תהליך האינדוקציה מ hPSCs לתאי רשתית הוא מסובך וגוזל זמן רב. פרוטוקול ממוטב זה יכול ליצור רקמות רשתית עם רבייה גבוהה וללא עלות. היתרון של פרוטוקול זה הוא כימות גודל EB וצפיפות ציפוי כדי לשפר באופן משמעותי את היעילות ואת יכולת החזרה של אינדוקציה רשתית מ hPSCs.
בשיטה זו, כל תאי הרשתית העיקריים מופיעים ברצף ומשיבים מחדש את השלבים העיקריים של התפתחות הרשתית. זה יקל על מידול מחלות וטיפול בתאים למחלות ניווניות ברשתית. כדי להדגים את ההליך, אנחנו עם יואן גואן, דוקטורנט, ובינגבינג שי, טכנאי מהמעבדה.
התחל על ידי הכנת פתרון ECM של 50 מ"ל על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון המלאי השלישי 50 פעמים ל- 50 מ"ל של DMEM. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של פתרון ECM מוכן זה לכל באר של צלחת שש באר ולדגירה אותו במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. הכן בינוני תחזוקה hPSC על פי הוראת היצרן מראש לחום החדר במשך 30 דקות.
יוצקים מחמתן קריוגני של hPSCs ממיכל חנקן נוזלי על ידי דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות. בזהירות לחטא אותו באמצעות תרסיס אלכוהול 75% ולשים אותו בארון ביו בטיחות. העבר את ההשעיה התאית מהבילול לצינור 15 מ"מ.
לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל של תחזוקה בינונית תחזוקה מראש טיפה אחר טיפה לצינור באמצעות פיפטה 5 מ"ל, תוך ניעור בעדינות את הצינור כדי לערבב את hPSCs. צנטריפוגה הצינור ב 170 פעמים G במשך חמש דקות. הסר בזהירות את רוב supernatant באמצעות pipette 1 מ"ל, משאיר מאחור כ 50 microliters של supernatant כדי למנוע לאבד את התאים.
להשעות מחדש את הכדור עם 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה על ידי צנרת למעלה ולמטה. הסר ECM מהבארות מצופות מראש ולהוסיף 1.5 מיליליטר של תחזוקה בינונית לכל באר. לאחר מכן להפיץ 0.5 מיליליטר של השעיית תא לתוך כל באר.
יש לנער בעדינות את הצלחת כדי להפיץ את hPSCs באופן אחיד. שים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני לפחות 24 שעות כדי לקדם דבקות בתא. החלף מדיום כל יום ומעבר hPSCs ב 80% מפגש.
ביום-0, ליזום את ההבחנה על ידי הסרת 80% תאי מפגש מבאר אחת של צלחת שש באר. אסוף את התאים באמצעות פתרון דיסוציאציה של EDTA כמתואר בכתב היד של הטקסט. הסר את פתרון EDTA ולהוסיף 1 מ"ל של אמצעי תחזוקה המכיל 10 fluvastatin מיקרומולר כדי לעצור את פירוק התא.
לאסוף את התאים עם פיפטה 1 מ"ל. העבר את מתלה התא לצלחת פטרי צמודה אולטרה נמוכה 100 מ"מ והוסף 9 מ"ל של אמצעי תחזוקה המכיל 10 פלווסטטין מיקרומולר לצלחת. מנערים בעדינות את המנה פעמיים כדי להפיץ את התאים באופן אחיד.
לאחר מכן, שים אותו באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר התאים הם תרבית לפחות 24 שעות, להתבונן בהם תחת המיקרוסקופ. הוסף 9 מ"ל של תחזוקה בינונית ו 3 מ"ל של NIM לצינור 15 מ"ל.
מעבירים את תרביות התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ומוסיפים 10 מ"ל מתערובת ה-NIM החמה מראש למנה. צנטריפוגות הצינור ב 60 פעמים G במשך 3 דקות כדי לאסוף את האגרגטים. לאחר מכן להסיר את supernatant באמצעות פיפטה 5 מ"ל, משאיר מאחור כ 500 microliters כדי למנוע אובדן תאים.
מוסיפים 2 מ"ל מהתערובת לצינור ומעבירים את המתלים בחזרה לאותה צלחת פטרי. מנערים בעדינות את המנה כדי לפזר באופן אחיד את אגרגרגלי התא. לאחר מכן, החזירו את המנה לאינקובטור.
ביום-5, יש להסיר את ECM מהמנות המצולפות מראש ולהוסיף 10 מ"ל תותחם מראש לכל מנה. מוציאים את המנה המכילה Ebs ובודקים את איכות ה- EBs מתחת למיקרוסקופ, ומוודאים שהם בהירים ועגולים. לאסוף את כל EBs בצינור 15 מ"ל ולאפשר להם להסתפק 5 דקות.
לאחר מכן, להסיר את רוב supernatant, משאיר מאחור על 2 מ"ל של בינוני. לאחר ספירת ה- EBs, זרעו אותם טיפה אחר טיפה בצפיפות של כ 2-3 EBs לסנטימטר מרובע לתוך כלים מצופים המכילים 10 מ"ל של NIM. מנערים בעדינות את הכלים כדי להפיץ את ה- EBs באופן אחיד ומכניסים אותם לאינקובטור למשך 24 שעות לפחות.
השתמש מחט טונגסטן או מחט עם מזרק 1 מ"ל לנתק מכנית את שלטי הראייה לזיהוי מורפולוגי, יחד עם אפיתל פיגמנט הרשתית הסמוך בימים 28 עד 35. תרבות אותם בהשעיה. שים 50-60 שלשולים אופטיים לתוך כל 100 מילימטר צלחת תרבות התקשרות נמוכה 100 מ"מ, המכיל 15 מ"ל של RDM להיווצרות אורגנויד רשתית.
משנים את המדיום כל 2 עד 3 ימים עד יום-42. כדי ליזום את בידול הרשתית, hPSCs היו מנותקים לגושים קטנים ותרבות בהשעיה, אשר נוצר EBs מאז יום-1. ביום-5 EBs היו מצופים על מנות התרבות מצופות ECM והתאים היגרו בהדרגה מתוך EBs.
ביום-16, מדיום האינדוקציה הוחלף על ידי RDM, מה שגרם לתחומי הרשתית העצבית להיווצר ולבלט בהדרגה מהמנה, כמו גם, תאים היוצרים מבנים דמויי ארסיה אופטית מוקפים בתאי RPE. במהלך ימים-28 עד 35, organoids רשתית המורכבת הרשתית העצבית, מחובר לכדור RPE. בצד אחד נוצרו תאים.
ככל שהתקדמו הבידול והמפרט ברשתית, hPSCs הפיקו תת-סוגים של רשתית עצבית שהתיישרו בהדרגה בשכבות, ומחקו את המאפיינים האדריכליים של רשתית אנושית מקומית. תאי גנגליון רשתית נוצרו לראשונה מאבות רשתית והצטברו בצד הבסיסי של הרשתית העצבית. עם פרוטוקול זה, אורגנוידים רשתית התפתחו קולטני אור בוגרים מאוד עם שניהם, מוטות עשירים קונוסים.
תאי פוטורצפטור היו ממוקמים בצד האפיקלי, בעוד שתאי אמקרין, תאים אופקיים, תאים דו קוטביים ותאי גליה מולר היו כולם ממוקמים בשכבת הביניים של הרשתית העצבית. נקודות המפתח של פרוטוקול זה הן יצירת איכות גבוהה של Ebs וזריעת אותם בצפיפות הנכונה.
