Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.

כל הפרוטוקולים בוצעו בהתאם למדיניות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמשתי ישימה. 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תקשורת הייצוב עם 75% בינוניים הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 25% תמיסת המלח המאוזן &quot;הנקס (HBSS). מערבבים היטב, aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את בופר פוספט (PBS) לעקר ידי מעוקר. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר. מומלץ לחמם את PBS על 37 ° C לפני הניסוי (5 מ&quot;ל לכל טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10%, 20% ו -30% סוכרוז PBS. לסנן את כל הפתרונים בנפרד מעל 0.22 מיקרומטר מסננים נפרדים עבור עיקור. שמור פתרונות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מניות היסטמין ב PBS לריכוז של 90 מ&quot;מ. לעקר את הפתרון על ידי סינון על מסנן 0.22 מיקרומטר. Aliquot ולשמור הפתרון ב -80 מעלות צלזיוס. הימנע מחזורים להקפיא-ו-הפשרה מרובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך paraformaldehyde 4% טרי (PFA) ב- PBS לפני הניסוי. מניחים אותו על קרח. זהירות: שמור PFA במנדף וללבוש ציוד מגן מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה בינוני הייצוב (20 מיליליטר לכל רשתית). להוסיף פניצילין, סטרפטומיצין לריכוז סופי של 100 U / ml. חלק חם של המדיום (15 מ&quot;ל לכל רשתית) ל -37 מעלות צלזיוס חממה לפני הניסוי. השאירו את שאר המדיום על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את HBSS (10 מ&quot;ל לכל הרשתית) על קרח. </li></ol> 2. רשתית תרבות Organotypic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות במנדף בתרבית רקמה. פתח את עיינית בחתך סביב העדשה. בעזרת מברשת, להסיר את ההומור זגוגי בעדינות מבלי משיכת הרשתית. בעדינות לנתק את הרשתית מהקצה לחתוך עם מברשת לחשוף את בדיסק האופטי. חמור עצב הראייה בתער ולשחרר את הרשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרשתית לתוך צלחת פטרי ובזהירות לשטוף הרשתית פעם באמצעות HBSS קר. הנח את הדוגמה HBSS על iלִספִירַת הַנוֹצרִים. לנתח כמה הרשתיות החוצה לפי הצורך על ידי חזרה על שלב 2.1 ו על שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרשתית לשניים באופן סימטרי עם תער. בעדינות להעביר דגימות לצלחת 6-היטב עם 3 מ&quot;ל של התקשורת ייצוב לכל טוב. אפשר איזון למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם האווירה המכילה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ריאגנטים הבאים במהלך הדגירה על שלב 2.3: לדלל את הפתרון המניות היסטמין לריכוז הרצוי (450 מיקרומטר) במדיום חמים. ממיסים LXA4 (מאוחסן תחת ארגון) לתוך המדיום לריכוז סופי של 250 ng / ml. הערה: כאשר מודדים את השפעת LXA4, מחצית מן הרשתית יחיד משמש היסטמין לבד, בעוד החצי השני משמש היסטמין עם LXA4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום ייצוב בזהירות ולהוסיף המדיום מוכן היטב כל (3 מ&quot;ל לכל טוב). דגירת הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. באינקובטור עם האווירה המכילה 2 5% CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים אתדגימות פעם חם, PBS סטרילית. </li></ol> 3. להכין את דגימות Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS מהצלחות. להוסיף 4% PFA (3 מ&quot;ל לכל טוב) ו דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לשאוב PFA. שוטפים את דגימות פעם באמצעות PBS. העברת דגימות 10% סוכרוז (5 מ&quot;ל לכל טוב) ו דגירה של 2 עד 4 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות סוכרוז 30% (5 מ&quot;ל לכל טוב) ו דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. מערבב חלק אחד של מדיום ההקפאה המסחרי עם שני חלקים של סוכרוז 20% על מנת להפוך את מדיום ההקפאה עובד. תשאיר את זה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או יותר עד באוויר בועות להיעלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות המדיום מקפיא עובד ולאפשר איזון במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חתוך כל רשתית למלבנים (בערך 3 מ&quot;מ על 5 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את דגימות לתוך התקשורת מקפיא עובד הכלול מיכל גלילי (כ -1 ס&quot;מ רדיוס x 2 ס&quot;מ גובה) devised מרדיד אלומיניום. ודא פרוסות רשתית הם אנכיים (אוריינטציה לספק חתך של הרשתית על חתך) ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. שמור את אבני ב -80 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף כל בלוק על cryostat ל -14 מיקרומטר פרוסות עבות ו הר בסעיפים בשקופיות זכוכית. אחסן את השקופיות ב -80 ° C עד השימוש. </li></ol> 4. Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החלקים עם חיץ פוספט סוכרוז 5% (SPB, סוכרוז 5% ב PBS, pH 7.4) פעם. חסום את אתרי הקישור הלא ספציפית על ידי דוגרים סעיפים בחסימת המאגר (5% SPB עם 10% נסיוב עז נורמלי 0.5% Triton X-100) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הסעיפים (בשקופיות) עם הנוגדן הראשוני המתאים (GFAP או MAP2, מדולל ב 1: 500 בחסימת מאגר) במשך שעה 1. לשאוב את הפתרון. לשטוף שלוש פעמים ב 5% SPB. עבור מכתים את IgG אנדוגני, לדלג על שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה החלקה עם SECON המקבילנוגדנים dary (Cyanine3 / FITC IgG אנטי עכבר חמור מצומדות / נגד ארנב, מדולל ב 1: 800 במאגר חסימה) במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החלקים ביסודיות עם 5% SPB שלוש פעמים. להכין את דגימות במיקרוסקופ על ידי מקבע אותם ב הרכבה בינונית המכיל DAPI והתכסות coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal, ללכוד תמונות באמצעות עדשה 20X תחת פרמטרים זהים כגון עוצמת הלייזר, ערך רווח, להתעכב זמן, וכו &#39;בין הקבוצות. הגדר את אורכי גל עירור / פליטה עבור הערוץ הכחול (כדי לזהות DAPI) כמו 408/447 ננומטר, עבור במסלול האדום (כדי לזהות Cyanine3) כמו 561/785 ננומטר עבור המסלול הירוק (כדי לזהות FITC) כמו 488/525 ננומטר . </li></ol> ניתוח תמונה 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת אחוז כלי דם דולפים על פי הקריטריונים הבאים 12: כלול רק כלי דם עם גרעיני תא האנדותל בתוך מטוס סעיף במניין; לשקול דולפי כלי דם אם הוא מראה AGradient של immunostaining סביב הספינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את רמת הביטוי, לבחור אזורים של עניין ולמדוד את הערך האפור הממוצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את הרוחב של התהליך, לבחור שטח של המקטע שבו התהליכים מובחנים (השכבה החיצונית גרעינית, ONL, למשל). לאחר מכן בחר שדה אופטי שבו תהליכים אלו גלויים ורציפים. הגדר את סרגל קנה המידה בהתאם להגדרה המיקרוסקופית, למתוח קו על פני התהליך ולבצע את המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את ההמשכיות של תהליך, באזורים נבחרים של עניין, להחיל את המסנן נקרא השונות אשר משפר את הקצוות של התמונה על ידי החלפת כל פיקסל עם השונות בשכונה שלה, באופן אוטומטי את הניגודיות והבהירות, לספור את השורות לנרמל את הספירה על ידי אֵזוֹר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב משמעויות סטטיסטיות באמצעות -test t של סטודנט שני זנב. *, P &lt;0.05; **, P &lt;0.01; ***, P &lt;0.001. Pהרבה תוצאה כמו ממוצע ± SEM. </li></ol>

<ol>
	<li>Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-retinal+barrier.">Blood-retinal barrier.</a> J Ophthalmol. 21, 3 (2011).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-neural+barrier:+intercellular+communication+at+glio-vascular+interface.">Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface.</a> J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).</li><li>Kumagai, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+transport+in+brain+and+retina:+implications+in+the+management+and+complications+of+diabetes.">Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes.</a> Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).</li><li>Runkle, E. A., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-retinal+barrier:+structure+and+functional+significance.">The blood-retinal barrier: structure and functional significance.</a> Methods Molec Biol. 686, 133-148 (2011).</li><li>Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+glucose+across+the+blood-tissue+barriers.">Transport of glucose across the blood-tissue barriers.</a> Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).</li><li>Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+claudins+in+blood-tissue+barriers+under+physiological+and+pathological+states.">Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states.</a> Tissue Barriers. 1, 24782 (2013).</li><li>Patton, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+image+analysis:+concepts,+applications+and+potential.">Retinal image analysis: concepts, applications and potential.</a> Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).</li><li>Di Marco, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+dysfunction+in+the+pathogenesis+of+Alzheimer's+disease--A+review+of+endothelium-mediated+mechanisms+and+ensuing+vicious+circles.">Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles.</a> Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).</li><li>Nagele, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-reactive+autoantibodies+prevalent+in+human+sera+increase+intraneuronal+amyloid-beta(1-42)+deposition.">Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition.</a> J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).</li><li>Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+and+blood-brain+barrier+compromise:+A+mechanistic+link+between+vascular+disease+and+Alzheimer's+disease+subtypes+of+neurocognitive+disorders.">Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders.</a> J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10 (2015).</li><li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain.">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nat Photonics. 7, (2013).</li><li>Sedeyn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+Induces+Alzheimer's+Disease-Like+Blood+Brain+Barrier+Breach+and+Local+Cellular+Responses+in+Mouse+Brain+Organotypic+Cultures.">Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures.</a> Biomed Res Int. 2015, 937148 (2015).</li><li>Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W., Di, L., Kerns, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. , 188 (2014).</li><li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines,+hCMEC/D3,+hBMEC,+TY10,+and+BB19,+and+optimization+of+culture+conditions,+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies.">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10, 33 (2013).</li><li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+blood-brain+barrier+model+combining+shear+stress+and+endothelial+cell/astrocyte+co-culture.">An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture.</a> J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).</li><li>Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitate+transport+through+the+blood-retina+and+blood-brain+barrier+of+rat+visual+system+during+aging.">Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging.</a> Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).</li><li>Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilicity+and+transporter+influence+on+blood-retinal+barrier+permeability:+a+comparison+with+blood-brain+barrier+permeability.">Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability.</a> Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).</li><li>Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dehydroascorbic+acid+transport+across+the+rat+blood-retinal+and+-brain+barriers+in+experimental+diabetes.">Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes.</a> Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).</li><li>Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+pathology+and+blood-brain+barrier+disruption+in+cognitive+and+psychiatric+complications+of+type+2+diabetes+mellitus.">Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus.</a> Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202 (2011).</li><li>Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+retina+works+-+Much+of+the+construction+of+an+image+takes+place+in+the+retina+itself+through+the+use+of+specialized+neural+circuits.">How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits.</a> Am Sci. 91, 28-35 (2003).</li><li>Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pathology+as+biomarker+for+cognitive+impairment+and+Alzheimer's+disease.">Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease.</a> J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).</li><li>Tan, Z., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta,+the+retina,+and+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease.</a> Am J Pathol. 176, 2055 (2010).</li><li>Serhan, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-resolving+lipid+mediators+are+leads+for+resolution+physiology.">Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology.</a> Nature. 510, 92-101 (2014).</li><li>Bucolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+topical+indomethacin,+bromfenac+and+nepafenac+on+lipopolysaccharide-induced+ocular+inflammation.">Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation.</a> J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).</li><li>Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosteroids+inhibit+VEGF-induced+vascular+leakage+in+a+rabbit+model+of+blood-retinal+and+blood-aqueous+barrier+breakdown.">Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown.</a> Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 &#176;C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -...

גוף גדל והולך של ראיות תומכת בקיומו של מחסום דם ברשתית (BRB) 1-5 ואת הדמיון שלה אל מחסום דם מוח (BBB) ​​6,7. הפשרה של BBB נקשר בחוזקה סיבתי או כסמן אבחון מחלות ניווניות כרוניות כמו מחלת אלצהיימר (AD) 8,9 ו מצבים חריפים כגון הזיות 10. תובנות מכניסטית לתוך פתולוגיות ותגליות אלה עבור מטרות תרופה פוטנציאל הם הקשו בדרך כלל על ידי מורכבות נגישות מוגבלת לרשת של המוח. חלופות כגון in vivo הדמיה 11, המוח organotypic תרבות 12, בתרביות תאים ראשוניים 13,14 ומערכות שיתוף התרבות 15 נוצרו. עם זאת, רוב המודלים האלה דורשים מכשירים מיוחדים, תקופות ניסוי ארוכות או סמנים מרובים כדי לזהות תאים. דמיון פונקציונלי מבני בין BBB ו BRB וכן מתאם בין dysfunctions של שני היה לטעון 16-19. בנוסף, גישה קלה יותר, סוגי תאים מוגדרים היטב שכבתי מבנה אפשרו הרשתית היטב מאופיינת כחלון למוח. הזהויות המבניות ותפקודיות של BBB ו BRB להישאר להיות לעומת בפירוט. עם זאת, פתולוגיות רשתית, במיוחד הפרת BRB, גם נקשרו בחוזקה עם ההתקדמות של מחלות שונות, כולל סוכרת 18-19 לספירה 21,22. לכן, זה עניין להקים מערכת תפקוד BRB לא רק להתוות את המנגנון אלא גם להקרין תרופות פוטנציאליות. בדו&quot;ח זה, תפקוד לקוי פרוטוקול המאפשר BRB באמצעות תרבות ברשתית חריפה פשוט מפותח והציג. חדירות BBB מוגברות שינויים פתולוגיים דמוית לספירה הוקמו תרבות המוח organotypic מודגרות עם היסטמין, מתווך פרו-דלקתי 12. לכן, במערכת הציגה, היסטמין היה Applמטען לתרבות רשתית vivo לשעבר כדי לגרום בעיות בתפקוד BRB. רשתיות מכמה מינים, כגון musculus Mus ו Bos Taurus, נבדקו. בשל זמינויות הדמיון המסחריות שלהם רקמה אנושית, נוצלו עיני חזירים טריות לספק את הנתונים המדווחים כאן. לאחר דוגרים עם היסטמין ו / או תרופות אחרות, את הרשתיות עובדו להערכה על ידי immunostaining במשך כמה חלבונים 12, כגון אימונוגלובולין G (IgG), אחד המרכיבים העיקריים של דם; גליה fibrillary חלבון חומצי (GFAP), סמן ידוע עבור הפעלת גליה; ו-הקשורים microtubule חלבון 2 (MAP2), חלבון cytoskeletal ספציפי נוירון חיוני להרכבה microtubule. יתר על כן, במודל השכבות של הרשתית מאפשר ניתוח מפורט של התהליכים של תאי מולר ותאי גנגליון, כגון שינויי הרוחב וההמשכיות שלהם. כך מספר פרמטרים נוספים זמינים להעריך את ההשלכות שלBRB הפרה בשלב מוקדם כדי להעריך את השפעות ההיפוך של טיפולים פוטנציאליים וכן. בפרוטוקול זה, תופעות היפוך הפוטנציאל של תרופות הוקרן מוערכים משלושה היבטים: דליפה של כלי הדם (BVS), הפעלת תאי גלייה והתגובה-נזק של תאים עצביים. כמה שיטות כימותים מנוצלות, למשל, את רמת הביטוי שמוצגת על ידי עוצמת immunostaining, מדידת רוחב של תהליך ורציפות תהליכים עצביים שמוצגים על ידי מסנן שיפור. כדי להמחיש את השיטה טובה יותר וכדי לסייע לפרש את התוצאות, lipoxin A4 (LXA4), תרכובת המסונתזת באופן אנדוגני בתגובה לפציעה דלקתית הפחתה בתפקוד האנדותל 23, נבחר למטרות הדגמה.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>J.T.Baker</td><td>4072-05</td><td></td></tr><tr><td>Histamine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7125-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Freezing Media&amp;nbsp;</td><td>Triangle Biomedical Sciences</td><td>TFM-5</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum&amp;nbsp;</td><td>Rockland</td><td>D104-00-0050</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>GFAP Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5804</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>mounting medium containing DAPI</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Laser Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti microscope</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.45s</td><td></td></tr></tbody></table>

an acute retinal model for evaluating blood retinal barrier breach and potential drugs for treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

אנו מציגים מערכת בעלות נמוכה, זמן יעיל וקל לשימוש להעריך טיפולים פוטנציאל שיכול להגן מפני הפרת BRB המושרה על ידי היסטמין. IgG הוא מוגבל בתוך הכלי ברשתית ביקורת (איור 1 א), אך הדלפות מתוך כלי הדם בחשיפת היסטמין (איור 1B), המאשר כי המודל הוק...

Watch this Scientific Journal Video about An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment at JoVE.com

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

מערכת בעלות נמוכה, קלה לשימוש וחזק הוא הוקם כדי להעריך טיפולים פוטנציאל שיכול לשפר הפרת מחסום דם ברשתית המושרית על ידי היסטמין. דליפת כלי דם, הפעלת תא מולר ואת ההמשכיות של תהליכים עצביים מנוצלות כדי להעריך את תגובת הניזק והיפוכו עם תרופה פוטנציאלית, A4 lipoxin.

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

an-acute-retinal-model-for-evaluating-blood-retinal-barrier-breach

Research

JoVE Journal

Medicine

7.1K Views.  Rowan University.  מערכת בעלות נמוכה, קלה לשימוש וחזק הוא הוקם כדי להעריך טיפולים פוטנציאל שיכול לשפר הפרת מחסום דם ברשתית המושרית על ידי היסטמין. דליפת כלי דם, הפעלת תא מולר ואת ההמשכיות של תהליכים עצביים מנוצלות כדי להעריך את תגובת הניזק והיפוכו עם תרופה פו...

Video: An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Neuroscience

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

מודל עכברים של שיבוש מחסום דם מוח כדי לאפשר ממוקד Therapeutics Neurovascular

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

יצירת ניוון רשתית כדי לחקור אסטרטגיות תיקון תאים בקסנופוס

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair recently emerged as particularly appealing. A cellular source of interest for retinal repair is the M&#252;ller glial cell, which harbors stem cell potential and an extraordinary regenerative capacity in anamniotes. This potential is, however, very limited in mammals. Studying the molecular mechanisms underlying retinal regeneration in animal models with regenerative capabilities should provide insights into how to unlock the latent ability of mammalian M&#252;ller cells to regenerate the retina. This is a key step for the development of therapeutic strategies in regenerative medicine. To this aim, we developed several retinal injury paradigms in Xenopus: a mechanical retinal injury, a transgenic line allowing for nitroreductase-mediated photoreceptor conditional ablation, a retinitis pigmentosa model based on CRISPR/Cas9-mediated rhodopsin knockout, and a cytotoxic model driven by intraocular CoCl2 injections. Highlighting their advantages and disadvantages, we describe here this series of protocols that generate various degenerative conditions and allow the study of retinal regeneration in Xenopus.

מחבר זרקור: חקר מנגנוני התחדשות הרשתית בצפרדע הקסנופוס 

We have developed several protocols to induce retinal damage or retinal degeneration in Xenopus laevis tadpoles. These models offer the possibility of studying retinal regeneration mechanisms.

יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

Developmental Biology

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, diabetic retinopathy, and retinal vascular occlusions. Rodent models of I/R injury are providing significant insights into mechanisms and treatment strategies for human I/R injury, especially with regard to neurodegenerative damage in the retinal neurovascular unit. Presented here is a protocol for inducing retinal I/R injury in mice through elevation of intraocular pressure (IOP). In this protocol, the ocular anterior chamber is cannulated with a needle, through which flows the drip of an elevated saline reservoir. Using this drip to raise IOP above systolic arterial blood pressure, a practitioner temporarily halts inner retinal blood flow (ischemia). When circulation is reinstated (reperfusion) by removal of the cannula, severe cellular damage ensues, resulting ultimately in retinal neurodegeneration. Recent studies demonstrate inflammation, vascular permeability, and capillary degeneration as additional elements of this model. Compared to alternative retinal I/R methodologies, such as retinal arterial ligation, retinal I/R injury by elevated IOP offers advantages in its&#160;anatomical specificity, experimental tractability, and technical accessibility, presenting itself as a valuable tool for examining neuronal pathogenesis and therapy in the retinal neurovascular unit.

This article describes a procedure for inducing retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure in mice. Retinal ischemia-reperfusion injury by elevated intraocular pressure serves to model human pathologies characterized by compromised oxygen and nutrient delivery in the retina, enabling researchers to examine potential cellular mechanisms and treatments for human diseases of the retinal neurovascular unit.

במודל עכבר של רשתית איסכמיה reperfusion נזק ע&quot;י העלאת רמת הלחץ התוך עיני

Retinal ischemia-reperfusion (I/R) is a pathophysiological process contributing to cellular damage in multiple ocular conditions, including glaucoma, ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo קריאות פגיעה בכלי דם ברשתית העכבר כדי לקדם את יכולת השחזור

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Retinal Pathophysiological Evaluation in a Rat Model

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal detachment, breakdown of the blood-retinal barrier (BRB), and retinal angiogenesis. An in vivo rat model is a valuable experimental tool to examine the changes in the structure and function of the retina. We propose three different experimental techniques in the rat model to identify morphological changes of retinal cells, retinal vasculature, and compromised BRB. Retinal histology is used to study the morphology of various retinal cells. Also, quantitative measurement is performed by retinal cell count and thickness measurement of different retinal layers. A BRB breakdown assay is used to determine the leakage of extraocular proteins from the plasma to vitreous tissue due to the breakdown of BRB. Fluorescence angiography is used to study angiogenesis and leakage of blood vessels by visualizing retinal vasculature using FITC-dextran dye.

Diabetic retinopathy is one of the leading causes of blindness. Histology, blood-retinal barrier breakdown assay, and fluorescence angiography are valuable techniques to understand the pathophysiology of the retina, which could further enhance the efficient drug screening against diabetic retinopathy.

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

A posterior segment eye disease like diabetic retinopathy alters the physiology of the retina. Diabetic retinopathy is characterized by a retinal ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל In vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

מודל עכברים של שיבוש מחסום דם מוח כדי לאפשר ממוקד Therapeutics Neurovascular

שימוש בנגיף Adeno הקשורים ככלי לחקר חסמי רשתית במחלה

יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס

יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס

יצירת מודלים של פגיעות רשתית בראשנים של קסנופוס

במודל עכבר של רשתית איסכמיה reperfusion נזק ע"י העלאת רמת הלחץ התוך עיני

In vivo קריאות פגיעה בכלי דם ברשתית העכבר כדי לקדם את יכולת השחזור

הערכה פתופיפיזיולוגית של רשתית במודל חולדה

בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל In vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם