עבודה זו מומנה על ידי מענק פרויקט הגילוי של הפדרציה האוסטרלית לפדרציה #1096623.

1. יצירת וקטור רקומביניזציה
<ol><li>זהה אזורי אגפים באורך 150 bp של הומולוגיה (המכונים הזרועות השמאלית והימנית) הדרושים לתיוג N- או C-terminally את הגן הוויראלי המעניין (ראה איור 1b).</li>
	<li>עיצוב רצף oligonucleotide הכולל את 150 bp זרועות שמאל וימינה מופרדים על ידי זוג אתרי הגבלה של בחירה. כל הרצף הזה חייב להיות מוקף גם על ידי זוג שני של אתרי הגבלה (שונה מהזוג הראשון) כדי לאפשר שילוב לתוך וקטור TDS פעם מסונתז. יש לדאוג בעת עיצוב oligonucleotide עם אתרי הגבלה כי הרצפים נמצאים במסגרת עם אתר הכניסה הרצוי.</li>
	<li>שלבו אתרי הגבלה בין הזרועות השמאלית והימנית בשעת עיצוב האוליגונוקלאוטידים לסינתזה, שחייבים להתאים לאלה שמאגפים את מסגרת הקריאה הפתוחה של התג הפלואורסצנטי המועדף (ראו איור 1b). ניתן להשתמש באתר הגבלת NotI כמקשר שלוש חומצות אמינו בין הזרוע השמאלית לתחילת התג הפלואורסצנטי.</li>
	<li>שלבו את אותם אתרי הגבלה משני צדי התג הפלואורסצנטי של PCR (ראו איור 1c).</li>
	<li>שכפל את הקטע המסונתז לווקטור TDS.</li>
	<li>שכפלו את התג הפלואורסצנטי בווקטור רקומבינצ'יני שנוצר באמצעות אתרי ההגבלה בין אזורי הזרוע השמאלית והימנית של ההומולוגיה (ראו איור 1d).</li>
</ol>2. יצירת וירוסים רקומביננטיים
<ol><li>לפי איור 2, להדביק monolayer של תאי BS-C-1 עם וירוס חיסון במדיה ללא סרום בריבוי של זיהום (MOI) > 1.</li>
	<li>1 שעה לאחר ההדבקה, תאי הצלה עם בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ו transfect עם תערובת של פלסמיד וקטור רקומבינציה reagent ו transfection ביחס של 3:1 במדיה ללא סרום.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, לגרד ולשחזר תאים ב- DMEM המכילים ללא סרום שור עוברי (FBS) ולבצע שלושה מחזורי הפשרה בהקפאה כדי לשבור תאים פתוחים ולשחרר חלקיקי וירוסים.</li>
	<li>בצע בדיקת פלאק עם כיסוי נוזלי של 10% FBS DMEM ו GPT בחירה ריאגנטים חומצה mycophenolic (25 מיקרוגרם / מיליליטר) ו xanthine (250 מיקרוגרם / מיליליטר) כדלקמן:<ol>
<li>זרעו צלחת של 6 בארות עם מונולייר של תאי BS-C-1.</li>
		<li>להדביק 100% monolayers תאים משולבים עם דילול סדרתי של תאים מופשרים בהקפאה המכילים חלקיקי וירוס כדי להבטיח הפרדה נאותה של לוחות בודדים.</li>
		<li>כיסוי עם נוזלי 10% FBS המכיל DMEM המכיל את ריאגנטים הבחירה GPT - חומצה mycophenolic ו xanthine בריכוזים הסופיים של 25 מיקרוגרם / מיליליטר ו 250 מיקרוגרם / מיליליטר בהתאמה.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר דגירה של 24 שעות, הסר את כיסוי הנוזל והשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לחפש לוחות המציגים פלואורסצנטיות אדומה מפוזרת המתאימה לשילוב של mCherry מווקטור TDS לתוך הנגיף. בהתאם לגן היעד ותג הפלואורסצנטי שנבחר, ניתן לראות פלואורסצנטיות מקומית של הגן המתויג גם באותו לוח אדום.</li>
	<li>בחר לוחות מרובים עבור כל וירוס רקומביננטי על ידי גירוד מקומי עם קצה פיפטה ו 100 μl של 5% FBS המכיל DMEM להעביר תאים צינור Eppendorf, ואחריו שלושה סיבובים של הפשרת הקפאה של תאים מגרדים לשחרר וירוסים רקומביננטיים.</li>
	<li>הוסף את DMEM המכיל וירוס מופשר בהקפאה לתוך monolayer של תאים בצלחת 12-well כדי להגביר וירוסים רקומביננטיים עם ריאגנטים הבחירה GPT במדיה הצמיחה. לגרד הגברות מוצלחות 24 שעות לאחר ההדבקה.</li>
	<li>בצעו בדיקת פלאק של לוחות מוגברים בהצלחה המציגים פלואורסצנטיות אדומה, הפעם עם כיסוי agarose ובחירת GPT, כדלקמן:<ol>
<li>זרעו צלחת של 6 בארות עם מונולייר של תאי BS-C-1.</li>
		<li>בצע דילול סדרתי של וירוסים רקומביננטי להדביק בארות עם דילול הולך וגדל של וירוסים ב DMEM חינם FBS.</li>
		<li>1 שעה לאחר ההדבקה, להסיר את המדיה הנוזלית כיסוי כל באר עם 0.5% agarose במדיום חיוני מינימלי (MEM) המכיל 2.5% FBS, 292 מיקרוגרם / מיליליטר L-גלוטמין, 100 U / ml פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, יחד עם reagents הבחירה GPT.</li>
	</ol></li>
	<li>2-3 ימים לאחר ההדבקה, לבחור לוחות המציגים פלואורסצנטיות כי הוא גם אדום ואת הצבע של תג פלואורסצנטי שנבחר כדי להגביר שוב, הפעם ללא בחירת GPT.</li>
	<li>בצע את ההסתעפות הבאה של לוחית עם שכבת-על של agarose ללא בחירה.</li>
	<li>בחר לוחות שאיבדו את הפלואורסצנטיות האדומה המפוזרת שלהם אך שומרים על הפלואורסצנטיות המקומית המתאימה לתג המועדף.</li>
	<li>המשך טיהור פלאק ללא בחירה כדי לקבל מלאי טהור של וירוסים רקומביננטיים שאיבדו את הגנים בחירת mCherry ו gpt אבל לשמור על פלואורסצנטיות מקומית המתאימה התג שנבחר. בדוק מניות טהורים על ידי פלאק assay, כל לוחות צריך פנוטיפ פלאק דומה.</li>
	<li>השתמשו בבדיקת PCR של דנ"א גנומי כדי להבטיח שמניות ויראליות טהורות.<ol>
<li>עיצוב פריימרים המאגפים את אתר החדרת הגנים הפלואורסצנטיים ואת פריימרים המחזקים את הגן הפלואורסצנטי שהוכנס עצמו. שילובים שונים של פריימרים אלה ייצרו אמפליונים PCR שיזהו החדרת גנים ויצביעו על טוהר.</li>
		<li>להגביר מניות ויראליות להיות PCR הוקרן בבאר אחת של 12-well צלחת monolayer של תאי BS-C-1.</li>
		<li>24 שעות לאחר זיהום, לגרד תאים נגועים לתוך 250 μl של DMEM.</li>
		<li>תאים נגועים צנטריפוגה (18,000 x g במשך 10 דקות, 4 מעלות צלזיוס), להסיר כדורי תא supernatant ו resuspend ב 500 μl TE (10 mM Tris-HCl ו 1 mM EDTA, pH 8) עם 0.1% (v / v) SDS. וורטקס כדי לתזמן תאים.</li>
		<li>הוסף 500 μl פנול-כלורופורם-isoamyl אקוהול, הפוך לערבב. צנטריפוגה (18,000 x גרם במשך 4 דקות, 4 מעלות צלזיוס). קח את העל-טבעי ותחזור.</li>
		<li>בצע משקעים אתנול על supernatant על ידי הוספת 1 מיליליטר 100% אתנול (מצונן) ו 50 μl נתרן אצטט, להפוך לערבב.</li>
		<li>השאירו ב -20 מעלות צלזיוס לילה או -80 מעלות צלזיוס למשך שעה. צנטריפוגה (18,000 x גרם במשך 30 דקות, 4 מעלות צלזיוס), להסיר את כל הנוזלים ולאפשר DNA מזורז לאוויר יבש. הושלה מחדש ב- 50 μl TE.</li>
		<li>השתמש בזה כתבנית להקרנת PCR DNA גנומי.</li>
	</ol></li>
</ol>3. דור של וירוסים רקומביננטים הנושאים יותר מתג אחד
<ol><li>מטבע אותו מונוליילר תא עם וירוסים רקומביננטיים פלואורסצנטיים כדי ליצור וירוסים בעלי תווית כפולה או משולשת או שגרה חוזרת מפרוטוקול 1) עם תג שונה.</li>
	<li>לטהר וירוסים המבוססים על פנוטיפ פלאק או הקרנת PCR של DNA גנומי לבודד וירוס.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventures+with+poxviruses+of+vertebrates.">Adventures with poxviruses of vertebrates.</a> FEMS Microbiol. Rev. 24, 123-133 (2000).</li><li>Goebel, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complete+DNA-Sequence+of+Vaccinia+Virus.">The Complete DNA-Sequence of Vaccinia Virus.</a> Virology. 179, 247-266 (1990).</li><li>Smith, G. L., Chan, Y. S., Howard, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide-sequence+of+42+kbp+of+vaccinia+virus-strain+WR+from+near+the+right+inverted+terminal+repeat.">Nucleotide-sequence of 42 kbp of vaccinia virus-strain WR from near the right inverted terminal repeat.</a> J. Gen. Virol. 72, 1349-1376 (1991).</li><li>Roberts, K. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+morphogenesis+and+dissemination.">Vaccinia virus morphogenesis and dissemination.</a> Trends Microbiol. 16, 472-479 (2008).</li><li>Gammon, D. B., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3+'-to-5+'+Exonuclease+Activity+of+Vaccinia+Virus+DNA+Polymerase+Is+Essential+and+Plays+a+Role+in+Promoting+Virus+Genetic+Recombination.">The 3 '-to-5 ' Exonuclease Activity of Vaccinia Virus DNA Polymerase Is Essential and Plays a Role in Promoting Virus Genetic Recombination.</a> J. Virol. 83, 4236-4250 (2009).</li><li>Yao, X. D., Evans, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+DNA+structure+and+homology+length+on+vaccinia+virus+recombination.">Effects of DNA structure and homology length on vaccinia virus recombination.</a> J. Virol. 75, 6923-6932 (2001).</li><li>Ward, B., Isaacs, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ch. 16 Vaccinia Virus and Poxvirology Vol. 269 Methods in Molecular Biology. 16, 205-218 (2004).</li><li>Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+Poxvirus+Vectors+Have+Capacity+for+at+Least+25,000.">Infectious Poxvirus Vectors Have Capacity for at Least 25,000.</a> Base-Pairs of Foreign DNA. Gene. 25, 21-28 (1983).</li><li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep-etch+EM+reveals+that+the+early+poxvirus+envelope+is+a+single+membrane+bilayer+stabilized+by+a+geodetic+&amp;#34;honeycomb&amp;#34;+surface+coat.">Deep-etch EM reveals that the early poxvirus envelope is a single membrane bilayer stabilized by a geodetic &amp;#34;honeycomb&amp;#34; surface coat.</a> J. Cell Biol. 169, 269-283 (2005).</li><li>Schmidt, F. I., Bleck, C. K. E., Mercer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+host+cell+entry.">Poxvirus host cell entry.</a> Curr. Opin. Virol. 2, 20-27 (2012).</li><li>Ward, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+characterization+of+the+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+intracellular+mature+virions.">Visualization and characterization of the intracellular movement of vaccinia virus intracellular mature virions.</a> J. Virol. 79, 4755-4763 (2005).</li><li>Carter, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+cores+are+transported+on+microtubules.">Vaccinia virus cores are transported on microtubules.</a> J. Gen. Virol. 84, 2443-2458 (2003).</li><li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera.">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> J. Virol. 75, 4802-4813 (2001).</li><li>Rodriguez, J. F., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+size+phenotype+as+a+selectable+marker+to+generate+vaccinia+virus+recombinants.">Plaque size phenotype as a selectable marker to generate vaccinia virus recombinants.</a> J. Virol. 63, 997-1001 (1989).</li><li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+on+the+basis+of+plaque-formation.">Selection of recombinant vaccinia viruses on the basis of plaque-formation.</a> Gene. 158, 157-162 (1995).</li><li>Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+-+a+selectable+eukaryotic+cloning+and+expression+vector.">Vaccinia virus - a selectable eukaryotic cloning and expression vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7415-7419 (1982).</li><li>Panicali, D., Grzelecki, A., Huang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccinia+virus+vectors+utilizing+the+beta-galactosidase+assay+for+rapid+selection+of+recombinant+viruses+and+measurement+of+gene-expression.">Vaccinia virus vectors utilizing the beta-galactosidase assay for rapid selection of recombinant viruses and measurement of gene-expression.</a> Gene. 47, 193-199 (1986).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia-coli+gpt+gene+provides+dominant+selection+for+vaccinia+virus+open+reading+frame+expression+vectors.">Escherichia-coli gpt gene provides dominant selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors.</a> J. Virol. 62, 1849-1854 (1988).</li><li>Liu, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+recombinant+vaccinia+viruses+(Tian-Tan+strain)+expressing+hepatitis-B+virus+surface-antigen+by+using+beta-galactosidase+as+a+marker.">Selection of recombinant vaccinia viruses (Tian-Tan strain) expressing hepatitis-B virus surface-antigen by using beta-galactosidase as a marker.</a> Sci. China Ser. B-Chem. 33, 188-197 (1990).</li><li>Dom&#237;nguez, J., Lorenzo, M. D. M., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+expressed+by+a+recombinant+vaccinia+virus+permits+early+detection+of+infected+cells+by+flow+cytometry.">Green fluorescent protein expressed by a recombinant vaccinia virus permits early detection of infected cells by flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 220, 115-121 (1998).</li><li>Falkner, F. G., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+dominant+selection+of+recombinant+vaccinia+viruses.">Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses.</a> J. Virol. 64, 3108-3111 (1990).</li><li>Cordeiro, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F11-Mediated+Inhibition+of+RhoA+Signalling+Enhances+the+Spread+of+Vaccinia+Virus+In+Vitro+and+In+Vivo+in+an+Intranasal+Mouse+Model+of+Infection.">F11-Mediated Inhibition of RhoA Signalling Enhances the Spread of Vaccinia Virus In Vitro and In Vivo in an Intranasal Mouse Model of Infection.</a> Plos One. 4, (2009).</li><li>Jensen, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+major+membrane+and+core+proteins+of+vaccinia+virus+by+two-dimensional+electrophoresis.">Identification of the major membrane and core proteins of vaccinia virus by two-dimensional electrophoresis.</a> J. Virol. 70, 7485-7497 (1996).</li><li>Hirt, P., Hiller, G., Wittek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+Fine-Structure+of+a+Vaccinia+Virus+Gene+Encoding+an+Envelope+Antigen.">Localization and Fine-Structure of a Vaccinia Virus Gene Encoding an Envelope Antigen.</a> J. Virol. 58, 757-764 (1986).</li><li>Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cyan+fluorescent+protein+variant+useful+for.">An improved cyan fluorescent protein variant useful for.</a> 22, 445-449 (2004).</li><li>Shu, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> Plos Biol. 9, (2011).</li><li>Wong, Y. C., Lin, L. C. W., Melo-Silva, C. R., Smith, S. A., Tscharke, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+recombinant+poxviruses+using+a+compact+GFP-blasticidin+resistance+fusion+gene+for+selection.">Engineering recombinant poxviruses using a compact GFP-blasticidin resistance fusion gene for selection.</a> J. Virol. Methods. 171, 295-298 (2011).</li><li>Broder, C. C., Earl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 62, 173-197 (1997).</li><li>Blasco, R., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vaccinia+virus+formation+and+cell-to-cell+virus+transmission+are+prevented+by+deletion+of+the+gene+encoding+the+37,000-dalton+outer+envelope+protein.">Extracellular Vaccinia virus formation and cell-to-cell virus transmission are prevented by deletion of the gene encoding the 37,000-dalton outer envelope protein.</a> J. Virol. 65, 5910-5920 (1991).</li><li>Newsome, T. P., Marty, A. J., Lynn, H., Procter, D. J., Diefenbach, R. J., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+Navigating+the+subcellular+space:+Lessons+from+vaccinia+virus.">Ch. Navigating the subcellular space: Lessons from vaccinia virus.</a> Viral Transport, Assembly and Egress. , 155-177 (2011).</li><li>Jeshtadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Poxvirus+Intracellular+Mature+Virion+Proteins+with+the+TPR+Domain+of+Kinesin+Light+Chain+in+Live+Infected+Cells+Revealed+by+Two-Photon-Induced+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy.">Interaction of Poxvirus Intracellular Mature Virion Proteins with the TPR Domain of Kinesin Light Chain in Live Infected Cells Revealed by Two-Photon-Induced Fluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy.</a> J. Virol. 84, 12886-12894 (2010).</li><li>Weisswange, I., Newsome, T. P., Schleich, S., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rate+of+N-WASP+exchange+limits+the+extent+of+ARP2/3-complex-dependent+actin-based+motility.">The rate of N-WASP exchange limits the extent of ARP2/3-complex-dependent actin-based motility.</a> Nature. 458, (2009).</li><li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid,+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression.">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Res. 91, 72-80 (2011).</li><li>D&#233;nes, B., Fodor, N., Obenaus, A., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+oncolytic+Vaccinia+viruses+for+non-invasive+optical+imaging+of+tumors.">Engineering oncolytic Vaccinia viruses for non-invasive optical imaging of tumors.</a> Open Biotechnol. J. 2, 252-261 (2008).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+Potentiates+Vaccinia-Induced+Actin+Polymerization+to+Facilitate+Viral+Spread.">Clathrin Potentiates Vaccinia-Induced Actin Polymerization to Facilitate Viral Spread.</a> Cell Host Microbe. 12, 346-359 (2012).</li><li>Horsington, J., Turnbull, L., Whitchurch, C. B., Newsome, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-viral+imaging+of+vaccinia+virus+using+super-resolution+microscopy.">Sub-viral imaging of vaccinia virus using super-resolution microscopy.</a> J. Virol. Methods. 186, 132-136 (2012).</li><li>Horsington, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A36-dependent+Actin+Filament+Nucleation+Promotes+Release+of+Vaccinia+Virus.">A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li></ol>

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

טכניקה זו מתארת פרוטוקול יעיל ומודולרי ליצירת וירוסים רקומביננטיים המבטאים חלבונים ויראליים מתויגים בפלורסנט. השיטה מבטיחה שהשינוי היחיד בגנום הנגיפי הוא הוספת תג או סמן, ולא משאירים מאחור סמני בחירה. אורך הזרוע הקצרה הנדרשת עבור רקומבינציה הומולוגית מאפשר סינתזה ישירה שלה, ביטול מספר סיבובים זמן רב של PCR ושיבוט, בעוד הפלואורסצנטיות של mCherry ובחירת GPT מטבולית משמשים כדי לבודד ביניים רקומבינציה ויראלי. ביניים אלה ניתן לפתור, לאחר הסרת הבחירה, לנגיף עם גן מתויג או בחזרה לסוג ההורים. שיטה דומה המערבת שימוש הן בבחירה פלואורסצנטית והן בבחירה מטבולית תוארה בעבר27 אם כי השיטה המשמשת במחקר זה משתמשת באזורים קצרים מסונתזים של הומולוגיה, ומאפשרת זיהוי של הנגיף הרקומביננטי הרצוי על ידי הדמיה של הפלואורסצנטיות של הגן המתויג של עניין. בחירה משנית זו ישימה רק לתיוג גנים ויראליים בעלי ביטוי גבוה המייצרים פלואורסצנטיות מספקת במהלך בדיקת פלאק. לחלופין, אפשר לדמיין החדרה של קלטת ביטוי מלאה, למשל חלבון פלואורסצנטי תחת מקדם ויראלי חזק. במקרה זה הזרועות השמאלית והימנית יגדירו את נקודת הכניסה ולא את הגן הנגיפי שיש לתייג.
ישנם כמה צעדים מרכזיים שהוכחו כמועילים במהלך ההליך הניסיוני. הכיסוי הנוזלי בשלב 2.3.3 שתואר לעיל הוכיח את עצמו כחיוני לגילוי ובידוד של לוחות פלורסנט אדומים/ירוקים. אנו מאמינים כי השילוב של ריאגנטים לבחירת GPT וכיסוי agarose הרתיע את הצמיחה של וירוסים רקומביננטיים ולכן עבר כיסוי נוזלי עבור הצעד הראשון של הגברת וירוסים לאחר transfection. חשוב גם לבחור לוחות פלואורסצנטיים המציגים פלואורסצנטיות צבע תג מקומי להעשרה וטיהור, כמו מתווכים הנובעים רקומבינציה בזרוע שמאל עלול לגרום פלואורסצנטיות מפוזרת שנצפה לוחות אם הזרוע השמאלית מכילה גם רצף מקדם. הגן סמן mCherry בווקטור TDS עשוי גם להיות מוחלף gfp, למשל, כדי לאפשר שילוב קל ובחירה של mCherry כתג פלואורסצנטי.
טכניקות מסוימות שתוארו לעיל משתנות מעט משיטות מבוססות ליצירת וירוס חיסון רקומביננטי. לדוגמה, MOI של וירוס המשמש ליצירת recombinants הוא בדרך כלל פחות מ 128, אולם השימוש MOIs גבוה כבר מספיק ליצירת וירוס vaccinia רקומביננטי בשיטה זו. השימוש ריאגנטים הבחירה GPT בדרך כלל דורש קדם שכפול של התאים עם ריאגנטים בחירה18, אולם הוספת אותם במהלך שלב ההצלה לאחר ההדבקה עדיין סיפק מבחר מספיק של recombinants הרצוי, במיוחד בשל נוכחות של סמן הבחירה פלואורסצנטי גם כן.
כפי שהוזכר קודם לכן, אחת המגבלות של טכניקה זו היא כי שלב בחירת הפלואורסצנטיות המשנית מסתמך על החלבון המתויג של עניין לידי ביטוי מאוד, ברמה המאפשרת גילויו על ידי העין ב- plaque assay. בלי זה, ניתן יהיה לטהר וירוסים שהפגינו רק פלואורסצנטיות mCherry, מתוכם לפחות 50% יכילו את הנגיפים recombinant הרצוי, אשר ניתן לזהות על ידי אסטרטגיות מולקולריות כגון PCR המתואר בשלב 2.12 לעיל. מגבלה נוספת יכולה להיות השבתה של חלבונים מסוימים כתוצאה מהתיוג שלהם. התג הפלואורסצנטי עשוי לעבור מוטציות או להיחתך על ידי הנגיף הרקומביננטי עם חלף לאורך זמן. לכן, מומלץ לטעום באופן קבוע של מניות וירוסים רקומביננטיים על ידי מיקרוסקופיה ו- PCR. לבסוף, ייתכן שיש גבול למספר החלבונים המתויגים בפלורסנט שניתן לשלב בנגיף אחד. היבט אחד של זה הוא היכולת לדמיין את כולם בו זמנית; בהתחשב באופי החופף של ספקטרום הפליטה של תגי פלורסנט זמינים, חשוב לבחור אותם בקפידה כדי להבטיח דימום ספקטרלי מינימלי. בנוסף, שימוש בתגים הקשורים קשר הדוק כגון GFP ו Cerulean פותח את האפשרות של שילוב מחדש בין השניים, בהתאם למיקומם בגנום רקומביננטי.
האופי המודולרי של טכניקה זו מאפשר החלפה פשוטה של תגים פלואורסצנטיים המבוססים על תאימות עם אפשרויות אחרות של כתמים ו/או תגים. על ידי כריתת סמנים ניתנים לבחירה, שיטת TDS מאפשרת הוספה סדרתית של חלבונים פלואורסצנטיים שונים או שילוב של תיוג מבוסס TDS עם מחיקות גנים מבוססות TDS לניתוחים פנוטיפיים29. כדוגמה עבור התועלת של גישה זו, וירוס פלואורסצנטי מתויג כפול כי תוויות ליבות וירוס קרום WV נוצר. מחקרי הדמיה עם וירוס זה יכול לשמש כדי ללמוד תנועה, morphogenesis ועטיפה של וירוס במהלך שכפול וירוס. עדיין לא אופייני vaccinia חלבונים ויראליים עשויים גם להיות מתויגים ונחקרים על ידי טכניקה זו.
וירוס Vaccinia כבר בשימוש נרחב במחקרי הדמיה בשל מאפיינים רבים של הנגיף כי הם נוחים מיקרוסקופיה תאים חיים. תגים פלואורסצנטיים באים לידי ביטוי מהגנום הנגיפי, ומבטלים את הצורך בהעברה, ומאפשרים לנתח בקלות תאים ראשוניים שמקורם בבעלי חיים נגועים או בתאים שאינם ניתנים להעברה. בתחילה, VACVs פלואורסצנטי שימשו למעקב תת-תאי פשוט של תנועת וירוסים30, אך גישות עדכניות יותר הרחיבו את התועלת שלהם לכלול מחקרי FRET31, FRAP בחלקיקי וירוס יחיד32, כתבי מקדם33, הדמיה תוך-וvitלית34, ומחקרים מבניים35-37. כל הטכניקות האלה יכולות להיות בהישג יד קל יותר ויותר בשילוב עם שיטה זו של יצירת וירוסים פלואורסצנטיים רקומביננטיים.

וירוס Vaccinia (VACV) הוא אב טיפוס אבעבועות רוח הקשורים מאוד וירוס variola, הסוכן הסיבתי של אבעבועות שחורות. שני וירוסים אלה הם חברים בסוג orthopox הכולל פתוגנים בולטים אחרים כגון אבעבועות קוף וירוס אטרומליה (אבעבועות עכבר)1. Orthopoxviruses יש גנומים גדולים דו גדילי DNA (180-220 kb) כי לקודד כלפי מעלה של 200 מסגרות קריאה פתוחות חזויות2,3. שכפול של וירוסים אלה כרוך היווצרות של מפעל וירוסים perinuclear, שבו וירוסים בוגרים (MV) נעשים, ואת רשת טרנס גולגי שבו תת קבוצה של MV לרכוש שתי ממברנות נוספות כדי ליצור וירוסים עטופים (WV) (נבדק על ידי רוברטס סמית4). הגנום של אורתופוקס נוח מאוד למניפולציה גנטית בשל רמה גבוהה של רקומבינציה גנטית שהיא תכונה של שכפול גנום VACV ומתווכת על ידי פולימראז DNA ויראלי5. יצירת וירוסים רקומביננטיים מסתמכת על רקומביניזציה הומולוגית ומולקולות DNA ליניאריות עם הומולוגיות קטנות כמו 12 bp להיות מספיק כדי לתווך רקומביניזציה בתאים נגועים בנגיף vaccinia6. תיוג פלואורסצנטי של וירוס חיסון יכול להניב חלקיקי וירוס בהירים מאוד בשל הגודל הגדול של חלקיקי אורתופוקס, המאפשר שילוב של חלבונים פלואורסצנטיים רבים לכל virion7. Vaccinia יש את היכולת לשאת שברים גדולים של DNA זר8 יתר על כן, חוסר סימטריה קפסיד נוקשה עשוי לאפשר מידה מסוימת של גמישות בעת הבעת היתוך גנים חלבון ויראלי מ loci אנדוגני שלהם9. תיוג פלואורסצנטי של חלבוני VACV הוכיח לא יסולא בפז לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן ברמה התת-תאית, במיוחד בתחום כניסתוירוסים 10, תחבורה11-13, ו morphogenesis, במיוחד של virions עטוף7.
וירוסים רקומביננטיים ניתן לבחור על ידי הצלה של פנוטיפ צמיחה מוחלש14,15, בחירה מטבולית16-18, או על ידי ביטוי של גן סמן (למשל X-gal19 או חלבון פלואורסצנטי13,20). כאן אנו מתארים את הבחירה של וירוסים פלואורסצנטיים באמצעות שילוב רב עוצמה של בחירה פלואורסצנטית מטבולית. וקטורים של בחירה דומיננטית חולפת (TDS), שפותחו על ידי פוקנר ומוס (1990)21, מאפשרים לשלב סמנים יחד עם הגן הרצוי המתויג בפלורסנט. כאשר הבחירה המטבולית מוסרת, אירוע רקומבינציה משני יכול להתרחש אשר כורת את גני הבחירה, אך משאיר את חלבון הווירוס מתויג פלואורסצנטי ללא פגע. איור 2 להלן מספק סקירה כללית של ההליך הניסיוני. הגנים הנבחרים המשמשים במחקר זה הם mCherry ואת Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase (gpt) גן, שניהם באים לידי ביטוי מקדם ויראלי מוקדם / מאוחר סינתטי בשימוש בעבר על ידי Cordeiro et al. 22 בנוסף, יש פלואורסצנטיות של חלבון היתוך מתויג של עניין. כאשר הבחירה המטבולית מוסרת, הסמנים הניתנים לבחירה (mCherry ו- gpt) נכרתים, ומשאירים רק את הפלואורסצנטיות של הגן המתויג, המאפשר זיהוי של הווירוסים הרקומביננטיים הנכונים. כריתת סמני הבחירה מספקת אפשרות לשלב תגי פלואורסצנט מרובים, ומאפשרת לנו ליצור וירוסים עם היכולת לתייג בפלורסנט מספר חלבונים ויראליים בו זמנית. מחקרים קודמים קבעו את הדרישות המינימליות של הומולוגיה לחיסון מחדש של מולקולות דנ"א ליניאריות ועגולות שהודבקו בתאים נגועים בנגיף חיסון6. רצינו לקבוע את יעילות השילוב מחדש של אורכי הומולוגיה משתנים של זרועות אגף בווקטור GPT-mCherry TDS באמצעות שילובו לתוך הגנום הנגיפי vaccinia. נקבע כי אזורים הומולוגיים של 100 bp בווקטור TDS מספיקים כדי למקד ולתווך את החדרת ה- DNA הרקומביננטי לגנום VACV על ידי רקומבינציה הומולוגית (איור 4). בעוד אורכי הומולוגיה קטנים יותר יאפשרו גם שילוב מחדש, אורכי הומולוגיה של 100 bp סיפקו מספיק וירוסים רקומביננטיים שניתן לזהות בקלות עם בחירה מטבולית ופלואורסצנטית. שברי DNA בגודל זה יכולים להיות מסונתזים מסחרית בעלות נמוכה יחסית ומקל מאוד על הייצור של וקטורים מרובים ליצירת וירוסים רקומביננטיים. בחרנו להגדיל את אורך ההומולוגיה ל 150 bp כדי לספק תדירות recombination גדול יותר תוך שמירה על עלויות של סינתזה של רצף oligonucleotide של אזורי איגוף.

<table><tbody><tr><td>Mycophenolic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3536-50MG</td><td>Dissolve in 0.1 N NaOH</td></tr><tr><td>Xanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X0626-5G</td><td>Dissolve in 0.1 N NaoH</td></tr><tr><td>FuGENE HD transfection reagent</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002</td><td>Olympus, Chroma</td><td>BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

methodology for the efficient generation of fluorescently tagged vaccinia virus proteins

תיוג חלבונים נגיפיים בחלבונים פלואורסצנטיים הוכיח גישה הכרחית לקידום ההבנה שלנו לגבי אינטראקציות בין מארחי וירוסים. וירוס Vaccinia (VACV), החיסון החי המשמש למיגור אבעבועות שחורות, נוח במיוחד למיקרוסקופיה של תאים חיים פלואורסצנטיים בשל גודלו הגדול של הוויריון והקלות שבה ניתן לתכנן אותו ברמת הגנום. אנו מדווחים כאן פרוטוקול אופטימיזציה ליצירת וירוסים רקומביננטיים. הדרישות המינימליות עבור רקומבינציה הומולוגית ממוקדת במהלך שכפול חיסון נקבעו, המאפשר פישוט של יצירת בנייה. זה איפשר את הברית של בחירה דומיננטית חולפת (TDS) עם כתב פלואורסצנטי ובחירה מטבולית כדי לספק גישה מהירה ומודולרית לתיוג פלואורסצנטי חלבונים ויראליים. על ידי ייעול הדור של וירוסים רקומביננטיים פלואורסצנטיים, אנו מסוגלים להקל על יישומים במורד הזרם כגון ניתוח הדמיה מתקדם של היבטים רבים של יחסי הגומלין מארח וירוס המתרחשת במהלך שכפול וירוסים.

איור 1 מפרט את המבנים השונים הנדרשים עבור הליך זה, המסונתזים (איורים 1b ו- 1c) או נוצרים באמצעות שלבי שיבוט (איור 1d). איור 2 מספק חלוקה לרמות של ההליך הניסיוני עם תמונות פלאק פלואורסצנטי מייצגות של VACV רקומביננטי A3-GFP המתואר עבור כל שלב בתהליך הבחירה. באיור 3, מווירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים המתויגים בסמני פלואורסצנט המכוונים לחלבונים מבניים נגיפיים A3 ו- F13, שהם חלק מירעין הנגיף הפנימי23 והמעטפה החיצונית24, בהתאמה, מוצגים. תצפיות של לוחות נגיפיים ותאים נגועים עבור כל אחד מהווירוסים הרקומביננטיים שנוצרו מתוארים. היעילות של רקומבינציה הומולוגית של וקטורים עם הגנום VACV, המכיל נמוך כמו 70 bp אזורים של הומולוגיה אליו, נבדק והתוצאות מתוארות באיור 4. ההצלחה היחסית של זיהוי לוחות ויראליים העשויים משילוב מחדש עם וקטורים המכילים 100 bp homology היה ההיגיון מאחורי בחירה לסנתז 150 bp אורך זרועות שמאל וימינה של הומולוגיה לגן היעד.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> איור 1. וקטור רקומבינציה דומיננטי ארעי (TDS). (a)וקטור TDS עם סמני בחירה gpt ו- mCherry. (ב)זרועות שמאל וימין של הומולוגיה מתוכננות עם אתרי הגבלה ספציפיים בין זרועות ההומולוגיה ומאגפים אותה. אתרי הגבלה בין הזרועות השמאלית והימנית ששימשו בשיטה זו היו NotI ו- BamHI, אתר NotI המשמש גם כמקשר בין הגן לתג הפלואורסצנטי. (ג)תגי פלואורסצנט התואמים לשיטה זו מוקף באתרי הגבלה מתאימים. כמה תגים מועסקים הם GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק), RFP (חלבון פלואורסצנטי אדום), Cerulean (שיפור על ECFP, חלבון פלואורסצנטי ציאן, על ידי mutagenesis25מכוונת באתר) ו mini-SOG, חלבון פלואורסצנטי מהונדס מ GFP אשר יוצר מוצר לפתור על ידי EM על תאורה26. (ד)שיבוט צעדים מעורבים בדור של וקטור recombination TDS הסופי. האוליגונוקלאוטידים המסונתזים המכילים את זרועות האגף השמאלי והימני משוכפלים לראשונה לווקטור TDS. זה מספק וקטור רקומביניזציה שלתוכו כל תג של בחירה יכול להיות מועבר פנימה והחוצה על ידי שיבוט לתוך אתרי ההגבלה משולב בין הזרועות השמאלית והימנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> איור 2. קווי המתאר של ההליך הניסיוני ליצירת וירוס חיסון רקומביננטי. אירועים המתרחשים ברמות הגנטיות והתאיות מתוארים, יחד עם תמונות פלאק מייצגות המתארות את השלבים בעקבות יצירת נגיף חיסון פלואורסצנטי בעל תווית A3-GFP. (A)תאים נגועים בנגיף החיסון הם transfected עם וקטור רקומביניזציה TDS. באיורזה מתוארת רק תוצאה של שילוב מחדש ביד שמאל והדוגמה משתמשת ב- GFP כתג הפלואורסצנטי המועדף. רקומביניזציה ימנית תגרום לשילוב של כל פלסמיד TDS בגנום באופן דומה, אלא שהתג יתמזג לכל גן המטרה בשלב הביניים, כלומר שלב C. Asay פלאק מבוצע על monolayer התא עם תערובת רקומביניזציה נתון לבחירת GPT. (C) לוחות המציגים פלואורסצנטיות אדומה וירוקה, המתאימים לביטוי mCherry ו- GFP בהתאמה, נבחרים ומוגברים. לאחר הסרת הבחירה, יהיה אובדן של פלואורסצנטיות אדומה המתאימה לאובדן הגנים gpt ו- mCherry (D) ולוחות המציגים פלואורסצנטיות ירוקה בלבד נבחרים ומוגברים (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> איור 3. תוצאות מייצגות של מערכת שילוב מחדש של TDS. תמונות מתארות לוחות שלמים של תאים מדביקים VACV רקומביננטי לאחר 48 שעות (a, c, e; סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר), מלווה בתמונה של תא יחיד נגוע בווירוס רקומביננטי המתאים לאחר 8 שעות (b, d, f; סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר). גנים המתאימים לחלבונים מקומיים virion נבחרו כדי לדמיין חלקיקי וירוסים. A3 הוא חלבון ליבה של נגיף החיסון(באנגלית:A3) הוא חלבון מעטפה נגיפי. כמו כן מוצג וירוס בעל שתי תיוגים עם שתי תוויות פלואורסצנטיות A3 ו- F13 (e, f). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> איור 4. ניתוח כמותי של יעילות רקומבינציה בין וקטורים רקומביננטיים לגנום VACV. BS-C-1 monolayers נדבקו VACV ו transfected 1 שעה לאחר ההדבקה עם שלושה וקטורים רקומבינציה המכילים אזורים של הומולוגיה של או 500 bp, 100 bp, או 70 bp לגנום VACV. כל וקטור הכיל גם את קלטת TDS הכוללת גנים לבחירת gpt ו- mCherry. תאים נמצאו 24 שעות לאחר ההדבקה ו lysed לשחרר את וירוסים רקומביננטי נוצר. מבחני פלאק בוצעו על lysates התא עם מדיה בחירת GPT ולוחות מראה פלואורסצנטיות mCherry נספרו כמו רקומביננטיים מוצלחים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> איור 5. מפה של וקטור GPT-mCherry TDS המציג את אתר השיבוט המרובים. הווקטור תואר בעבר22 והמפה הווקטורית נוצרה בעזרת מפת EZ Plasmid v1.9 מקבוצת מעבדת ג'אנג (SCU). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר</a>.

Watch this Scientific Journal Video about Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins at JoVE.com

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

פרוטוקול מהיר ומודולרי ליצירת וירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בו זמנית בשיטת הבחירה הדומיננטית החולפת מתואר כאן.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K Views.  University of Sydney. פרוטוקול מהיר ומודולרי ליצירת וירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בו זמנית בשיטת הבחירה הדומיננטית החולפת מתואר כאן.

Video: Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex Vivo זיהום של רקמה חיה עם וירוסים oncolytic

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Medicine

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Neuroscience

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

גישה פשוטה ויעילה לבנות וקטורי וירוס Vaccinia Mutant

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.

יצירת וקטורים ההרפס העופות רקומביננטי עם CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.

דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a ...

Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased biosafety and stability over use of live pathogens. Non-infectious and self-assembling, VLPs are used to present structural proteins as immunogens, bypassing the need for live pathogens or recombinant viral vectors for antigen delivery. In this article, we demonstrate the different stages of VLP design and development for future applications in preclinical animal testing. The procedure includes the following stages: selection of antigen, expression of antigen in cell line of choice, purification of VLPs/SVPs, and quantification for antigen dosing. We demonstrate use of both mammalian and insect cell lines for expression of our antigens and demonstrate how methodologies differ in yield. The methodology presented may apply to a variety of pathogens and can be achieved by substituting the antigens with immunogenic structural proteins of the user&#39;s microorganism of interest. VLPs and SVPs assist with antigen characterization and selection of the best vaccine candidates.

Here, we present a protocol for synthesizing virus-like particles using either baculovirus or mammalian expression systems, and ultracentrifugation purification. This highly customizable approach is used to identify viral antigens as vaccine targets in a safe and flexible manner.

ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

Virus-like particles (VLPs) and subviral particles (SVPs) are an alternative approach to viral vaccine design that offers the advantages of increased ...

Biology

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

ייצור AAV פשוט ויעיל באמצעות תרבית מתלים HEK293

Production of High-Yield Adeno Associated Vector Batches Using HEK293 Suspension Cells

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, demonstrate extensive transduction of the CNS by intravenous injection in mice. To achieve comparable transduction, a 100-fold higher titer (minimally 1 x 1011 genome copies/mouse) is needed compared to direct injection in the CNS parenchyma. In our group, AAV production, including AAV.PHP.eB relies on adherent HEK293T cells and the triple transfection method. Achieving high yields of AAV with adherent cells entails a labor- and material-intensive process. This constraint prompted the development of a protocol for suspension-based cell culture in conical tubes. AAVs generated in adherent cells were compared to the suspension production method. Culture in suspension using transfection reagents Polyethylenimine or TransIt were compared. AAV vectors were purified by iodixanol gradient ultracentrifugation followed by buffer exchange and concentration using a centrifugal filter. With the adherent method, we achieved an average of 2.6 x 1012 genome copies (GC) total, whereas the suspension method and Polyethylenimine yielded 7.7 x 1012 GC in total, and TransIt yielded 2.4 x 1013 GC in total. There is no difference in in vivo transduction efficiency between vectors produced with adherent compared to the suspension cell system. In summary, a suspension HEK293 cell based AAV production protocol is introduced, resulting in a reduced amount of time and labor needed for vector production while achieving 3 to 9 times higher yields using components available from commercial vendors for research purposes.

מחבר זרקור: קידום ריפוי גנטי עם וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה באמצעות גידול תאי השעיה HEK293

Here, a suspension HEK293 cell-based AAV production protocol is presented, resulting in reduced time and labor needed for vector production using components that are available for research purposes from commercial vendors.

ייצור אצוות וקטוריות משויכות אדנו בעלות תפוקה גבוהה באמצעות תאי תרחיף HEK293

Adeno-associated viral vectors (AAVs) are a remarkable tool for investigating the central nervous system (CNS). Innovative capsids, such as AAV.PHP.eB, ...