישת תמונה של צלחות </td></tr><tr><td> 1. </td><td> הפעל מכונה </td></tr><tr><td> 2. </td><td> פתוח &quot;לכידת חיסונית&quot; תוכנת גרסת 6.3. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> שלב 1: סוג צלחת נבחרת. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> שלב 2: צלחת עומס. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> שלב 3: בחר אפשרויות סריקה. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> שלב 4: להתחיל בסריקה. </td></tr><tr><td> 7. </td><td> להשיג תמונת סקירה של צלחת. </td></tr><tr><td> 8. </td><td> הוצא צלחת. </td></tr><tr><td> 9. </td><td> צא תוכנה &quot;לכידת החיסוני&quot;. </td></tr><tr><td colspan="2"> ספירת יחידות הנקודה להרכיב </td></tr><tr><td> 1. </td><td> פתח &quot;לכידת ספוט החיסוני&quot; תוכנת גרסת 5.0. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> objec בחר<html> סוג T: רגיל. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> מודול בחר ספירה: ספירה חכמה. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> שלב 1: צלחת עומס. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> שלב 2: להגדיר פרמטרים ספירה: דיוק בדיקה של הכרת נקודה על בארות עם כתמים שונים. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> התחל לספור אוטומטי. </td></tr><tr><td colspan="2"> בקרת איכות </td></tr><tr><td> 1. </td><td> פתוח &quot;לכידת Immunospot&quot; תוכנת גרסת 5.0. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> מודול בחר ספירה: בקרת איכות. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> שלב 1: צלחת עומס. </td></tr><tr><td> 4. </td><td> שלב 2: לנתח בארות מסומנת בנפרד. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> לסיים בקרת איכות. </td></tr></tbody></table> טבלת 1 - רכישת תמונת קורא AutoImmun Diagnostika ELISPOT ותא ספירת הליך. ove_content &quot;FO: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig1.jpg" /> תמונת 1. איור של בארות מIFN- תרבותית ארוך טווח γ assay ELISPOT. Assay ELISPOT γ-IFN מתורבת בוצעה חודש לאחר approximatelyone אתגר עם מ &#39;הארסי בוביס (שלושה בעלי חיים). בעלי חיים שאינם נגועים נכללו כביקורת (חיה אחת) שורות תאים לטווח ארוך נוצרו על ידי גירוי PBMC עם קוקטייל של Ag85A רקומביננטי (1 מיקרוגרם / מיליליטר), TB10.4 (1 מיקרוגרם / מיליליטר), rESAT-6.: CFP10 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) וPPD-B (5 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 13 ימים ואחריו העברה לצלחות ELISPOT בנוכחות או עדר של APC אוטולוגית. תאים לזמן קצר כללו PBMC מבודד ביום 13 ומצופה ישירות לתוך צלחות ELISPOT. תאים לטווח ארוך וטווח קצר היו מגורה עם PPD-B, rESAT-6 (10 מיקרוגרם / מיליליטר): CFP10 (1 מיקרוגרם / מיליליטר), mitogen בינוני לבד או פיטולקה (5 &amp;# 956; ג &#39;/ מיליליטר) במשך 24 שעות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52833/52833fig2.jpg" /> איור 2. תוצאות נציגת IFN- תרבותית ארוך טווח γ תגובת ELISPOT למ &#39; נגזר חלבון מטוהר בוביס (PPD-B). assay מתורבת IFN-γELISPOT בוצע חודש לאחר approximatelyone אתגר עם מ &#39;הארסי בוביס (שמונה בעלי חיים). בעלי חיים שאינם נגועים נכללו כביקורת (תאי שמונה בעלי חיים לטווח ארוך נוצרו על ידי גירוי PBMC עם קוקטייל של Ag85A רקומביננטי (1 מיקרוגרם / מיליליטר), TB10.4 (1 מיקרוגרם / מיליליטר), rESAT-6: CFP10 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) וPPD-B (5 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 13 ימים ואחריו העברה לצלחות ELISPOT בנוכחות או עדר של נגמ&quot;שים אוטולוגית. תאים לזמן קצר כללו PBMC מבודד ביום 13 ומצופה ישירות לתוך צלחת ELISPOT . לטווח ארוך וshoתאי RT-טווח היו מגורה עם PPD-B (10 מיקרוגרם / מיליליטר) או בינוני לבד במשך 24 שעות. תגובות ספציפיות מכל חיה (SFC / 10 6 תאים) מוצגות כתגובה לPPD-B (ממוצע של דגימות כפולות) מינוס התגובה לתקשורת בלבד.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Long-term cultured Interferon-Î³ Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle at JoVE.com

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי צמוד אנזים משמש כמדד לתגובות זיכרון מרכזיים וקורלציה עם תגובות חיסון נגד mycobacterial מגן. עם assay זה, תאי דם היקפי mononuclear הם מגורה עם אנטיגנים mycobacterial וinterleukin-2 במשך 14 ימים, מה שמאפשר בידול והתרחבות של תאי T הזיכרון מרכזיים.

יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

application-long-term-cultured-interferon-enzyme-linked-immunospot

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

12.1K Views.  United States Department of Agriculture.  assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי צמוד אנזים משמש כמדד לתגובות זיכרון מרכזיים וקורלציה עם תגובות חיסון נגד mycobacterial מגן. עם assay זה, תאי דם היקפי mononuclear הם מגורה עם אנטיגנים mycobacterial וinterleukin-2 במשך 14 ימים, מה שמאפשר בידול והתרחבות של תאי T ה?...

Video: Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

השימוש במערכי יעד פלורסנט להערכה של תגובות תא T<em&gt; בvivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

דגם IL-8 עכבר transgenized חולף עבור<em&gt; בויבו</emמעקב ארוך טווח אחר תגובות דלקתיות

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

כרוני אוטואימונית יבש עין עכברוש דגם עם הגדלת זיכרון תאי זיכרון T ב Eyeball רקמות

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...