DRW נתמך על ידי מענקי NIH AI089972 וAI113217, ועל ידי הרירי אימונולוגיה מחקרי צוות, ופרס קריירה עבור מדענים רפואיים מWellcome בורוז הקרן מחזיק.

הערה: כל הניסויים שתוארו כאן היו בהתאם להנחיות ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים (IACUC) ואושרה על ידי בית החולים לבעלי חיים למחקר לילדים (קשת), בוסטון, מסצ&#39;וסטס. 1. הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורסת 1,000x IL-4: מדוללים ציטוקינים IL-4 עד 20 מיקרוגרם / מיליליטר בH 2 O או 0.1% אלבומין בסרום שור (BSA). לוותר ב200 aliquots μl 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge וחנות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1,000x אנטי CD40: השג מהיצרן ברמה של 1.0 מ&quot;ג / מיליליטר, חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקשורת גירוי תא B: כדי 425 מיליליטר של מדיום RPMI-1640, להוסיף 75 מיליליטר של סרום עגל עוברי מופשר טרי (FCS), 10 מיליליטר של 1.0 חיץ M HEPES, מניית L-גלוטמין 5 מיליליטר, 5 מיליליטר פניצילין: מניית סטרפטומיצין, 5 חומצות אמינו μl מיליליטר מינימאלי חיוני בינוני שאינו חיוני (MEM-NEAA), ו -3.5 של 2-mercaptoethanol. שמור תקשורת ב 4 C עד שבוע. הוספת IL-4 (20 ng / ml) ואנטי-CD40 (1.0 מיקרוגרם / מיליליטר) מייד לפני השימושרק להיקף המדיה הדרושה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2% FCS-FACS מאגר: הוסף 10 מיליליטר של FCS ל -490 מיליליטר של 1x PBS. לשמור על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2x טריפסין-EDTA: לדלל 5 מיליליטר של 10x פתרון טריפסין-EDTA מניות (טריפסין 5.0 גר &#39;, EDTA 2.0 גר&#39; לכל ליטר) ב 20 מיליליטר של 1x PBS. חנות טריפסין-EDTA ב2x עובד aliquots ב 4 מעלות צלזיוס. לאפשר כדי לחמם לטמפרטורת חדר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עגל בסרום עוברי: שמור FCS המופשר ב 4 C עד שבועיים. מניחים על קרח 15 דקות לפני ההליך מכתים cytoplasmic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורמלין שנאגרו ניטראלי: הכן פתרון 10% פורמלין (paraformaldehyde 3.7%). פורמלין הוא רעיל ולכן להתמודד עם זה מתחת למכסת מנוע קטר מעבדה כשהוא לבוש PPE המתאים. פורמלין לאחסן בטמפרטורת חדר בארון אחסון כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתנול: מתנול החנות המוחלט (100%) ב -20 ° C עד שהתאים מוכנים להיות permeabilized. הערה מתנול שהוא דליק וצריך להיות מאוחסן במקפיא מתאים. </li></ol> 2.טיהור והפעלה של תאי B <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטחול עכבר טרי שנקטפו, להכין השעיה תא בודדת על ידי הלחיצה בעדינות את האיבר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר עם הבוכנה של מזרק 3 מיליליטר. בצינור צנטריפוגות חרוטי 15 מיליליטר, לאסוף תאים ב 10 מיליליטר של 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את גלולה supernatant וגלול ב 1 מיליליטר של תאי דם אדומים lysing הצפת למשך 5 דקות. לנטרל עם 13.5 מיליליטר של 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגנטי נפרד (אופציונאלי) תאי B באמצעות אנטי CD45R (B220), שכותרת חרוזים, בעקבות פרוטוקול טיהור MACS לפי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר תאי B מטוהרים ברמה של 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר בתקשורת גירוי תא B חימם המכילה IL-4 (20 ng / ml) ואנטי-CD40 (1.0 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 5 ימים על 37 מעלות צלזיוס. התחל עם 8 מיליליטר של התרבות מחולק ל 2 בארות של צלחת תרבות 6 היטב (4 מיליליטר כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק cultuמחדש מדי יום כדי לשמור על 1.0 x 10 6 תאים / מיליליטר. התאם את הריכוז על ידי פיצול לתוך בארות אחרות ודילול התרבות עם תקשורת גירוי B תא המכילה IL-4 הטרי ואנטי-CD40. </li></ol> 3. trypsinization, קיבוע, וpermeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עד 1.0 x 10 7 של תאים בתרבית בצינור חרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, ולמזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם 10 מיליליטר של PBS להסיר את החלבון שיורית מתקשורת אוסף תא. חזור על שלב צנטריפוגה ולמזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה בהיקף הנותרת לאחר decanting (כ -100 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 800 μl של טמפרטורת חדר 0.1% (2x) טריפסין-EDTA לתאים. לוותר לאט בזווית של 45 מעלות כלפי מטה בצד של צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הצינור ומערבבים בעדינות על ידי הטיית הצינור כך הנוזל פועל לאורכו של זמן צינור 5-6s. משקע סיבי, לבן עלול להיווצר בפתרון. הגבל את זמן trypsinization לתחת דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את תגובת trypsinization עם 1 מיליליטר של FCS הקר. לדלל את FCS מייד על ידי הוספת 10 מיליליטר של PBS הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס, אז למזוג supernatant ולהחזיר את הצינורות לקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בהיקף הנותרת לאחר decanting. במידת צורך, להביא נפח עד עם PBS הקר 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף, להוסיף 800 μl של 10% פתרון ניטראלי שנאגרו פורמלין לתאים וpipet למעלה ולמטה. הצינור יחמם על התוספת של פורמלין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מיקסר מערבולת benchtop במהירות רועדת עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר 9 מיליליטר של (-20 ° C) מתנול הקר לpipet סרולוגיות 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הצינור המכיל את התאים על פני מיקסר המערבולת בעדינות להתחיל שקיןg התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת מתנול קר לצינור, כך שהוא נופל dropwise על גבי התאים תוך הצינור עדיין רעד כל כך שמתנול הוא הערבוב ברציפות. לאחר 2 מיליליטר הראשון של מתנול מהירות מחלק יכולה להיות מוגברת לזרם איטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו הצינור לשבת על קרח למשך 30 דקות כדי להשלים את permeabilization. לחלופין, ניתן לאחסן את התאים ב -20 ° C עד חודש. </li></ol></li></ol> 4. הקרינה מכתים לIgG1 ומיתוג IgE כיתה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ולמזוג את פתרון מתנול. משקע לבן עשוי גלולה עם התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של בטמפרטורת חדר 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות כדי לשטוף את התאים. חזור פעם אחת. הערה: כביסה גלולה עם טמפרטורת חדר PBS מתמוססת משקע נוסף שעלולות להיווצר לאחר שלב 4.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שטיפה נוספת עם 10 מיליליטר של 2% חיץ FCS-FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ דוגמאות ל96-גם סיבוב צלחת תחתונהו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. למזוג supernatant ולשים את הצלחת על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם ב -60 μl של 2% חיץ FCS-FACS לכל גם עם דילולים הנוגדן הבאים: Anti-IgM הרשתית / Cy7, 1: 200, Anti-IgG1 PE, 1: 600, Anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות של מכתים, לשטוף את הצלחת עם 150 μl של 2% חיץ FCS-FACS ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב400 μl של 2% חיץ FCS-FACS וpipet דרך מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור FACS 5 מיליליטר. </li></ol> 5. השתמש באסטרטגית gating בעקבות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד CD45R (B220) תאים חיוביים מאוכלוסיית הלימפוציטים פיצוץ ממוקמת על חלקת FSC / SSC (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהתאים החיוביים B220, להשתמש בעלילת IgE וIgG1 לחשוף האוכלוסיות המתאימות. </li></ol>

<ol>
	<li>Chaudhuri, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+immunoglobulin+heavy+chain+class+switch+recombination+mechanism.">Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism.</a> Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).</li><li>Gould, H. J., Sutton, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgE+in+allergy+and+asthma+today.">IgE in allergy and asthma today.</a> Nature reviews. Immunology. 8, 205-217 (2008).</li><li>Winter, W. E., Hardt, N. S., Fuhrman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunoglobulin E. Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 124 (9), 1382-1385 (2000).</li><li>Ozcan, E., Notarangelo, L. D., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immune+deficiencies+with+aberrant+IgE+production.">Primary immune deficiencies with aberrant IgE production.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 122, 1054-1062 (2008).</li><li>Bacharier, L. B., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+IgE+regulation.">Molecular mechanisms of IgE regulation.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 105, 547-558 (2000).</li><li>Yokota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+species+of+human+Fc+epsilon+receptor+II+(Fc+epsilon+RII/CD23):+tissue-specific+and+IL-4-specific+regulation+of+gene+expression.">Two species of human Fc epsilon receptor II (Fc epsilon RII/CD23): tissue-specific and IL-4-specific regulation of gene expression.</a> Cell. 55 (4), 611-618 (1988).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+class+switch+recombination+in+the+absence+of+both+Ku70+and+DNA+ligase+4.">Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4.</a> The Journal of experimental medicine. 207, 417-427 (2010).</li><li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptors+as+regulators+of+immune+responses.">Fcgamma receptors as regulators of immune responses.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (1), 34-47 (2008).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+mediates+productive+and+mutagenic+DNA+repair+through+distinct+phosphoprotein+interactions.">53BP1 mediates productive and mutagenic DNA repair through distinct phosphoprotein interactions.</a> Cell. 153 (6), 153-1280 (2013).</li><li>Wesemann, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+IgH+isotype-switched+B+cells+to+functional-grade+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming IgH isotype-switched B cells to functional-grade induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13745-13750 (2012).</li><li>Wesemann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+B+cells+preferentially+switch+to+IgE+with+increased+direct+S&#181;+to+S&#949;+recombination.">Immature B cells preferentially switch to IgE with increased direct S&#181; to S&#949; recombination.</a> The Journal of experimental medicine. 208 (13), 2733-2746 (2011).</li><li>Zarrin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily+conserved+target+motif+for+immunoglobulin+class-switch+recombination.">An evolutionarily conserved target motif for immunoglobulin class-switch recombination.</a> Nature immunology. 5, 1275-1281 (2004).</li><li>Fan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+class-specific+polyclonal+antibody-based+indirect+competitive+ELISA+for+detecting+fluoroquinolone+residues+in+milk.">Development of a class-specific polyclonal antibody-based indirect competitive ELISA for detecting fluoroquinolone residues in milk.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 13 (7), 545-554 (2012).</li><li>Perez, O., Krutzik, P., Nolan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+kinase+signaling+cascades.">Flow cytometric analysis of kinase signaling cascades.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 263, 67-94 (2004).</li><li>Jamur, M., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fixatives+for+immunostaining.">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 588, 55-61 (2010).</li><li>Ishizaka, T., Ishizaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+passive+sensitization.+IV.+Dissociation+of+IgE+molecules+from+basophil+receptors+at+acid+pH.">Mechanisms of passive sensitization. IV. Dissociation of IgE molecules from basophil receptors at acid pH.</a> Journal of immunology (Baltimore, MD. : 1950). 112 (3), 1078-1084 (1950).</li><li>Erazo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Maturation+Program+of+the+IgE+Response+In+Vivo.">Unique Maturation Program of the IgE Response In Vivo.</a> Immunity. 26, 191-203 (2007).</li><li>Xiong, H., Dolpady, J., Wabl, M., Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+class+switching+is+required+for+the+generation+of+high+affinity+IgE+antibodies.">Sequential class switching is required for the generation of high affinity IgE antibodies.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 353-364 (2012).</li><li>Yang, Z., Sullivan, B., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+vivo+detection+reveals+that+IgE(+)+B+cells+are+restrained+by+an+intrinsic+cell+fate+predisposition.">Fluorescent in vivo detection reveals that IgE(+) B cells are restrained by an intrinsic cell fate predisposition.</a> Immunity. 36 (5), 857-872 (2012).</li><li>Berkowska, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IgE(+)+B+cells+are+derived+from+T+cell-dependent+and+T+cell-independent+pathways.">Human IgE(+) B cells are derived from T cell-dependent and T cell-independent pathways.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. , (2014).</li><li>He, J. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinctive+germinal+center+phase+of+IgE++B+lymphocytes+limits+their+contribution+to+the+classical+memory+response.">The distinctive germinal center phase of IgE+ B lymphocytes limits their contribution to the classical memory response.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (12), 2755-2771 (2013).</li><li>Keegan, A., Fratazzi, C., Shopes, B., Baird, B., Conrad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+new+rat+anti-mouse+IgE+monoclonals+and+their+use+along+with+chimeric+IgE+to+further+define+the+site+that+interacts+with+Fc+epsilon+RII+and+Fc+epsilon+RI.">Characterization of new rat anti-mouse IgE monoclonals and their use along with chimeric IgE to further define the site that interacts with Fc epsilon RII and Fc epsilon RI.</a> Molecular immunology. 28 (10), 1149-1154 (1991).</li></ol>

The authors have no disclosures.

גירוי של תאי B טחול עכבר בתרבות עם אנטי CD40 וIL-4 יהיה לדמות סוג T מסייע 2 (T H 2) אינטראקציות, מיתוג כיתה מעודד לIgG1 וIgE 5. תאי B יכולים להיות מופעלים על אחריות חברתית בהקשר של splenocytes הכולל של 12 או תאי B טחול מטוהרים 11. כפי שצוין בפרוטוקול (שלב 2.3), העשרת תאי B...

במהלך שרשרת כבדה רקומבינציה אימונוגלובולינים (IGH) מתג כיתה (CSR) בעכברים ובבני אדם, IGH μ אקסונים קבועים אזור (Cμ) יימחקו ויוחלפו על ידי אחד מכמה סטים של אקסונים אזור קבועים במורד הזרם (ים H C) (למשל Cγ, Cε, וCα), וכתוצאה מכך מתג מייצור IgM לייצור של מעמדות אחרות איג (למשל IgG, IgE, או IgA). CSR מתרחש בתוך אזורי מתג (S), שהם 1-10 רצפי kb ממוקמים 5 &#39;לכל קבוצה של C H של 1. אנזים ההפעלה-induced Cytidine deaminase (AID) יוזם אחריות חברתית באמצעות פעילות דיאמינציה cytidine. IgE הוא מתווך עיקרי של מחלה אלרגית 2 והבנה טובה יותר של איך IgE מיוצר ומוסדר עשוי לפתוח דלתות לגישות טיפוליות חדשות למחלה אטופית. בעכברים ובבני אדם, IgE הוא אלוטיפ איג המוסדר ביותר בחוזקה. IgE בדרך כלל מתגלה באלפי רמות של times פחות מIGH האחר isotypes 3, אבל יכול להיות מורמים מאוד במצבי מחלה 4. עם זאת, אחריות חברתית לIgE הוא הבין באופן חלקי. הפעלה במבחנה של תאי B באמצעות IL-4 בשילוב עם שני אנטי CD40 או LPS, גורם לשני CSR IgG1 וIgE 5. תאי B מופעלים לבטא את קולט הנמוך זיקת IgE FcεRII / CD23 2,6, אשר נקשר IgE המסיס מופרש בתרבות לאחר CSR. לכן בעת ניתוח עם זרימת cytometry, תאי B עם כתם IgE-מחויב קולט בדומה לתאי B אופן אנדוגני להביע 7 IgE. אמנם ידוע כי B עכבר תאים לבטא את הזיקה הנמוכה IgG קולט FcγRIIB1 (CD32) 8, בניסיון שלנו זה לא מופיע להפריע למדידה של מיתוג בכיתה לIgG1. עם זאת, בעת מדידת מיתוג IgE לאחר הפעלת תא B בתרבות, IgE מחויב-פני השטח ספציפיים עלול לטשטש את הניתוח. עם שיטות צביעה משותפות, תאים שאינם IgE להביע להכתים חיובי עבור IgE. מתואר כאן היא אסטרטגיה שנוצלה לביצוע מבחני אחריות חברתית ולזהות תאי B להביע IgE אמיתיים מעכברים 9-11. טיפול בתאי B מופעלים עם טריפסין, מגיב מעבדה משותפת לעיכול חלבון, מסיר משטח מחויב שני cytophylic וקרום IgE. permeabilization לאחר והצביעה לIgE cytoplasmic כך חושפים את התאים מייצרי IgE האמיתיים.

<table><tbody><tr><td>Anti-Mouse IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553415</td><td>clone R35-72</td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550083</td><td>clone A85-1</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 40 &amp;micro;m Nylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainer 70 &amp;micro;m Nylon</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>anti-Mouse/Rat CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>clone HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) microbeads&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>MACS purification column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Reconstitute in water or 0.1% BSA</td></tr><tr><td>Formalin Solution, Neutral Buffered, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Solution (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5.0 g Trypsin, 2.0 g EDTA&amp;#8226;4 Na per Liter of 0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10,000 U Penicillin; 10 mg/ml Streptomycin (100x)</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Red cell lysis buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>clone 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone Fetal Calf Serum</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>B cell Stimulation media</td><td></td><td></td><td>B cell stimulation media consists of RPMI with fetal calf serum (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamine,&amp;nbsp; 1x Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U/ml, Streptomycin: 100 &amp;micro;g/ml), Beta-mercaptoethanol (7 &amp;micro;L/L), IL-4 (20 ng/ml), and anti-CD40 (1 &amp;micro;g/ml)</td></tr></tbody></table>

detection of true ige-expressing mouse b lineage cells

שרשרת כבדה (IGH) רקומבינציה אימונוגלובולין הלימפוציטים B מתג כיתה (CSR) היא תהליך שבו הביע תחילה IgM עובר לisotypes IGH האחר, כגון IgA, IgE וIgG. מדידה של IGH CSR במבחנה היא שיטת מפתח למחקר של מספר תהליכים הביולוגיים הנעים בין רקומבינציה DNA ותיקון להיבטים של אימונולוגיה מולקולרית ותאית. Assay במבחנה CSR כרוך ביטוי איג משטח מדידת הזרימה cytometric על תאי B מופעלים. בעוד מדידת subclasses IgA וIgG היא פשוטה, המדידה של IgE בשיטה זו היא בעייתית בשל IgE המסיס מחייב FcεRII / CD23 הביע על פני השטח של תאי B מופעלים. כאן אנו מתארים הליך ייחודי למדידה מדויקת של IgE-ייצור B עכבר תאים שעברו אחריות חברתית בתרבות. השיטה מבוססת על מחשוף בתיווך טריפסין של מתחמי IgE-CD23 על משטחי תא, ומאפשרת לגילוי של IgE-ייצור תאי B שושלת ידי CYצביעת toplasmic. הליך זה מציע פתרון נוח לניתוח הזרימה cytometric של CSR לIgE.

הליך זה יושם בהצלחה ללמוד CSR לIgE בB עכבר תאים. כדי להדגים את היעילות במדידת CSR, אנחנו מגורה תאי B טחול עכבר עם אנטי CD40 וIL-4 כפי שתואר לעיל 11. לאחר חמישה ימים של גירוי, תאים נאספו ועובדו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל ומוכתם עם fluorescently שכותרתו IgM, IgG1, IgE, וB220 נוגדנים (CD45R). מ?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells at JoVE.com

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

detection-of-true-ige-expressing-mouse-b-lineage-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K Views.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Video: Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable cytokine-secreting cells. In order to label IL-17-secreting cells, a single cell suspension of mouse splenocytes is prepared and stimulated at 37&deg;C with PMA/ionomycin to induce cytokine secretion. To stop secretion cells are then placed on ice and are exposed to the IL-17 Catch Reagent   a bi-specific antibody that binds to CD45 on the cell surface of leukocytes and to IL-17 as it is secreted and caught near the cell surface. Secretion is then re-started by increasing the temperature to 37&deg;C and IL-17 is trapped by the Catch Reagent. Secretion is then stopped again, by placing cells on ice. To detect the trapped IL-17, cells are incubated with a second IL-17-specific antibody conjugated to biotin and an Anti-Biotin-PE antibody. Cells can now be directly analyzed by flow cytometry or prepared for isolation and enrichment by subsequent labeling with Anti-PE conjugated MicroBeads.

This procedure describes the detection and isolation of mouse TH17 leukocytes that actively secrete IL-17 upon stimulation.

זיהוי ובידוד של Viable IL-17-מפריש תאים עכבר T

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

Biology

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of red cell formation is regulated by the hormone erythropoietin (Epo), whose synthesis is triggered by tissue hypoxia. A threat to adequate tissue oxygenation results in a rapid increase in Epo, driving an increase in erythropoietic rate, a process known as the erythropoietic stress response. The resulting increase in the number of circulating red cells improves tissue oxygen delivery. An efficient erythropoietic stress response is therefore critical to the survival and recovery from physiological and pathological conditions such as high altitude, anemia, hemorrhage, chemotherapy or stem cell transplantation. 
The mouse is a key model for the study of erythropoiesis and its stress response. Mouse definitive (adult-type) erythropoiesis takes place in the fetal liver between embryonic days 12.5 and 15.5, in the neonatal spleen, and in adult spleen and bone marrow. Classical methods of identifying erythroid progenitors in tissue rely on the ability of these cells to give rise to red cell colonies when plated in Epo-containing semi-solid media. Their erythroid precursor progeny are identified based on morphological criteria. Neither of these classical methods allow access to large numbers of differentiation-stage-specific erythroid cells for molecular study. Here we present a flow-cytometric method of identifying and studying differentiation-stage-specific erythroid progenitors and precursors, directly in the context of freshly isolated mouse tissue. The assay relies on the cell-surface markers CD71, Ter119, and on the flow-cytometric 'forward-scatter' parameter, which is a function of cell size. The CD71/Ter119 assay can be used to study erythroid progenitors during their response to erythropoietic stress in vivo, for example, in anemic mice or mice housed in low oxygen conditions. It may also be used to study erythroid progenitors directly in the tissues of genetically modified adult mice or embryos, in order to assess the specific role of the modified molecular pathway in erythropoiesis.

A flow-cytometric method for identification and molecular analysis of differentiation-stage-specific murine erythroid progenitors and precursors, directly in freshly &#x2013;harvested mouse bone marrow, spleen or fetal liver. The assay relies on cell-surface markers CD71, Ter119, and cell size.

זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

הדמיה של אינטרפרון באתרו הפקת גמא בטחול העכבר בעקבות זיהום יסטריה חיידקי

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.

הערכה של תאי עוזר T זקיקים ותגובת מרכז חיידקים במהלך שפעת זיהום וירוס בעכברים

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide further insight on cell function. B-1a cells are a unique B cell subset in mice that produce protective natural IgM antibodies against oxidation-specific epitopes that arise during health and disease. B-1a cell IgM production differs depending on B-1a cell location, and therefore it becomes useful from a therapeutic standpoint to target B-1a localization to niches supportive of high antibody production. Here we describe a method to target B-1a cell migration to the bone marrow by retroviral-mediated overexpression of the C-X-C motif chemokine receptor 4 (CXCR4). Gene induction in primary murine B cells can be challenging and typically yields low transfection efficiencies of 10-20% depending on technique. Here we demonstrate that retroviral transduction of primary murine B-1a cells results in 30-40% transduction efficiency. This method utilizes adoptive cell transfer of transduced B-1a cells into B cell-deficient recipient mice so that donor B-1a cell migration and localization can be visualized. This protocol can be modified for other retroviral constructs and can be used in diverse functional assays post-adoptive transfer, including analysis of donor cell or host cell phenotype and function, or analysis of soluble factors secreted post B-1a cell transfer. The use of distinct donor and recipient mice differentiated by CD45.1 and CD45.2 allotype and the presence of a GFP reporter within the retroviral plasmid could also enable detection of donor cells in other, immune-sufficient mouse models containing endogenous B cell populations.

Here we describe a method for retroviral overexpression and adoptive transfer of murine B-1a cells to examine in vivo B-1a cell migration and localization. This protocol can be extended for diverse downstream functional assays including quantification of donor B-1a cell localization or analysis of donor cell-derived secreted factors post-adoptive transfer.

Retroviral ביטוי יתר של CXCR4 על מורנה ב-1a תאים והעברה המאמצת עבור B-1a תא הגירה במח העצם ו IgM הפקה

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and T lymphocytes. Studies of zebrafish lymphopoiesis are difficult because antibodies recognizing D. rerio cell surface markers are generally not available, complicating isolation and characterization of different lymphocyte populations, including B-lineage cells. Transgenic lines with lineage-specific fluorophore expression are often used to circumvent this challenge. The transgenic lck:eGFP line has been used to study D. rerio T cell development, and has also been utilized to model T cell development and acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Although lck:eGFP fish have been widely used to analyze the T-lineage, they have not been used to study B cells. Recently, we discovered that many zebrafish B cells also express lck, albeit at lower levels. Consequently, lck:eGFP B cells likewise express low levels of GFP. Based on this finding, we developed a protocol to purify B-lineage cells from lck:eGFP zebrafish, which we report here. Our method describes how to utilize a fluorescent-activated cell sorter (FACS) to purify B cells from lck:eGFP fish or related lines, such as double-transgenic rag2:hMYC; lck:eGFP fish. In these lines, B cells, particularly immature B cells, express GFP at low but detectable levels, allowing them to be distinguished from T cells, which express GFP highly. B cells can be isolated from marrow, thymus, spleen, blood, or other tissues. This protocol provides a new method to purify D. rerio B cells, enabling studies focused on topics like B cell development and B lymphocyte malignancies.

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Transgenic lck:eGFP zebrafish express GFP highly in T lymphocytes, and have been used to study T cell development and acute lymphoblastic leukemia. This line can be used to study B cells, which express lck at lower levels. This protocol describes purification of malignant and non-malignant B cells from lck:eGFP zebrafish.

בידוד Malignant ותאי B Non-Malignant מ lck:eGFP דג זברה

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Medicine

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

בידוד תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 מרירית האף של העכבר כדי לזהות את הביטוי של CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

Analysis of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor-Producing T Helper Cells in a Mouse Model of Contact Hypersensitivity

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified as a distinct subset of T helper cells (GM-CSF+ IFN-&#947;- IL-17A- IL-22- effector CD4+ T cells) in human and mice. Contact hypersensitivity (CHS) is considered an excellent animal model for allergic contact dermatitis (ACD) in human, manifesting an intact T cell-mediated immune response. To provide a standardized and comprehensive assay to analyze the Th-GM cell subset in the T cell-dependent immune response in vivo, a murine CHS model was induced by sensitization/challenge with a reactive, low-molecular-weight, organic hapten, 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB). The Th-GM subset in effector CD4+ T cells generated upon immunization with the hapten was analyzed by flow cytometry. We found that Th-GM was mainly expanded in lesions and draining lymph nodes in the DNFB-induced CHS mouse model. This method can be applied to further study the biology of Th-GM cells and pharmacological research of therapeutic strategies centered on GM-CSF in various conditions, such as ACD.

Here, we present a simple and standardized method of analyzing the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper subset in vivo.

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified ...