המחברים מודים מאוד לבוב פישר (LV, DIR, NIAID, NIH), שפעל כקריין, כמו גם אוסטין Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) ומייגן מורגן (DOHS, ORS, OD, NIH) ל העזרה שלהם עם מה שהופך את הסרט מלווה את כתב היד הזה. יתר על כן, ברצוננו להודות לאליסון Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) לקריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי תכנית מחקר ביצוע עצמי של NIH, NIAID.

.1 פיצול של תאי הפקה להפקה ראשונית של trVLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני וממחוברות 80-90% 293 תאים בתרבית ב75 סנטימטר 2 צלוחיות במדיום גבוה של גלוקוז השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) עם סרום 10% שור עוברי (FBS), L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, ו1x העט / סטרפטוקוקוס (DMEM10 ). שטוף תאי פעמיים עם 10 שנאגר מלוח פוספט מ&quot;ל (PBS), נזהר שלא לעקור את התאים, ולהוסיף 2 מ&quot;ל טריפסין-EDTA לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בטמפרטורת חדר עד תאים להראות עיגול משמעותי כאשר נצפו תחת מיקרוסקופ (כ 30 שניות). לסלק תאים על ידי הקשה בקבוק, ולהוסיף 8 מ&quot;ל DMEM10. ביסודיות resuspend התאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה עד שהשעית תא בודדת הוא ציין כאשר צפו מתחת למיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות דלפק תא אוטומטי. לדלל תאים ל2 x 10 5 תאים לכל מ&quot;ל בDMEM10. פיפטה 2 מ&quot;ל של השעיה תא לכל גם ל6 גם צלחות (4 x 105 תאים לכל טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות בתרבית רקמת חממת humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol> .2 Transfection של תאים מפיק עבור ייצור ראשוני של trVLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר פיצול התאים (ראה איור 5 לסקירה של עיתוי הניסוי), פלסמיד דנ&quot;א פיפטה 15 (בסכומים ראה טבלה 1) ל2 מ&quot;ל סטרילי cryovial באמצעות טיפים מסוננים. הוסף 100 OptiMEM μl בכל טוב לDNA. מערבולת התערובת בקצרה ובעדינות לסובב את הצינורות באמצעות microfuge. אם כמה בארות יש transfected עם פלסמידים זהים, mastermix במשך כמה בארות יכול להתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת הבקבוקון עם טרנזיט LT1 לפני השימוש. הוספת 7.5 μl Transit LT1 לכל גם לDNA המדולל. בעדינות מערבולת התערובת, נזהרת שלא לאסוף נוזל במכסה של cryovial, ודגירה של 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבב את transfectionמורכב על ידי pipetting למעלה ולמטה. הוספה של מתחמי transfection 100 μl dropwise היטב כל אחד. רוק הצלחת קדימה / אחורה ומצד אל צד כדי לפזר את מתחמי transfection. אל מערבולת הצלחת כמו זה תגרום אחיד הפצה של מתחמי transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את התאים לחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות, להסיר את supernatant מהתאים. להוסיף DMEM 4 מ&quot;ל עם 5% FBS, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 1x העט / סטרפטוקוקוס (DMEM5) לתאים. צעד זה יכול להיעשות לתקופה של עד 3 בארות בכל פעם ללא ייבוש של הבארות, בהנחת הבארות להכיל דגימות זהות (אחרות, בשל אופי הגברה העצמית של trVLPs במערכת זו, זיהום צולב יכול להיות בעיה ו צעד זה צריך להיעשות גם אחד בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את התאים לחממה. </li></ol> .3 הכנת תאי יעד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול 293 תאים כאמור בסעיף 1, זריעת 4 x 10 5 תאים ב2 מ&quot;ל DMEM10 לכל טוב שלצלחת 6 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר הפיצול של תאי המטרה ו24 שעות לפני הזיהום, תאי מטרת transfect כפי שתואר בסעיף 2 באמצעות DNA מסתכמים בטבלה 1, ו4.5 μl Transit LT1 לכל טוב. </li></ol> .4 זיהום של תאי יעד וקציר של תאי הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את supernatants מתאי המפיק 15 צינורות מ&quot;ל. להסיר ולסלק כל supernatant שנותר בצינור ואקום. הוסף 250 μl חיץ תמוגה Glo לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant צנטריפוגה במשך 5 דקות בטמפרטורת XG וחדר 800 כדי לנקות את דוגמאות של פסולת הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מכן אחד מתאי המטרה. בזהירות להוסיף 3 מ&quot;ל של supernatant תא המפיק פינה למקד תאים באמצעות מהירות פיפטה האיטית ביותר. הימנע pipetting ישירות על התאים על מנת למנוע שיבוש monolayer התא. צעד זה צריך להיעשות גם אחד בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל הדגימות היו טרנסמועדף עליכם, להחזיר את תאי המטרה לחממה כדי לאפשר שקיעה של trVLPs וזיהום של תאי מטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15 דקות של דגירה בטמפרטורת חדר במאגר תמוגה Glo, resuspend תאי המפיק במאגר תמוגה באמצעות micropipette מוגדר 150 μl, ולהעביר את הדגימה לתוך 2 מ&quot;ל cryovial. בשלב זה, אפשר להקפיא lysates ב -80 מעלות צלזיוס, או ישירות נמדד כמפורט בסעיף 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר הדבקה, להסיר את supernatant מתאי המטרה. הוסף 4 מ&quot;ל לDMEM5 גם לתאים. צעד זה יכול להיעשות לתקופה של עד שלוש בארות בכל פעם, אם הבארות להכיל דגימות זהות (אחרת, בשל אופי הגברה העצמית של trVLPs במערכת זו, זיהום צולב יכול להיות בעיה, וצעד זה צריך להיות עשה גם אחד בכל פעם). </li></ol> .5 קציר של תאי יעד לזיהום מחזור אחד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם רק מחזור זיהומיות יחיד יש להעריך, ב72 שעות לאחר t להסיר זיהוםהוא supernatant מתאי המטרה באמצעות צינור ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים ב250 μl חיץ תמוגה Glo כאמור בסעיף 4 לתאי יצרן. </li></ol> .6 תאים וPassaging הרציף של trVLPs הקציר של היעד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם trVLPs יש passaged ברציפות, להכין סט חדש של תאי המטרה כאמור בסעיף 3, כך שהם מוכנים לזיהום 72 שעות לאחר ההדבקה של הסט הראשון של תאי מטרה (ראה איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק הקבוצה החדשה של תאי המטרה כאמור בסעיף 4 (באמצעות הסט הראשון של תאי מטרה במקום של תאי היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים אלה בכל שעה 72. </li></ol> .7 ניתוח של פעילות Reporter <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם lysates התא הוקפא, להפשיר אותם בטמפרטורת חדר. ודא שדגימות הגיעו טמפרטורת חדר לפני המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הסכום הנדרש (40 μl לדגימה) של חיץ assay Renilla Glo (i קפואה באופן אידיאליaliquots n) בטמפרטורת חדר. ודא שהחיץ הגיע טמפרטורת חדר לפני המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1/100 נפח ה של מצע Renilla Glo למאגר assay Renilla Glo להשיג מגיב Renilla Glo, ומערבבים על ידי vortexing. פיפטה 40 μl של מגיב Renilla Glo לתוך צלחת 96 היטב לבנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של מדגם למגיב Renilla-Glo. חכה 10 דקות, ולאחר מכן למדוד את הדגימות בluminometer באמצעות זמן אינטגרציה של 1 שניות. </li></ol>

<ol>
	<li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+perceived+threat+differences+posed+by+filovirus+variants.">Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants.</a> Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).</li><li>Falzarano, D., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+leap+ahead+in+filovirus+therapeutics.">Possible leap ahead in filovirus therapeutics.</a> Cell research. , (2014).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+ebola+vaccines.">Current ebola vaccines.</a> Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).</li><li>Beniac, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organisation+of+ebola+virus+reveals+a+capacity+for+extensive,+modular+polyploidy.">The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy.</a> PloS one. 7, e29608 (2012).</li><li>Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L., Enna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13,+Unit+13B+13,+High-throughput+screening+of+viral+entry+inhibitors+using+pseudotyped+virus.">Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus.</a> Current protocols in pharmacology. , (2010).</li><li>Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forward+genetic+strategy+reveals+destabilizing+mutations+in+the+Ebolavirus+glycoprotein+that+alter+its+protease+dependence+during+cell+entry.">A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry.</a> J Virol. 84, 163-175 (2010).</li><li>Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+transcription+and+replication+strategies+of+marburg+virus+and+Ebola+virus+by+using+artificial+replication+systems.">Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems.</a> J Virol. 73, 2333-2342 (1999).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minigenomes,+transcription+and+replication+competent+virus-like+particles+and+beyond:+reverse+genetics+systems+for+filoviruses+and+other+negative+stranded+hemorrhagic+fever+viruses.">Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses.</a> Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).</li><li>Hoenen, T., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+systems+as+tools+for+the+development+of+novel+therapies+against+filoviruses.">Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses.</a> Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+naive+target+cells+with+virus-like+particles:+implications+for+the+function+of+ebola+virus+VP24.">Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24.</a> J Virol. 80, 7260-7264 (2006).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+novel+ebola+virus-like+particles+from+cDNAs:+an+alternative+to+ebola+virus+generation+by+reverse+genetics.">Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics.</a> J Virol. 78, 999-1005 (2004).</li><li>Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+matrix+proteins+of+Ebola+virus+contribute+to+the+regulation+of+viral+genome+replication+and+transcription.">Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription.</a> Virology. 403, 56-66 (2010).</li><li>Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+(EBOV)+VP24+inhibits+transcription+and+replication+of+the+EBOV+genome.">Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome.</a> J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).</li><li>Spiegelberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genus-specific+recruitment+of+filovirus+ribonucleoprotein+complexes+into+budding+particles.">Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles.</a> J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).</li><li>Watt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lifecycle+modeling+system+for+Ebola+virus+shows+a+genome+length-dependent+role+of+VP24+on+virus+infectivity.">A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity.</a> J Virol. , (2014).</li><li>Kondratowicz, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+immunoglobulin+and+mucin+domain+1+(TIM-1)+is+a+receptor+for+Zaire+Ebolavirus+and+Lake+Victoria+Marburgvirus.">T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals.">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> J Virol. 86, 11779-11788 (2012).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Assay trVLP tetracistronic המתואר בכתב היד הזה מאפשר מידול של מחזור החיים של נגיף האבולה על פני מספר מחזורי זיהומיות. חשוב לציין, trVLPs הופק במערכת זו אינה מכיל מידע הגנטי לחלבונים nucleocapsid NP, VP35, VP30, וL, שיחד מרכיבים כמעט 60% מהגנום נגיף האבולה וחיוניים לשכפול נגיף. במקום זאת, חלבונים אלה צריכים להיות מסופקים בתאי המטרה בטראנס מפלסמידים ביטוי, וכל זיהום של תאים לא מבטאים את כל 4 של חלבונים אלה הוא כושל. חשוב לציין, שאין כל ראיות של רקומבינציה הגנטית לfiloviruses, ואין אזורים הומולוגיים המשותפים בין minigenome tetracistronic ופלסמידים הביטוי לחלבוני nucleocapsid. לכן, אין לא שום ראיות מעשיות ולא כל בסיס תיאורטי שיכול לספק לאפשרות של הגנום נגיף האבולה באורך מלא שהניבו שלאחר מכן עלול לגרוםהייצור של נגיפי אבולה זיהומיות, מה שהופך את מערכת זו בטוחה לשימוש בתנאי BSL2. ישנם שני שלבים קריטיים בassay trVLP tetracistronic שמושפעים מהתנאים ניסוי, כלומר הייצור של trVLPs, והזיהום של תאי יעד עם trVLPs אלה. ייצור של trVLPs תלוי ברמות גבוהות של שכפול minigenome ושעתוק, אשר בתורו תלוי ביעילות transfection גבוהה. יעילות transfection ניתן להעריך בקלות על ידי הכללת שליטת ס, שבו פלסמיד ביטוי לL מוחלף פלסמיד ביטוי קידוד eGFP. שיעורי transfection בתנאים אלה יעלה 50% על ידי בדיקה עם ההודעה transfection 24 שעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יתר על כן, תאים צריכים להיות חופשי של mycoplasma, שכן בזיהום mycoplasma הניסיון שלנו באופן דרמטי פוגע שכפול ושעתוק (נתונים שלא פורסמו) minigenome. בשל ce הגבוה transfectability 293LLS הוא הקו הסלולרי של בחירה עבור מבחני trVLP; עם זאת, תאים אלה הם יחסית גרועים רגישים (אם כי לא שבירה לחלוטין) לזיהום בנגיף האבולה 16. ביטוי של גורם מצורף כגון טים-1 משפר את הזיהום של 293 תאים עם trVLPs על פי 100, והוא חיוני להצלחתה של מערכת זו על פני מספר קטעים. בעוד trVLPs tetracistronic אינו משכפל את עצמו בכוחות עצמם, הם משכפלים את עוצמה בתאים המבטאים את חלבוני nucleocapsid. ככזה, אמצעי זהירות צריכה להיעשות כדי להימנע מצלב זיהומים בין בארות המכילות trVLPs שונה (לדוגמא, עם מוטציות שונות בminigenome). מבחינה טכנית יותר, בשל ההבדל הגדול בין אותות חיוביים ושליליים בassay זה (כ 4 יומנים), הצטלבות בין דגימות בעת מדידת פעילות לוציפראז יכול להיות בעיה; עם זאת, ניתן להימנע מזה בקלות על ידי השארה גם אחד ריק בין כל דגימה בצלחת 96 היטב המשמשת למדידת פעילות לוציפראז. יש שפע של יישומים אפשריים לtrVLPs tetracistronic. ברור, הם גם מתאימים ללימוד הכניסה של חלקיקי filovirus, שכן יש לי trVLPs זיהומיות המבנה דמוי חוט האופייני filoviruses זיהומיות 14, ומכיל את אותם רכיבים נגיפיים כמו חלקיקי filovirus. חשוב לציין, שהם לא מכילים רכיבים של וירוסים אחרים, כמו במקרה בעת שימוש virions Pseudotyped או חלקיקים כמו וירוס, כמו חלקיקי רטרווירוס נושא GP 1,2, או וירוסי רקומביננטי, כגון וירוס stomatitis שלפוחי רקומביננטי להביע GP 1,2 . הדרישה לגורמי קובץ מצורף בעת שימוש 293 תאים כמו תאי יעד במערכת זו ניתן לנצל כדי מסך וללחקור את תפקידם של גורמי עיקול, ואילו התפקידים של גורמים סלולריים אחרים, כגון אלה העוסקים בשכפול הגנום ושעתוק, כמו גם המורפוגנזה וניצןדינג, ניתן לחקור באמצעות טכנולוגיית RNAi. ההשפעה של מוטציות בחלבונים נגיפיים על מחזור החיים של הנגיף גם ניתן ללמוד, אם כי אחד יש לזכור כי בעוד VP40, GP 1,2, וVP24 באים לידי ביטוי לאחר שעתוק נגיפי, ביטוי של החלבונים הנגיפיים האחרים מושגת מביטוי פלסמידים, כך שהשפעות עקב ביטוי היתר של חלבונים אלה צריכים להילקח בחשבון. כמו כן, יש להקפיד כי מוטציות בminigenome אינן משנות באופן משמעותי את אורכו של minigenome, מאז פעילות כתב מושפעת ישירות minigenome אורך 15. לבסוף, מאז minigenomes tetracistronic הם אנלוגים הגנום הויראלי שנושאים גנים נגיפיים, ומשוכפלים על ידי מורכב פולימראז הנגיפי, זה צריך להיות אפשרי גם בחקר האבולוציה של גנים אלה בתגובה למוטציות בתנאי BSL2. וכך, בעוד מחקרים נוספים עדיין נדרשים בכיוון זה, זה צריך להיות אפשרי, למשל, להציג את הכי מוצלחמוטציות בגנים בתוך trVLPs מעבר minigenome ומאז ועד מוטציות חינם לצוץ. מגבלה אחת של assay trVLP tetracistronic שיש לזכור היא העובדה כי בזמן שהוא המודלים ביותר במחזור החיים של הנגיף, שעתוק עיקרי בתאי מטרה הוא לא דגם ידי מערכת זו, שכן תאי יעד צריכים לבטא חלבוני nucleocapsid בטראנס על מנת שtrVLPs לשכפל. אם תעתיק ראשוני יש להעריך, ניתן להשתמש בתאי יעד נאיביים 10; עם זאת, במקרה זה אין שכפול הגנום מתרחש בתאי מטרה, ולא trVLPs זיהומיות נוספת מיוצר, להפיל את הזיהום. זו בעיה העיקרית שלא ניתן להתגבר עליהן בלי טיוח trVLPs לחלוטין משכפל את עצמו, על ידי הכללת גנים לחלבוני nucleocapsid לminigenome, אשר יהפוך אותם דה פקטו לוירוסי אבולה רקומביננטי זיהומיות. למעשה, Ebolוירוסים להביע לוציפראז או כתבים אחרים שנוצרו ויכול להיות מנוצל כדי להעריך וללמוד שכפול הגנום ושעתוק 17,18; עם זאת, השימוש בם מוגבל למעבדות BSL4. כמו כן, יש בו כדי לזכור כי בעוד VP40, GP 1,2, וVP24 באים לידי ביטוי מאנלוגי הגנום נגיפי, עמדתם בminigenome (2 nd, 3 rd, ו4 th יחידת תעתיק) אינו זהה ל את עמדתם בגנום הנגיפי (3 rd, 4 th, ויחידת תעתיק 6 th), אשר יכול להשפיע על רמותיהם מוחלטות הביטוי, כמו גם רמות הביטוי היחסית שלהם עם כבוד אחד לשני. בסך הכל, assay trVLP tetracistronic מייצג את מערכת המודלים מחזור חיים המקיפה ביותר לאיתור וירוסי אבולה זמין עד כה, ומאפשר מודלים של שכפול הגנום ושעתוק, המורפוגנזה חלקיקים וניצנים, וכן התקשרות וenלנסות לתאי מטרה על מחזורי זיהומיות מרובים. ככזה, יש לו פוטנציאל עצום לשימוש בחקירת הביולוגיה של וירוסי אבולה בתנאי BSL2.

וירוסי האבולה הם הסוכן סיבתי של קדחת מדממת חמורה בבני אדם ופרימטים שאינם בני אדם עם שיעורי תמותה של עד 90% בהתפרצויות אנושיות 1. אמנם יש כבר התקדמות משמעותית בשנים האחרונות בפיתוח חיסונים, כמו גם טיפולים ספציפיים (בדיקה ב 2,3), אלה אינם מאושרים לשימוש בבני אדם. יש לי חלקיקי נגיף האבולה מראה אופייני דמוי חוט באורך של כ 1 מיקרומטר וקוטר של 96 עד 98 4 ננומטר. צורות nucleocapsid הליבה של החלקיקים הנגיפיים והוא מורכבת מ1) הגנום שאינו מפולח חד גדילים שלילי תחושת RNA, המקודד את הגנים 7 ebolavirus (, 2) nucleoprotein NP, שencapsidates הגנום איור 1), 3 ) המורכב הנגיפי פולימראז בהיקף של L פולימראז וVP35 cofactor, ו4) VP30 activator תעתיק. בנוסף, זה לאחרונה הראה כי VP24 החלבון קשור גם nucleocapsidשל 4. Nucleocapsid מוקף בחלל המטריצה ​​שבה חלבון מטריקס VP40, האחראית על המורפוגנזה וניצנים של virions, ממוקם. חלקיקי נגיף עטופים נוספים, ומשובץ במעטפה שהוא החלבון היחיד משטח GP 1,2, האחראית על קובץ מצורף virion וכניסה. עבודה עם וירוסי אבולה זיהומיות חייבת להתבצע במעבדה בלימה מקסימלי ברמת בטיחות ביולוגית (מנהלת הליגה) 4 תנאים, המגבילה את העבודה הזאת לכמה מתקנים ברחבי העולם. על מנת ללמוד את הביולוגיה של וירוסים אלה או לפתח תרופות חדשניות בתנאי BSL2, חוקרים מסתמכים גם על ביטוי יתר של חלבוני רקומביננטי וירוס האבולה, או במערכות דוגמנות מחזור חיים, אשר שניהם יכולים להיות עבדו עם בהעדר וירוס האבולה זיהומיות. ביטוי רקומביננטי של חלבוני נגיף האבולה מושגת גם מפלסמידים ביטוי או וקטורים ויראליים. מקרה מיוחד של אסטרטגיה זו הואדור של virions או חלקיקים כמו וירוס המבוסס על וירוסים אחרים מאשר וירוסי אבולה (הנפוץ ביותר רטרווירוסים או stomatitis לפוחי וירוס) בנוכחות recombinantly הביע GP 1,2, שהוביל לדור של חלקיקי Pseudotyped, אשר יכול לשמש כדי לחקור תהליך כניסה של filoviruses ומסך למעכבי כניסה 5. לחלופין, וירוסי רקומביננטי (למשל, וירוס stomatitis שלפוחי) המקודדים את נגיף האבולה GP 1,2 במקום גליקופרוטאין שלהם יכולים להיות שנוצרו ומשמשים ללמוד כניסת וירוסים תחת רמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים 6. מערכות דוגמנות מחזור החיים הן צורות של מערכות גנטיקה הפוכה המציגות את השימוש באנלוגים יקוצצו הגנום נגיף האבולה (minigenomes), אשר בתחילה מיוצרים מcDNA ולאחר מכן משוכפלת ומשועתקת על ידי חלבוני נגיף האבולה סיפקו בטראנס. מערכת minigenome הראשונה לוירוס האבולה פותחה לפני יותר מ -15 שנים 7, ומאז נעשה שימוש כדי ללמוד שכפול הגנום נגיף האבולה ושעתוק (הנסקרת ב 8,9). במערכת זו minigenome monocistronic בהיקף של גן כתב אחד מוקף אזורי קידוד שאינו המסוף של גנום נגיף האבולה (שנקרא מנהיג וקרוון) (איור 1) בא לידי ביטוי בתאי יונקים (בדרך כלל על ידי שעתוק באמצעות RNA פולימראז T7) יחד עם החלבונים הנגיפיים L, VP35, VP30 וNP. Minigenome הוא encapsidated ידי NP, ולאחר מכן משוכפל ומשועתק על ידי חלבוני nucleocapsid האחרים באמצעות אותות cis-משחק מקומי במנהיג והקרוון, שמוביל לפעילות כתב שמשקף שני היבטים של מחזור החיים של הנגיף (איור 2) אלה. על מנת לבנות מודל צעדים נוספים של מחזור החיים, השעתוק הנגיפי ושכפול-מוסמך חלקיק כמו וירוס-מערכות (trVLP) פותחו, המבוססים על מערכות minigenome קלאסיות, אבל כולליםביטוי dditional של החלבונים הנגיפיים האחרים VP24, VP40 וGP 1,2 מפלסמידים ביטוי 10,11. הנוכחות של VP40 מובילה להיווצרות של trVLPs, אשר נושאת GP 1,2 על פני השטח שלהם, ולבצע nucleocapsid המכיל minigenome בחלק הפנימי. trVLPs אלה יכולים לשמש כדי להדביק תאי מטרה, שגם היה pretransfected עם פלסמידים ביטוי לL, VP35, VP30 וNP, כדי להקל על שכפול ושעתוק של minigenomes הביא לתאי היעד בתוך 11 trVLPs, או שהם תאי מטרה נאיביים (כלומר ללא הבעה מונע פלסמיד של חלבוני נגיף האבולה) 10. כתוצאה מכך פעילות כתב בתאי מטרה, המשקפת את השכפול של minigenomes בתאי מפיק, המורפוגנזה והניצנים של trVLPs, כניסתם לתאי מטרה, ו1) במקרה של תאי מטרת pretransfected גם הגנום שכפול ושעתוק המשני ( כלומר שעתוק על ידי לדרבן חלבונים נגיפייםuced בתאי מטרה) בתאי מטרה, או 2) במקרה של תאי יעד נאיביים גם שעתוק ראשוני (כלומר שעתוק על ידי חלבונים נגיפיים הביאו לתאי יעד בתוך trVLPs) (איור 3). חשוב לציין, מערכות אלה היו בשימוש רק למודל מחזור זיהומיות יחיד, ומסתמך על ביטוי יתר של כל חלבונים הנגיפיים, אשר במקרה של VP24 וVP40 הוא בעייתי במיוחד, שכן חלבונים אלה הוכחו להיות רגולטורים שליליים חזקים של שכפול הגנום ושעתוק כאשר ביטוי יתר מפלסמידים 12,13. יתר על כן, הכנות trVLP מיוצרות במערכות אלה מכילים אחוז גבוה של חלקיקים שאינם מדבקים, שהתחזו אתגרים לאנליזה ביוכימית של trVLPs זיהומיות 14. כדי להתגבר על בעיות אלה, יש לנו לאחרונה פיתחו מערכת minigenome tetracistronic ש, בנוסף לגן כתב, מכילה גם את הגנים מקודדים לVP40, GP 1,2 וVP24 (איור 1). בדומה למערכת minigenome monocistronic הקלסית, מערכת זו מובילה לייצור של trVLPs שיכול להדביק תאי מטרה (איור 4) 15. עם זאת, בניגוד למערכת minigenome הקלסית, VP40, GP 1,2, וVP24 מיוצרים לאחר שעתוק הגנום הויראלי במקום להיות ביטוי יתר מפלסמידים. כתוצאה מכך, קינטיקה ורמות הביטוי של חלבונים אלה לחקות הרבה יותר הדוקים אלה שנמצאו במהלך מחזור החיים הנגיפיים, וכתוצאה מכך היחס של זיהומיות לtrVLPs שאינו מדבק הוא גדל על 500 פי במערכת זו 15. יתר על כן, באמצעות מערכת זו ניתן הייתה ברציפות מעבר trVLPs המכיל minigenome tetracistronic, דוגמנות מחזורי זיהומיות מרובות. ככזה, trVLPs tetracistronic כרגע מערכת דוגמנות מחזור החיים המקיפה ביותר זמינה ללמוד ביולוגיה נגיף האבולה בתנאי BSL2. כאן, אנו מספקים מידע מפורט על o השימושf מערכת זו, כמו גם על תוצאות צפויות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">75cm2 cell culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">430641</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D6546</td>
			<td>preheat to 37&#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>heat inactivate 30 min @ 56&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25030-081</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:259px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:239px;">8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well plates</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:157px;">Mirus</td>
			<td style="width:123px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Glo lysis buffer</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Renilla Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">96-well assay plate (white)</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Modulus microplate luminometer</td>
			<td style="width:157px;">Turner Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">998-9300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the lifecycle of ebola virus under biosafety level 2 conditions with virus-like particles containing tetracistronic minigenomes

וירוסי אבולה לגרום חום המורגי חמור בבני אדם ופרימטים שאינם בני אדם, עם הרוג שיעורי מקרה גבוהים ככל 90%. אין חיסונים שאושרו או טיפולים ספציפיים למחלה הנגרמת על ידי הווירוסים האלה, ולעבוד עם וירוסי אבולה זיהומיות מוגבלת לרמת בטיחות הביולוגית 4 מעבדות, המגבילים את המחקר בוירוסים אלה באופן משמעותי. מערכות מחזור חיים של דוגמנות מודל מחזור החיים של הנגיף ברמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים; עם זאת, עד לאחרונה מערכות כאלה היו מוגבלים לשני היבטים פרטניים של מחזור החיים של הנגיף, או מחזור זיהומיות יחיד. minigenomes Tetracistronic, אשר מורכב של אזורי וירוס האבולה ללא קידוד, גן כתב, ושלושה גני וירוס האבולה מעורבים בהמורפוגנזה, ניצנים, וכניסה (VP40, GP 1,2, וVP24), ניתן להשתמש בם כדי לייצר שכפול ושעתוק חלקיקי -competent כמו וירוס (trVLPs) המכילים minigenomes אלה. trVLPs אלה ברציפות יכולה להדביק תאים המבטאים את אבולהחלבוני נגיף אחראים לשכפול הגנום ושעתוק, ומאפשר לנו מודל בבטחה מחזורי זיהומיות מרובים תחת רמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים. חשוב לציין, המרכיבים הנגיפיים של זה מערכות נגזרים אך ורק מוירוס האבולה, ולא מוירוסים אחרים (כמו, למשל, במקרה של מערכות באמצעות וירוסי Pseudotyped), וVP40, GP 1,2 וVP24 אינם ביטוי יתר במערכת זו , מה שהופך אותו אידיאלי ללימוד המורפוגנזה, ניצנים וכניסה, אם כי בהיבטים אחרים של מחזור החיים של הנגיף כגון שכפול הגנום ושעתוק יכולים גם להיות מודל עם מערכת זו. לכן, assay trVLP tetracistronic מייצג את מערכת המודלים מחזור חיים המקיפה ביותר זמינה עבור וירוסי אבולה, ויש לו פוטנציאל עצום לשימוש בחקירת הביולוגיה של וירוסי אבולה בעתיד. כאן, אנו מספקים מידע מפורט על השימוש במערכת זו, כמו גם על תוצאות צפויות.

Transfection של 293 תאי מפיק עם פלסמידים ביטוי קידוד חלבוני nucleocapsid וירוס האבולה NP, VP35, VP30, וL, minigenome tetracistronic ותוצאות פולימראז T7 האבזר בminigenome שכפול ושעתוק ופעילות עיתונאית שניתן לזהות בקלות ב72 שעה (איור 6 ). חשוב לציין, פעילות הכתב שנצפתה (10 5.6 יחידות יחסי הארה (RLU)) עולה על זו של ביקורת שלילית שבו L קידוד פלסמיד הביטוי הושמט מtransfection (10 3 RLU) על ידי יותר מ 2 יומנים. רמת פעילות הנמוכה נצפתה גם בהעדרו של L היא ככל הנראה בשל אמרגן נסתר בפלסמיד minigenome. תאי יעד נגועים בtrVLPs מsupernatant של תאי מפיק בפועל להראות מעט רמות גבוהות של פעילות עיתונאית בהשוואה לתאי מפיק, וערכים להגיע בין 7 10 6 ו10 RLUs, בהתאם למעבר. בניגוד לכך, wתרנגולת supernatant של תאי מפיק שליטת ס הוא passaged על תאי יעד (המבטא את כל חלבון nucleocapsid, כולל L), פעילות עיתונאית אינה עולה על רעש הרקע של luminometer (כ -10 2 RLU). Assay trVLP tetracistronic יכול לשמש כדי לחקור את מחזור החיים של נגיפי אבולה. לדוגמא, זיהום של 293 תאים עם trVLPs תלוי בנוכחותם של גורמי קובץ מצורף כגון טים-1 16, שבה יש ליסופק בטראנס בתאים אלה. כתוצאה מכך, בassay trVLP tetracistronic ירידה בפעילות כתב בתאי יעד של כ פי 100 הוא ציינה בהעדר טים-1 (איור 7 א). תפקידם של חלבונים ספציפיים (נגיפיים או סלולריים) בכל מחזור החיים של הנגיף גם ניתן להעריך באמצעות טכנולוגית RNAi יחד עם גישה זו. כדוגמא, RNAi בתיווך למטה ויסות של תוצאות L בירידה בפעילות עיתונאית של כ פי 100, המשקף את תפקידה המרכזי של L בשכפול ושעתוק (איור 7) 7. יתר על כן, ניתן לתפעל את minigenome להעריך את ההשפעה של מוטציות על מחזור החיים של הנגיף ישירות. כדוגמא, כאשר VP24-ביטוי מminigenome הוא בוטל על ידי החדרת 3 קודונים תחנה מייד במורד הזרם של קודון ההתחלה, הפעילות עיתונאית בתאי מפיק לא השתנתה באופן דרמטי; עם זאת, פעילות עיתונאית בתאי מטרה היא מופחתת על ידי על פי 20 לאחר מעבר אחד, ו400 פי לאחר שני קטעים, המצביעה על תפקידו של VP24 בייצור של trVLPs זיהומיות (איור 7 ג) 15. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig1highres.jpg" width="500" /> מבנה איור 1 של הגנום וירוס האבולה, כמו גם minigenomes monocistronic וtetracistronic. Coding אזורים לחלבון נגיף האבולה מוצג כאדום (NP,VP35, VP30, וL), צהוב (VP40 וVP24) או כחול (תיבות GP 1,2). אזורים ללא קידוד (NCRs) מוצגים בירוק, עם אזורי המנהיג והקרוון שצוינו. תחתי מציין איזה NCR הנגיפי שימש להצטרפותו לאזורי הקידוד. אזור הקידוד לכתב (נציג) מוצג בסגול. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig2highres.jpg" width="500" /> תאי איור 2 assay minigenome Monocistronic. הם transfected עם פלסמידים ביטוי לחלבוני nucleocapsid נגיף האבולה (NP, VP35, VP30, L), minigenome monocistronic (מ&quot;ג) ופולימראז T7. Minigenome תחילה עיבד ידי פולימראז T7 (א) לRNA minigenome unencapsidated באותו הכיוון כמו הגנום הנגיפי (vRNA), אשר encapsidated לאחר מכן על ידי NP (ב). Interm זה encapsidated vRNA משוכפל באמצעות RNA minigenome המשלים (קרנה)ediate (ג), ולאחר מכן עיבד לתוך mRNAs הכתב (ד) שמתורגמים לחלבון כתב (ה). <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig3highres.jpg" width="500" /> assay trVLP איור 3 עם minigenome monocistronic. התאים transfected עם פלסמידים ביטוי לרכיבי assay minigenome (חלבוני אבולה nucleocapsid וירוס NP, VP35, VP30, L, minigenome monocistronic ופולימראז T7), כמו גם VP40, GP 1 , 2 וVP24. זה מוביל להיווצרות של trVLPs המשלבים nucleocapsids המכיל minigenome (ו). trVLPs אלה אז יכול להדביק תאי מטרה (ז), הpretransfected או עם פלסמידים ביטוי לNP, VP35, VP30, וL (למעלה), וכתוצאה מכך שכפול ושעתוק המשני (ד) שמובילה לביטוי עיתונאי (ה), או נאיבי תאי מטרה (למטה), וכתוצאה מכך השעתוק העיקרי של דקותigenomes (h), גם מוביל לביטוי עיתונאי (ה). <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig4highres.jpg" width="500" /> תאי איור assay trVLP .4 עם minigenome tetracistronic. הם transfected עם פלסמידים ביטוי לחלבוני nucleocapsid נגיף האבולה (NP, VP35, VP30, L), minigenome tetracistronic (מ&quot;ג) ופולימראז T7. שעתוק ראשוני (א), encapsidation (ב), שכפול הגנום (ג) ושעתוק (ד), כמו גם תרגום (ה) להתרחש כבassay minigenome monocistronic. עם זאת, בנוסף לmRNA כתב, mRNAs לVP40, GP 1,2 וVP24 גם עיבד מminigenome tetracistronic, וכתוצאה מכך ההיווצרות של trVLPs (ו). trVLPs אלה להדביק תאי מטרה, כי כבר pretransfected עם פלסמידים ביטוי לחלבוני nucleocapsid NP, VP35, VP30 וL, כמו גם את נגיף האבולה הסלולריגורם מצורף טים-1, וכתוצאה מכך שכפול הגנום ושעתוק, וייצור של trVLPs שיכול לשמש כדי להדביק תאי מטרה טריים. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig5highres.jpg" width="500" /> תזמון איור 5 של assay trVLP tetracistronic ל3 קטעים רצופים. ימים לזריעת תאים (ים), transfecting תאים (t), מדביק את תאים (i), שינוי בינוני (ג) וקציר של (h) תאים וtrVLPs הם הצביע עבור שלושה קטעים רצופים (מסומן בחצים). <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6 רמות אופייניות של פעילות עיתונאית שנצפתה בassay trVLP tetracistronic. Assay trVLP tetracistronic בוצעו ב -5 קטעים הבאים protocהתווה ol בכתב היד הזה. כביקורת שלילית L קידוד פלסמיד הביטוי הושמט (ס) מtransfection של תאי מפיק P0. תאי מטרה במעברי P1 לp5 היה transfected עם פלסמידים ביטוי לכל חלבוני nucleocapsid, כולל ל &#39;רעשי הרקע של luminometer מצויינים כקו מקווקו. ממוצעים וסטיות תקן של 4 משכפל ביולוגי מ3 ניסויים בלתי תלויים הראו. <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7 הערכת ההשפעה של גורמים נגיפיים ותאיים שונים במחזור החיים הנגיפיים באמצעות trVLPs tetracistronic. () טים-1 כגורם מצורף. תאי יעד שpretransfected עם פלסמידים ביטוי קידוד לחלבוני nucleocapsid ועם או בלי קידוד פלסמיד לטים-1 (שתואר ב15) היו נגועים בט &#39;trVLPs racistronic. פעילות כתב שלאחר זיהום 72 שעות בתאי מטרת p1 נקבעה. ממוצעים וסטיות תקן של 4 משכפל ביולוגי מ4 ניסויים בלתי תלויים הראו. (ב) השפעה של מציאה RNAi של L על שכפול הגנום ושעתוק. תאי היעד שpretransfected עם פלסמידים ביטוי לרכיבי nucleocapsid, טים-1 וmiRNAs המכוונים נגד L (אנטי-L) או חלבון שאינו קשור (אנטי-GFP) (תאר ב15) היו נגוע בtrVLPs tetracistronic. פעילות כתב שלאחר זיהום 72 שעות בתאי מטרת p1 נקבעה. ממוצעים וסטיות תקן של 5 חזרות ביולוגיות מ2 ניסויים בלתי תלויים הראו. (C) השפעה של מוטציות בminigenome על infectivity trVLP. Assay trVLP tetracistronic בוצע באמצעות שני minigenome wild-type (4cis-WT) או minigenome ב ש3 קודונים תחנה הוכנסו מייד לאחר קודון תחילת VP24, ביטול o להביעf החלבון הזה, אבל מציג רק שינויים מינימאליים לminigenome לגבי אורך, הרכב חומצות גרעין, מבנים משניים וכו &#39;פעילות Reporter בP0, P1 ו P2 נמדד 72 שעות לאחר transfection / זיהום. ממוצעים וסטיות תקן של 3 חזרות ביולוגיות מ3 ניסויים בלתי תלויים הראו. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;width:115px;"></td><td style="width:127px;"> תאי מפיק (P0) </td><td style="width:180px;"> תאי יעד (P1 ומעלה) </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-NP </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP35 </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP30 </td><td> 75 </td><td> 75 </td></tr><tr height="19"><td height = סגנון &quot;גובה: 19px&quot;, &quot;19&quot; =&gt; pCAGGS-L </td><td> 1,000 </td><td> 1,000 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> p4cis-vRNA-RLuc </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-T7 </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-Tim1 </td><td> - </td><td> 250 </td></tr></tbody></table> הטבלה 1 DNA מסתכם לtransfection. הסכום של כל פלסמיד הנדרש לtransfection של תאי מפיק והיעד מוצג בng לכל טוב של צלחת 6 היטב. כל פלסמידים מתוארים בואט et 15 אל.

Watch this Scientific Journal Video about Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes at JoVE.com

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

עבודה עם וירוסי אבולה זיהומיות מוגבלת לרמת בטיחות הביולוגית 4 מעבדות. שכפול ושעתוק וירוס-מוסמך כמו חלקיקים המכיל minigenome Tetracistronic (trVLPs) מייצג מערכת דוגמנות מחזור חיים המאפשרת לנו לבנות מודל בבטחה מחזורי זיהומיות מרובים תחת רמת בטיחות ביולוגית 2 תנאים, להסתמך באופן בלעדי על רכיבי נגיף האבולה.

דוגמנות מחזור החיים של נגיף האבולה תחת 2 תנאים ברמת בטיחות ביולוגיים עם חלקיקים כמו וירוס המכילים Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

modeling-lifecycle-ebola-virus-under-biosafety-level-2-conditions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.9K Views.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health.  עבודה עם וירוסי אבולה זיהומיות מוגבלת לרמת בטיחות הביולוגית 4 מעבדות. שכפול ושעתוק וירוס-מוסמך כמו חלקיקים המכיל minigenome Tetracistronic (trVLPs) מייצג מערכת דוגמנות מחזור חיים המאפשרת לנו לבנות מודל בבטחה מחזורי זיהומיות מרובים תחת רמת בטיחות ביולוגי...

Video: Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

מעקבים שפעת העופות FTA עם כרטיסי: שיטות שדה, biosafety, וסוגיות התחבורה נפתר

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

אמצעי בטיחות ונהלי הפעלה בבית (א) BSL-4 מעבדה: 1. רמת בטיחות ביולוגית 4 Suit כניסה ויציאה ונהלים Suite מעבדה

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

הפקה של חלקיקים Pseudotyped ללמוד מעוררת פתוגני באווירה אבטחה ברמה 2

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

יישום של רטבאליות העיסוי העקבי של העכבר וניטור השינויים הנובעים בלחץ שרירי

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...