Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

הערה: כל ההליכים אושרו על ידי רויאל ויקטוריאני עין ואוזן של ועדת בית החולים בעלי החיים מחקר ואתיקה (RVEEH AEC; # 10-199AB). טופלו הנושאים לפי הבריאות הממלכתית ו&quot; הקוד האוסטרלי עיסוק לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות &quot;של המועצה למחקר רפואי (2013) ואת&quot; צער בעלי חיים Act &quot;(1986; ותיקונים). כל נהלי ההערכה ואלקטרו כירורגים, הקליניים בוצעו בהרדמה וכל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. 1. Enucleation וקיבוע הערה: בצע את הליך enucleation וקיבעון שתואר בפירוט בכתב יד הלוויה 16, מטפלת נוסף סביב כבלי מכשיר או יציאות vitrectomy, אם קיימים. בקצרה, מדובר ב: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transcardially ינקב את הנושא עם מי מלח חם ואחרי buffe הניטרלי הקרפורמלין האדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור תפרים לגלגל העין לשמש כציוני דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Enucleate עין 16, שמירה על כבלי מכשיר וכל תיקון / כרטיסיות קובץ מצורף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את העין בפתרון של דוידסון ל18-36 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר ל -50% אתנול ל6-8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר ל -70% אתנול ושומר במקרר (4 מעלות צלזיוס) עד לנתיחה. </li></ol> 2. הסרת אלקטרודה וDissection. הערה: לא כל שתלי epiretinal יהיו את אותו גורם צורה, אבל באופן כללי יהיה מערך אלקטרודות וצורה כלשהי של חומר מוביל גמיש וconformable. מכשירים המודבקים על הרשתית כוללים חור נקודת סימון שבו נקודת סימון המתכת חודר את המערך ואחורי של העין, שמירה על אלה יחד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Visualise השתל והנקודה שבה מובטחת לרשתית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין 15 מעלות לעשות חתך טרנס-קרני היקפי ולהסיר את הכובע של הקרנית לexpOSE הקשתית והעדשה שבבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין 15 מעלות, disinsert סיבי zonular של העדשה ולהסיר את העדשה בטוטו, וחושף את התא האחורי עם שתל epiretinal ונקודת סימון המתכת באתר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לשתל והמחקר מתבצעים, להסיר רכיבים זרים לפני נתיחה נוספת. הערה: בדוגמא הנוכחית, מערך epiretinal נבחנים כלל חבילת אלקטרודה היהלומים והאלקטרוניקה אב טיפוס הרמטית שוכנת בתוך מנשא סיליקון קונפורמי (מיוצר בבית; מתייחס ל -20). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, לחלץ בזהירות את חבילת אלקטרודה יהלומים על ידי נתיחה בסדר עם אזמל. לעזוב את הגוף של השתל סיליקון יחד עם נקודת סימון הרשתית והשרידים של חיווט הפלטינה (איור 2). אם מערך / דיור מוטבע אינו חלק מעיצוב המכשיר תחת חקירה, ואז להשמיט את הצעד הזה (2.2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירותלנתח מדגם הכולל את סימון ורקמה סובב בכיוון הרצוי. השתמש במספריים לנתיחה קנס לחתוך רצועות בעובי מלאה מהחלק האחורי של העין, כולל לובן העין, דמית העין ורשתית. קח לדוגמה, אשר נותן חתך אורך של נקודת סימון, המציג את כל שכבות הרשתית בסמוך לנקודת סימון (איור 2) הערה: הכיוון הרצוי עבור המדגם עשוי להשתנות בהתאם לתוצאה המסוימת הרצויה. לדוגמא, אם רוצה לבחון את קרבתו של נזק נקודת סימון לדיסק האופטי אז הדיסק האופטי צריך להיות כלול בתוך המדגם. </li></ol> 3. התייבשות, הטבעה, הרכבה, ליטוש, מכתים, והדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את המדגם על פני שלושה ימים בשלבים מתקדמים אתנול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את המדגם באתנול 70% עבור שעה 2 פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את המדגם באתנול 80% עבור שעה 2 פעמיים ולאחר מכן O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את המדגם ב -90% אתנול עבור 2 twic hrדואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את המדגם באתנול 100% עבור שעה 2 פעמיים ולאחר מכן O / N. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את המדגם באצטון 100% עבור שעה 2 פעמיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדגם מאצטון ולבחון אותה תחת מיקרוסקופ אור כפי שהאוויר מתייבש בRT. להעביר את המדגם כדי אפוקסי (ראה שלב 3.4) ממש לפני שהוא מתחיל להסתלסל / קריסה. הערה: הסרת נוזל מתוצאות הרקמות הרכות בתאים והתכווצות התמוטטו. הערכה של מתי מסתלסל רקמה / הקריסה מתרחשת מפותחת עם ניסיון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שרף אפוקסי כיתה רפואית בהתאם להוראות יצרן. כדי לרפא את השרף, השתמש באחת 55 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 או 24 שעות בRT. מניחים בתא ואקום ל~ 5 דקות ב~ 50 mbar להסרת בועות אוויר. להסדיר את הוואקום ידני כאבק מוגזם תגרום לתערובת אפוקסי לרתיחה וסילוק גזים לא יתרחשו ביעילות הערה: בצע שלב 3.3 במקביל לצעד 3.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את sample בשרף אפוקסי ברור. לטבול את רקמת העין באפוקסי degassed במכל סגר מתאים ולהשאיר O / N ב RT כדי לרפא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשמור על עצמך כדי להטביע את המדגם בכיוון הרצוי (איור 2) על ידי שינוי גודל ומחדש הטבעת בלוק אפוקסי נרפא. -להטביע מחדש את הגוש לשנות את הגודל המכיל את רקמת העין, כך שהציר של נקודת סימון הארוך מכוון במקביל לתחתית התבנית (כוס צהובה - איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השרף בבעל דגימת טחינה ולטחון את המדגם (230 - 250 סל&quot;ד עם מים על, טחינה ידנית) משתמש בנייר סיליקון קרביד (החל עם 800 רשת; 3C דמויות ו3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים, טובל את פני קרקע בכתם כחול toluidine ל3-5 דקות, או עד שכתם המפתחת (איור 3F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף במים ברז (איור 3G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת פני הקרקע של הדגימה עם היקף לנתיחה בהספק גבוה כדי להמחיש את השכבות הסלולריות שלרשתית (איור 3H). החל ירידה של מים מזוקקים על פני השטח העליונים של אפוקסי מעל הדגימה כדי להחליק את העקיפה בממשק האוויר אפוקסי. השתמש במקור סיבים אופטי &quot;מתכווננת&quot; אור להאיר את המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.6-3.9, בכל פעם שחיקה משם עובי שנקבע מראש של מדגם (תוספת טחינת מינימום מדויקת ושחזור של בעל דגימה היא 20 מיקרומטר). </li></ol>

<ol>
	<li>Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+prostheses+for+the+blind.">Visual prostheses for the blind.</a> Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).</li><li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa.">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li><li>Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis.">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li><li>Roessler, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients.">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li><li>Chow, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa.">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li><li>Zrenner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words.">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).</li><li>Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa.">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li><li>Saunders, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+surgical+procedure+for+implantation+of+a+prototype+suprachoroidal+retinal+prosthesis.">Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis.</a> Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).</li><li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+microelectrode+arrays+for+artificial+retinal+implants+using+liquid+crystal+polymers.">Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+electrical+stimulation+with+a+suprachoroidal+multichannel+electrode+in+rabbit+eyes.">Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes.</a> Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).</li><li>Majji, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs.">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li><li>Walter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits.">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li><li>Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+stimulation+at+the+electrode-retina+interface.">Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).</li><li>Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+damaging+electrical+stimulation+in+the+retina.">Pathology of damaging electrical stimulation in the retina.</a> Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Electrical+Stimulation+with+a+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis:+A+Preclinical+Safety+and+Efficacy+Study.">Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study.</a> PLoS One. 9, e97182 (2014).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Processing+Eyes+Implanted+With+a+Retinal+Prosthesis+for+Localized+Histopathological+Analysis.">Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411 (2013).</li><li>Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surgical+techniques+for+implantation+of+a+wireless+intraocular+epiretinal+retina+implant+in+Gottingen+minipigs.">Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs.</a> Graefe's Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).</li><li>Gerding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+evaluation+of+intraocular+titanium+tacks+for+the+mechanical+stabilization+of+posterior+segment+ocular+implants.">Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants.</a> Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).</li><li>Seo, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+retinal+tack+for+the+epiretinal+&#64257;xation+of+the+polyimide+electrode+array.">Silicon retinal tack for the epiretinal &#64257;xation of the polyimide electrode array.</a> Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).</li><li>Hadjinicolaou, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+of+retinal+ganglion+cells+with+diamond+and+the+development+of+an+all+diamond+retinal+prosthesis.">Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis.</a> Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).</li><li>Briggs, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+round+window+and+cochleostomy+approaches+with+a+prototype+hearing+preservation+electrode.">Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode.</a> Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).</li><li>Shepherd, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cochlear+implant+electrode+array+for+use+in+experimental+studies.">An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies.</a> Hear Res. 277, 20-27 (2011).</li><li>Tykocinski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrode+position+in+the+human+cochlea+using+various+perimodiolar+electrode+arrays.">Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays.</a> Am J Otol. 21, 205-211 (2000).</li><li>Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+imaging+and+3D+reconstruction+of+mammalian+cochlea+by+fluorescent+confocal+microscopy.">A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy.</a> Brain Res. 1000, 200-210 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

טכניקות היסטולוגית סטנדרטיים איננו יכולות לעבד את שתלי מתכת קשים באתר בשל מגבלות בחיתוך אובייקטים אלה עם מתכת, זכוכית או אפילו להבי יהלום. נייר הלוויה שלנו 16, הראה שהשימוש בטכניקת קיבוע כל-עין שונה יכול להפחית delamination רשתית artifactual. בכתב היד הנוכחית, טחינה הוקמה וליטוש טכניקה המאפשר הדמיה שתלי שבלול 21-23 באתר שונה לתותבות רשתית. נקודת סימון טיטניום, המשמש לאבטחת מערך אלקטרודות לרשתית, epiretinally, הייתה מוטבע באפוקסי יחד עם רקמות העין שמסביב. בלוק שרף אז זה היה מכוון כראוי וקרקע בהדרגה / מלוטש כדי לחשוף את מורפולוגיה הרקמה מייד בסמוך לנקודת סימון המתכת. תמונות של פני השטח המלוטשים של הגוש בעומקים שונים צולמו עם מיקרוסקופ לנתיחה חזק. טכניקה זו שימושית עבור: חזותי וevaluating תגובת הרקמות סמוכה לשתל epiretinal; כדי להעריך את הטראומה הניתוחית הקשורים בהשתלה של השתל; כדי לקבוע את התגובה הביולוגית לרכיבי מתכת קשים; ולמדוד את המרחק בין השתל ואת פני השטח של הרשתית. טכניקה זו תהיה שימושית בעתיד מחקרי בטיחות בהדמיה באתרו של האזור הסמוך לנקודת סימון רשתית או (לדוגמא, מתכתי) חפצים אחרים קשים בעין. זו יש יישום ישיר בהערכת הבטיחות פרה-קלינית של תותבות מודבקות על הרשתית epiretinally. זה יכול להיות גם שימושי להערכת נזק לרקמות באזורי רשתית במגע עם שתלים ממוקמים במיקום תת-רשתית. ישנן מספר דרכים כדי לוודא שהטכניקה שבוצעה כהלכה. בכל שלב, הרשתית צריכה להישאר מחובר אל השכבות החיצוניות של העין. אם יש היפרדות רשתית artifactual ברוטו, זה עשוי הודיאכל בעיה עם הקיבעון. כאשר המדגם הוא משובץ ומחדש חוקיים בשרף הסופי לחסום את הרשתית צריך להיות קרוב למאונכים עם-טחינת הפנים של הבלוק; זה יהיה למזער חיתוך אלכסוני. כדאי לבדוק שמספר צעדי שחיקה מצטברים (של גודל צעד ידוע) נדרש לעבור אובייקט (כגון סימון ברשתית) לתאם בהתאם לממדים של האובייקט. הטכניקה יכולה להיות מותאמת בכמה דרכים. סריטות על פני השטח של בלוק אפוקסי הקשורים בתהליך שחיקה יכולות להיות מופחתות עם ליטוש עדין כיתה בהדרגה. לצורך המחקר הנוכחי, השתמשנו 800, 1000, 1200, 2400, 4000 ונייר סיליקון קרביד הכיתה. להדביק יהלומים יכולים לשמש גם כדי לשפר את לסיים את פני השטח. לסיים את פני השטח עדינים נותן תמונה באיכות גבוהה אך במחיר של זמן ליטוש נוסף. שיקול מרכזי נוסף לשיפור התוצאה של טכניקה זו הוא הבחירה והאיכות של optics ותאורה המשמשים ללכידת התמונה. כתמים אחרים בסיסיים היסטולוגית - במיוחד כתמי Nissl, ניתן להשתמש במקום של toluidine כחול, אבל עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת. כתמים מסוימים להכתים את השרף, כמו גם את הרקמות (למשל, Eosin), ולכן ייתכן שיהיה צורך פולני רדוד לאחר הצביעה כדי להסיר discolouration רקע. כתמים המתמחים, צבעי ניאון והמכתים immunohistochemical לא ניסו, אבל אם תוצאה מאוד ספציפית היא רצויה, הזמן הנדרש לביצוע כתמים אלה בכל רמה שחיקה עשוי להיות מונע. עם זאת, ייתכן שניתן להכתים את הרקמה כולה לפני שלב ההטבעה (שלב 3.4) 24. המגבלה העיקרית של שיטה זו היא שברגע שהאזור של עניין כבר השחיז, לא ניתן יהיה לאחזר אותו, ולכן, זה נבון כדי ללכוד תמונות רבות (אולי מיותר) במגוון רחב של הגדלה בכל שלב של השחזה וליטוש. זהחשוב גם להשתמש במרווחים קטנים עבור כל התאמת עומק שחיקה. מגבלה נוספת של שיטה זו היא ששל הגדלה האופטית ורזולוציה בהשוואה לרקמה רכובה על שקופיות זכוכית ונצפתה עם מיקרוסקופ רגיל (שידור) אור. לעניין prototyping והערכת הבטיחות של מכשיר שתל רומן, ההערכה פתולוגית ברוטו היא עניין עיקרי. טכניקה זו מספקת שיטה יעילה להתבוננות נזק רלוונטי קליני הקשורים לנקודת סימון רשתית. בעזרת תרגול, הזמן הכולל הנדרש כדי לאסוף לטחון, פולני ולצלם דגימה נתון (מוטבעת פעם אחת) הוא דומה לזמן שייקח לסעיף בלוק פרפין או סעיף קפוא. יש גם פוטנציאל לטכניקות הנוכחיות ליוארך ליישומים מחוץ להיקף של שתלי רשתית. טכניקה זו מתאימה להערכת הרקמה סמוכה לשתל קשה, שבו הפקת שתל היא לא feasible או יפגע בממשק. לדוגמא, טכניקה זו יכולה להיות מורחבת כדי להעריך שתלים עשויים ממתכת (לדוגמא, פלטינה, ניטינול, וכו &#39;) שלא ניתן לחתוך עם טכניקות היסטולוגית קונבנציונליות, כגון כמה מוח עמוק או אלקטרודות עצבים היקפיים, cannulae עבור משלוח סמים, סטנטים כלי דם או שתלים אורתופדיים.

רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) הוא הפרעה תורשתית הגורמת לאובדן נרחב של קולטני אור, שהם התאים בשכבה החיצונית של הרשתית אחראית על transducing אור, בצורה של פוטונים, לפעילות עצבית. חשוב לציין, בחולים עם RP בדרך כלל יש נוירונים שיורית בשכבות האחרות של הרשתית שלהם שעדיין פועל. תותבות רשתית הן מסוגלות להחזיר כמה ראייה מוגבלת לחולים אלו על ידי מיקוד הנוירונים ששרדו אלה עם גירוי חשמלי כדי להפעיל 1,2 מסלול הראייה שלהם. תוצאות תפיסתי ממחקרים קליניים הראו מבטיחות תוצאות מוקדמות ולאחרונה כמה מכשירים שאושרו לשימוש מסחרי. נכון לעכשיו, יש שלושה מקומות עיקריים אנטומיים בי תותבות רשתית קליניות הוצבו: epiretinally 3,4, subretinally 5,6 וsuprachoroidally 7,8. התקנים שונים עושים שימוש בחומרים שונים וצורתם מותאמתלמיקום שבו הם מושתלים. עם זאת, כולם ליצור תפיסות חזותיות על ידי הפעלת תאי העצב שיורית של הרשתית עם פולסים חשמליים. יש פוטנציאל לכל תותבת רפואית לניזק לרקמות עקב השפעות מכאניות של המיקום הראשוני או כוחות מתמשכים שלאחר מכן. במקרה של גירוי מושתל, כמו תותבות רשתית, יש שיקול נוסף שהפרמטרים החשמליים צריכים להיות בגבולות בטוחים. בטיחות מטופל היא בעל חשיבות עליונה, ולכן התקנים חייבים להיבדק בקפדנות במחקרים פרה-קליניים לפני קידום להגדרה קליני 9-15. במאמר הנלווה שלנו, שתארנו שיטה להערכת histopathology המקומי של העין סביב שתל ממוקם בחלל suprachoroidal 16. בכתב היד הנוכחית, אנו מתארים טכניקה המאפשרת הדמיה של רקמות העין שמסביב מערך אלקטרודות המודבק על הרשתית epiretinally, בפרה-קליני (Feמודל קו) (איור 1). מיקום epiretinal הוא העמדה מנוצל בדרך כלל לאיתור תותב חזותית. מערכי אלקטרודה ממוקמים כאן הם מודבקים בדרך כלל לרשתית עם נקודת סימון מתכת שחודרת את כל השכבות של העין 17-20. לפני הטכניקות מתוארות בכתב היד הנוכחי, זה היה קשה להעריך את הרשתית ורקמות אחרות המקיפות את נקודת סימון מייד במדויק. קיבעון עין סטנדרטי באמצעות ניטראלי שנאגרו פורמלין גרם לנזק ברשתית artifactual בשל תנועת ההפרש של הרשתית ולובן העין נגד נקודת סימון הקבוע. לכן כל נזק ממשי שנגרם על ידי סימון ומערך epiretinal לא יכול להיות שנצפה בצורה מדויקת. בנוסף, חתך ברקמת העין לא יכול להתבצע עם נקודת סימון הרשתית באתר כחפצי מתכת לא ניתן לחתוך בקלות עם מנגנון היסטולוגית מסורתי; הסרת סימון לפני עיבוד היסטולוגית היה גםלא רצוי כמו זה גם הוביל לנזק ברשתית artifactual. מטרת המחקר הנוכחי הייתה כפולה: 1) כדי להפחית artefact היפרדות הרשתית, כך שכל נזק שייגרם על ידי סימון ומערך שתל epiretinal ניתן להעריך באופן מהימן; ו -2) כדי להמחיש את ארכיטקטורת הרשתית סמוכה לנקודת סימון מבלי להסיר אותו. על מנת להשיג מטרת 1, טכניקת קיבעון חדשה נוצלה (כפי שמתוארת במאמר הנלווה 16), אשר מפחית delamination רשתית artifactual. על מנת להשיג מטרה 2, אנחנו שונה הטבעה, טחינה, וליטוש טכניקה, שפותחה במקור עבור בתצפית באתרו של אלקטרודות שתל שבלול 21-23. השיטות שתוארו בכתב היד הזה מאפשרים הדמיה של הרשתית מסביב ובצמוד לנקודת סימון באתר תוך מזעור נזק לרשתית artifactual ולכן מאפשר הערכה מדויקת של כל נזק פוטנציאלי שנגרם על ידי סימון ומערך epiretinal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="853">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Name of the reagent / equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:151px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Acetone</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Supply</td>
			<td style="width:176px;">AA008</td>
			<td style="width:151px;">Propanone BHD Medical grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Epo-Tek 301 Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Epoxy Technology</td>
			<td style="width:176px;">Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol 70-75% v/v</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">4.10261</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">90143</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Toluidine blue O</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">T3260</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">TegraPol grinding/polishing machine</td>
			<td>Struers</td>
			<td>TegraPol-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">AccuStop specimen holder</td>
			<td style="width:191px;">Struers</td>
			<td style="width:176px;">Accustop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2.0x Planapo Objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC-420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Software</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Application Suite v4.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

פרוטוקול הקיבעון באופן משמעותי מופחת ניתוק וdelamination של 16 רשתית artifactual. אוריינטציה של הדגימה בתוך בלוק אפוקסי הושגה באופן עקבי באמצעות התהליך בן שני שלבים שתואר הטבעה. הליך שחיקה מצטבר נדרש רמה מתונה של מיומנות ידנית על מנת להשיג תוצאות אופטימליות, אבל נעזר בבעל הדגימה מתכווננת אשר סיפק בקרה טובה על הרזולוציה תוספת. בכל המקרים (n = 5) נקודת סימון היה ממוקם במקום והקרקע / מלוטש עם תוצאות רצויות ועקביות. רשתיות סמוכות לנעצים היו פתירות ומוכתמות כראוי. ליטוש פני השטח של בלוק שרף אפוקסי עם # 800 נייר סיליקון קרביד P הכיתה היה מספיק כדי תמונת macrostructure הסלולרית של הרקמה המוטבעת. נייר גבוה יותר בכיתה, או slurry יהלומים עשוי לשמש כדי למרק נוסף פני השטח בכל עומק נתון אם תרצה בכך. מיקרוסקופ לנתיחה וסיבים אופטיים &quot;מתכווננת&quot; ניהול תאורההמקור לא נמצא מתאים להדמיה את פני השטח של בלוק הקרקע ודגימת הרקמה המוטבעת. המיקום של מקור האור היה מגוון על ידי ניסוי וטעייה כדי למצוא את מיקום וזווית שנתן התאורה ולעומת זאת הטובות ביותר מבעד למיקרוסקופ. מוסיף טיפה של מים מזוקקים על פני השטח של הבלוק, מעל המדגם, היה שימושי כדי להפחית את עקיפת אור דרך ו / או עיוותים חלקות בממשק אוויר אפוקסי. איור 4 מראה תמונות דוגמא של רקמת רשתית דמיינו מייד בסמוך לרשתית טיטניום טקטיקת שימוש בטכניקה זו. היפרדות רשתית ללא artifactual ומתקפל שניתן לראות משני צדי סיליקון (איור 4 א). פיר סימון גלוי משובץ בסיליקון; ראש נקודת סימון חדרה הרשתית ולובן העין. יש היפרדות רשתית אינה artifactual ברשתית שני הצדדים בלא כתם של סיליקון (איור 4C). הטכניקה הוכיחה כי, במקרה זה, יסדואר הוא חוסר ארגון ברשתית בסמוך לנקודת סימון והדחיסה של הרשתית בצד אחד, בשל זווית אלכסונית הכנסה. שים לב כי התמונות שהוצגו הן רק איורים של ההצלחה של הטכניקה, לא נציג של histopathology נקודת סימון-נזק באופן כללי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> איור 1. מיקום של מערך אלקטרודות epiretinal. (א) תרשים סכמטי של העין מראה חתך מוגדל של לובן העין האחורי, דמית העין ורשתית מנוונת (חסר קולטניות אור). מערך אלקטרודות מתואר בכחול, מודבק epiretinally. (ב) בעזרת מחשב-ציור של מערך אלקטרודות epiretinal. , משולב במעגל (&#39;שבב&#39;) וחבילת האלקטרודה; ב, טיטניום נקודת סימון רשתית; ג, דיור סיליקון רפואי; ד, נקודת יציאה ליתרון. לוח שונה מillustrati מקוריבאדיבות סיפקה של Bionic Vision Australia, זכויות היוצרים בית קרוצ&#39;ה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> איור 2. הסרת אלקטרודה ונתיחה של העין. צילומי מאקרו טווח דינמי הגבוה של עין חתולית enucleated עם נקודת סימון epiretinal באתר. () קיבעון הודעה עם המקבע של דוידסון לשימור ארכיטקטורת רשתית 16, עין enucleated הייתה גזור. חבילת מערך אלקטרודות הוסרה מנישא סיליקון (מתאר רבוע מקווקו מציין את מיקום מקורי של מערך אלקטרודות) עם סימון (חץ) וגוף של השתל סיליקון שנותר. (B) עין הייתה גזור עם חתך אורכי הסמוך ל נקודת סימון(קו מקווקו). נקודת סימון נשאר תקוע בקיר האחורי של עיינית (חץ), התייצב בעיקר על ידי לובן העין. סעיף הרקמה המכיל את נקודת סימון היה מוכן להטבעת שרף וטחינה (מגזר ימין), ואילו הסעיף המכיל את הרשתית מתחת למערך אלקטרודות שהוסר היה מוכן לעיבוד סטנדרטי היסטולוגית 16 (קטע משמאל). שליט עם מרווחים של 0.5 מ&quot;מ מוצג בקצה התחתון של כל לוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> איור 3. embedment אפוקסי וטחינה של סימון ורקמת רשתית. תצלומים של אפוקסי המשובץ ודגימת רקמה מיושרת, טחינה, מכתים והדמיה של סימון ורקמת רשתית. () מיקס<html> מדגם k היה מוטבע בגוש שרף אפוקסי. השימוש בתבנית, מדגם אוריינטציה כך מטוס האורך מקביל לתחתית התבנית. (ב) הבלוק נרפא אפוקסי המכיל מדגם נקודת סימון. (C) בלוק אפוקסי הוצגה בבעל דגימת טחינה, מוכן לטחינה . (ד) המדגם חוקיים מקטעים כך הדמיה של רקמות הקרקע מכילים את שכבות הרשתית סלולריות וציר אורך של סימון. (E) המדגם היה קרקע משתמש בנייר סיליקון קרביד על מטחנה סיבובית. (F) משטח הקרקע של הבלוק היה מוכתם בtoluidine הכחול לזהות שכבות רשתית. (G) הבלוק נשטף במים ברז כדי להסיר כתם עודף. (H) toluidine שכבות כחולות מוכתמות ברשתית וסימון היו צילמו באמצעות היקף נתיחה מופעל גבוה. מודעה / 52,348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; איור 4. כוח תמונות גבוהות ונמוכות של נקודת סימון והרשתית. בנקודות שונות במהלך תהליך טחינת התמונות צולמו בהיקף לנתח, מראה סעיפים אורך של נקודת סימון (כוכבית) חודר דרך העין ויציאה בלובן העין (&#39;S&#39; ), סמוך סיליקון (חשיש) וtoluidine כחול מוכתמים ורשתית בלא כתם (&#39;R&#39;). שים לב אלה הם תמונות דוגמא רק כדי להדגים את טכניקת ההדמיה ההווה, ואינם מייצג את כל תוצאות היסטולוגיה החדרת השתל או נקודת סימון epiretinal. שרידי קרקע של חיווט הפלטינה נראים בלוחות לספירה (&#39;W&#39;). (א) צריכת חשמל נמוך, תמונה ללא רבב של נקודת סימון חודר הרשתית ולובן העין. תמונה רבה עוצמה של היפרדות הרשתית (B) ומתקפל ברשתית בלא כתם סמוך למוביל סיליקון בתמונת כוח תמונת א &#39;(C) נמוכה במרכז פיר סימון. <strאונג&gt; כוח גבוה תמונה של מרכז נקודת סימון בתמונת ג (E) במדגם נפרד (D), ללא ספק סיליקון, תמונה המופעלת גבוהה של רשתית צבעונית הכחולה toluidine מתחת לידית נקודת סימון מוצגת, מייד לפני טחינת פיר סימון ארכיטקטורת רשתית צבעונית כחולה toluidine רגיל (F) (GCL: שכבת תאי הגנגליון ברשתית; INL: שכבת גרעין פנימית; ONL: שכבה חיצונית גרעינית; יחסי ציבור: קולטני אור; T: שכבת מחזירת אור של חתולים). דמיין באותה הטכניקה שחיקה . ברים סולם בכל לוח הם: A ו- C = 2 מ&quot;מ; B ו- D = 500 מיקרומטר; E = 200 מיקרומטר; F = 100 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks at 

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

טכניקות לעיני עיבוד מושתלים בתותב רשתית למותאם למקום Histopathological ניתוח: חלק 2 Epiretinal שתלים עם נעצי רשתית

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

techniques-for-processing-eyes-implanted-with-retinal-prosthesis-for

Research

JoVE Journal

Medicine

11.4K Views.  Bionics Institute. Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis. 

Video: Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

טכניקות לעיני עיבוד השתלה תותבת רשתית לניתוח Histopathological מרוכזות

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

צעד אחר פרוטוקול שלב לכירורגיה subretinal בארנבונים

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

לומד סוכרת דרך העיניים של דג: Microdissection, ויזואליזציה, וניתוח tg(fli:EGFP) למבוגרים להערכת רשתית דג זברה

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Biotribological Testing and Analysis of Articular Cartilage Sliding against Metal for Implants

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are now available for the shoulder, hip, ankle and the first metatarsalphalangeal joint. While providing pain reduction and clinical improvement, progressive degenerative changes of the opposing cartilage are observed in many patients. The mechanisms leading to this damage are not fully understood. This protocol describes a tribological experiment to simulate a metal-on-cartilage pairing and comprehensive analysis of the articular cartilage. Metal implant material is tested against bovine osteochondral cylinders as a model for human articular cartilage. By applying different loads and sliding speeds, physiological loading conditions can be imitated. To provide a comprehensive analysis of the effects on the articular cartilage, histology, metabolic activity and gene expression analysis are described in this protocol. The main advantage of tribological testing is that loading parameters can be adjusted freely to simulate in vivo conditions. Furthermore, different testing solutions might be used to investigate the influence of lubrication or pro-inflammatory agents. By using gene expression analysis for cartilage-specific genes and catabolic genes, early changes in the metabolism of articular chondrocytes in response to mechanical loading might be detected.

This protocol describes the preparation, biotribological testing, and analysis of osteochondral cylinders sliding against metal implant material. Outcome measures included in this protocol are metabolic activity, gene expression and histology.

בדיקות וניתוח ביוטריבולוגי של סחוס ארטיקולר מחליק נגד מתכת עבור שתלים

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

אינדוקציה וניתוח של עקה חמצונית ב היפהפייה הנרדמת טרנספוסון-transposon-transfected תאי אפיתל פיגמנט רשתית אנושית

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...