1. הרכבת חיסון נגיף וטיהור VLPs מצמחי Nicotiana benthamiana <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר תעתיקי תרי T7-RNA מתפו&quot;א וירוס X (PVX)-מבוססי פלסמידים וקטור שנשאו MRFV חלבון Cys מוטצית מעייל (CP) גנים 12, באמצעותו של Ambion T7-mMessage mMachine הקיט פראי מסוג (wt) ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל תגובת תמליל T7, לחסן שני עלים התרחבו באופן מלא של נ benthamiana עם 10 תגובות μl ולדגור על הצמחים במשך 10 ימים בחממה, בתנאי לחות 60% עבור 16 שעות עם אור (25,000-30,000 לוקס) בשעת 25 ° C ו 8 שעתי חשכה בשעת 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלי Harves t נ benthamiana נגועים בנגיף 10 ימים אחרי החיסון (dpi), לשקול את רקמות הצמח (50 גרם) ומניח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הומוגני חומר צמחי במערבל בנוכחות של 100 מ&quot;ל של פתרון מצונן של חיץ 0.5 מ &#39;Na-ציטראט, 5.5 pH (שימוש 2 מ&quot;ל של חיץ לגרם של רקמות צמח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן homogenate באמצעות 3 שכבות של cheesecloth ולהבהיר ידי צנטריפוגה ב27000 XG למשך 30 דקות. העברת supernatant לגליל סיים מצונן, למדוד את עוצמת קול, ולאחר מכן להעביר למבחנה סטרילית מצוננת. השלך את הגלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את supernatant על ידי הוספת 10% פוליאתילן גליקול 8000 (PEG 8000), מערבבים במשך 15 דקות ב 4 ° C, ודגירה במשך 45 דקות נוספות ב 4 ° C כדי להאיץ את חלקיקי נגיף הדמויים (VLPs)-PEG מטריקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במדגם 27000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הגלולה על ידי הוספת 8 מ&quot;ל של חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH מכיל 2% Triton X-100. מערבולת צינורות צנטריפוגות גם כדי לשחרר את הכדור. להעביר את הכדור והחיץ למבחנה סטרילית מצוננת. יש לשטוף את הצינורות באופן מיידי עם 2 מ&quot;ל של אותו המאגר ולהוסיף לכוס. מערבב את ההשעיה ב 4 מעלות צלזיוס עד שהכדורים מתמוססים (בדרך כלל שעות 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבהר ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב27000 XG, להשליך את הגלולה, ו-process supernatant ידי צנטריפוגה ב140.000 XG ל2 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 1 מיליליטר חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH ולמקם את ההשעיה על גבי 10-40% שיפוע סוכרוז עשה במאגר 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה השיפוע עבור 3 שעות ב140.000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשפוך אור על החלק העליון של צינור צנטריפוגה ולאסוף רצועה העליונה פיזור אור ב4 סנטימטרים מהחלק העליון של הצינור, לדלל עם חיץ 0.05 M Na-ציטראט, 5.5 pH, וצנטריפוגה ל3 שעות ב140.000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלול ב 0.5 מ&quot;ל של מים וחנות סטרילית ב 4 ° C, למשך שישה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את ריכוז VLPs על ידי ביצוע בדיקת חלבון ברדפורד. התשואה של VLPs היא בין 1 ל 3 מיקרוגרם / גרם של רקמות צמח. </li></ol> 2. תגובות fluorescein-5-maleimide-תיוג של VLPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של 1 mM fluorescein-5-maleimide (427.37 גרם / שומה) בphosphat נתרן 50 מ&quot;מימדואר חיץ, pH 7.0, 1 mM EDTA. מערבב בעזרת המערבולת ולוודא מסה מלאה. הגן על הצינור מן האור עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף fluorescein-5-maleimide לVLPs מיוצר בשלב 1 ולערבב. השתמש עודף טוחנת 25-קיפול של fluorescein-5-maleimide לכמות טוחנת של sulfhydryls. בדרך כלל, באמצעות 30 μl של VLPs בריכוז של מיקרוגרם 1 / μl ו60 μl של פתרון fluorescein-5-maleimide מייצר תוצאות מתקבלות על דעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התגובה ל2 שעות בטמפרטורת חדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את התגובה על ידי הוספת dithiothreitol (DTT) לריכוז סופי של 50 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר הלא הגיב fluorescein באמצעות עמודת desalting ספין (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב1500 XG בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח SDS-PAGE, להוסיף 10 μl מתוך 2 חיץ מדגם x-SDS PAGE Laemmli עד 10 μl של כל תגובה. אחסן את החלבון המסומן מוגנים מפני אור ב 4 ° C עד חודש אחד אובaliquots שימוש היחיד ב -20 ° C עד 3 חודשים. </li></ol> 3. תיוג תגובה וקביעת התאגדות ביוטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעמודות ספין desalting (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) לבצע החלפת חיץ ממים מלוחים פוספט שנאגר-(PBS), 7.0 pH של VLPs מיוצר בשלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון מנייה 20 מ&quot;מ של maleimide-PEG2-ביוטין ידי הוספת μl 190 של PBS ב-No-לשקול maleimide-PEG2-ביוטין ולערבב ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף maleimide-PEG2-ביוטין לVLPs והמערבב. השתמש עודף טוחנת 10-קיפול של ריאגנט לפתרוני VLPs ≤ 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התגובה בטמפרטורת חדר למשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר הלא הגיב maleimide-PEG2-ביוטין באמצעות עמודת desalting ספין (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) וצנטריפוגה עבור 2 דקות ב1500 XG בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את השומות של ביוטין לשומות של VLPs באמצעות פירס ביוטין quantitation הקיט (Thermo Scientific) וחצllowing הוראות יצרן. </li></ol> 4. Cross-linking של 2-VLPs Cys וF פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VLPs אשר הביאה שאריות ציסטאין זמינות לצלב-linking בשלב 2 (2-Cys VLPs) משמש בשלב הבא. הכן את פתרון צלב-linking מלאה טרי (28.63 מ&quot;מ) על ידי המסת 10 מ&quot;ג של מקשר צלב NHS-PEG4-maleimide בשנת 680 μl של sulfoxide דימתיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס 17 (F)-אמינו פפטיד ארוך החומצה (LLPNMOKDKEACAKAPL) ב 50 μl של חיץ צימוד (1 x PBS, 7.2 pH; 1 המ&quot;מ EDTA) בריכוז של 0.1 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 μl צולב מקשר עד 50 μl של פפטיד המומס (חלבון NH2) בריכוז סופי mM 1 (אשר הם עודף טוחנת 10-לקפל ל0.1 מ&quot;מ של פתרון פפטיד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התגובה ל2 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר פפטיד הצולב באמצעות עמודת desalting (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) מתאזנת עם חיץ צימוד (1 x PBS, 7.2 pH; 1 המ&quot;מ EDTA) על ידי צנטריפוגה XG ב 1500ל1 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תערובת תגובת שילוב VLPs (חלבון-SH) ופפטיד הצולב (חלבון NH2) ביחס טוחן נקבע על ידי מספר thiols ו אמין הופעל מעורב בתגובה וההבדל במשקל מולקולרי בין VLPs ופפטידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תגובת התערובת בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח כתם מערבי, לערבב את מוצר מצומד 01:01 התקבלו בLaemmli חיץ, להרתיח במשך 10 דקות, ולהמשיך בSDS-PAGE בגבס מראש 10-20% טריס-גליצין ג&#39;ל (Invitrogen), ואחריו על electroblotting קרום ניטרוצלולוזה (Invitrogen). חסום את הקרומים עם 1 x PBS, 7.2 pH המכיל 0.05% Tween-20 (PBS-Tween) ו5% אבקת חלב דל שומן ובדיקה עם נוגדני פפטיד ספציפיים ואחריו הנוגדן המשני המתאים phosphatase כותרתו. </li></ol>

<ol>
	<li>Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnip+yellow+mosaic+virus+as+a+chemoaddressable+bionanoparticle.">Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle.</a> Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).</li><li>Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potato+virus+X+as+a+vector+for+gene+expression+in+plants.">Potato virus X as a vector for gene expression in plants.</a> Plant J. 2, 549-557 (1992).</li><li>Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+gold+particles+in+viral+capsids.">Packaging of gold particles in viral capsids.</a> J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).</li><li>Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tobacco+mosaic+virus+liquid+crystals+as+templates+for+the+interior+design+of+silica+mesophases+and+nanoparticles.">Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles.</a> Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).</li><li>Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+biomolecular+templates+for+the+fabrication+of+metal+nanowires.">Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires.</a> FEBS. J. 274, 317-322 (2007).</li><li>Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+modification+of+a+viral+cage+for+multivalent+presentation.">Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation.</a> Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).</li><li>Hammond, R. W., Hammond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+rayado+fino+virus+capsid+proteins+assemble+into+virus-like+particles+in+Escherichia+coli.">Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli.</a> Virus Res. 147, 208-215 (2010).</li><li>Hermamson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate techniques. , (1991).</li><li>Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+studies+of+protein+cage+nanoparticles+demonstrate+broad+tissue+distribution+and+rapid+clearance+in+vivo.">Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo.</a> Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).</li><li>Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotemplate+synthesis+of+3-nm+nickel+and+cobalt+nanowires.">Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires.</a> Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).</li><li>Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+CuCl2+concentration+on+the+aggregation+and+mineralization+of+Tobacco+mosaic+virus+biotemplate.">Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).</li><li>Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successive+deposition+of+alternate+layers+of+polyelectrolytes+and+a+charged+virus.">Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus.</a> Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).</li><li>Natilla, A., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maize+rayado+fino+virus+virus-like+particles+expressed+in+tobacco+plants:+a+new+platform+for+cysteine+selective+bioconjugation+peptide+display.">Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display.</a> J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).</li><li>Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+trafficking+of+plant+virus+nanoparticles+in+mice+via+the+oral+route.">Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route.</a> Virology. 343, 2224-2235 (2005).</li><li>Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+virus-polymer+materials.+Synthesis+and+properties+of+PEG-decorated+Cowpea+mosaic+virus.">Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus.</a> Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).</li><li>Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+silica-coated+Tobacco+mosaic+virus.">Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus.</a> J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).</li><li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-surface+modification+in+the+Tobacco+mosaic+virus.">Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li><li>Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+viruses+as+biotemplates+for+materials+and+their+use+in+nanotechnology.">Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).</li></ol>

אזכור של השמות המסחריים של מוצרים מסחריים בפרסום הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מרמז המלצה או תמיכה של משרד החקלאות האמריקנית.

השיטה שהוצגה כאן מאפשרת ניתוח מאוד רגיש ומהיר של cysteines הווה על פני השטח של VLPs בצמחים המיוצרים כמו גם במערכות חלבון אחרות תגובתי. Maleimides הם ריאגנטים thiol ספציפיים, אשר מגיבים עם מולקולות חופשיות sulfhydryl המכילים ליצור קשרי thioether יציבים. שיטה זו נשענת על הספציפיות של maleimides לה...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Thinwall, צינורות-Ultra Clear </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMESSAGE mMACHINE T7 קיט </td><td> Tecnologies חיים </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescein-5-Maleimide </td><td> חי טכנולוגיות מדעיות Thermo </td><td> 46130 F150 </td><td> 46130 הם מתחליף סדר עם F150 </td></tr><tr><td> ערכת quantitation ביוטין פירס </td><td> Thermo Scientific </td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-קישור Maleimide-PEG2-ביוטין, אף לשקול פורמט </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM n Crosslinkers (PEG) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% טריס-גליצין ג&#39;ל </td><td> Invitrogen </td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Laemmli המאגר </td><td> Bio-Rad </td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td> טריס גליצין SDS ריצת המאגר </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td> טריס גליצין העברת המאגר </td><td> Invitrogen </td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td> כריך נייר מסנן ממברנה ניטרוצלולוזה </td><td> Invitrogen </td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td> זיקת שכותרת phosphatase מטוהרי נוגדני IgG לארנב </td><td> Kirkegaard ומעבדות פרי </td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> תשתית phosphatase NBT / BCIP </td><td> Kirkegaard ומעבדות פרי </td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of the solvent accessibility of cysteine residues on maize rayado fino virus virus-like particles produced in nicotiana benthamiana plants and cross-linking of peptides to vlps

חיקוי וניצול מאפייני נגיף ומאפייני physicochemical ופיסיים טומן בחובו הבטחה לספק פתרונות לכמה מהאתגרים הקשים ביותר בעולם. המגוון והסוגים של וירוסים יחד עם המאפיינים המסקרנים הצרופים פוטנציאלי לתת אינספור הזדמנויות ליישומים בטכנולוגיות וירוס מבוססים. וירוסים יש את היכולת עצמית להרכיב לתוך חלקיקים בעלי צורה דיסקרטית וגודל, סגולי של סימטריה, polyvalence, ומאפיינים יציבים תחת מגוון רחב של תנאי טמפרטורה וחומציות. שלא במפתיע, עם מגוון עשיר כל כך של תכונות, וירוסים מוצעים לשימוש בחומרים ביולוגיים 9, חיסונים 14, 15, חומרים אלקטרוניים, כלים כימיים, ו11 מיכלים מולקולריים אלקטרוניים 4, 5, 10, 16, 18, ​​12. על מנת לנצל וירוסים בננוטכנולוגיה, הם חייבים להיות שונים מהצורות הטבעיות שלהם כדי להקנות פונקציות חדשות. זה יחסי ציבור מאתגריםocess יכול להתבצע באמצעות מספר מנגנונים כולל הנדסה גנטית של הגנום הנגיפי וכימיות הצמדת מולקולות זרות או רצויות לקבוצות תגובתי חלקיקי וירוס 8. היכולת לשנות וירוס בעיקר תלויה במאפייני physiochemical ופיסיים של הנגיף. בנוסף, שינויים הגנטיים או physiochemical צריכות להתבצע מבלי להשפיע על המבנה ותפקוד יליד וירוס וירוס לרעה. (MRFV) חלבוני מעייל rayado תירס Fino וירוס עצמי להרכיב בחיידקי Escherichia ייצור VLPs היציב וריק שהם התייצבו על ידי בין חלבונים אינטראקציות ושניתן להשתמש ביישומים מבוססי טכנולוגיות וירוס 8. VLPs מיוצר בצמחי טבק נבדק כפיגום עליו מגוון של פפטידים ניתן להציג 13 קוולנטית. כאן, אנו מתארים את השלבים ל1) תקבעו מי מcysteines ממס הנגיש בcapsid וירוס זמין לmodifiקטיון, ו2) Bioconjugate פפטידים לcapsids השונה. באמצעות שאריות דובר או mutationally הוכנסו-חומצת אמינו וטכנולוגיות צימוד סטנדרטיות, במגוון רחב של חומרים שמוצגים על פני השטח של וירוסי צמחים כגון, וירוס Brome פסיפס 3, וירוס mottle ציפורנים 12, Cowpea chlorotic mottle 6 וירוס, פסיפס טבק וירוס 17, וירוס לפת צהוב פסיפס 1, וMRFV 13.

ביטוי זמני של גני חלבוני מוטצית MRFV מעייל (CP) בנ צמחי benthamiana בVLPs ייצור הווקטור PVX מבוסס מתוארים באיור 1. גן חלבון מעייל MRFV modified מוגבר באמצעות PCR ולאחר מכן תחת שליטת התעתיק של אמרגן CP subgenomic המשוכפל בוקטור PVX מבוסס, pP2C2S 2, (מתנה של ד Baulcombe, מעבדות סיינס?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

שיטה לנתח את נגישות הממס של קבוצת thiol של שאריות ציסטאין של<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; (MRFV) חלקיקי וירוס דמוי (VLPs) ואחריו תגובה של פפטיד צלב-linking מתוארים. השיטה מנצלת את הזמינות של מספר קבוצות כימיות על פני השטח של VLPs שיכול להיות מטרה לתגובות ספציפיות.

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

analysis-solvent-accessibility-cysteine-residues-on-maize-rayado-fino

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

11.0K Views.  Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture. שיטה לנתח את נגישות הממס של קבוצת thiol של שאריות ציסטאין של תירס rayado Fino וירוס (MRFV) חלקיקי וירוס דמוי (VLPs) ואחריו תגובה של פפטיד צלב-linking מתוארים. השיטה מנצלת את הזמינות של מספר קבוצות כימיות על פני השטח של VLPs שיכול להיות מטרה לתגובות ספציפיות.

Video: Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using &#039;Single Virus Genomics&#039;

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

ניתוח של נזק אפיתל הופק על ידי<em&gt; Histolytica Entamoeba</em&gt; זיהום

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

דוגמנות מחזור החיים של נגיף האבולה תחת 2 תנאים ברמת בטיחות ביולוגיים עם חלקיקים כמו וירוס המכילים Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

פיתוח תאי גזע שמקורם אנטיגן ספציפי תקינים בתאי T נגד אוטואימוניות

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

השימוש בטכניקת הכיסוי הרך-אגר למסך תרכובות מעכבות הופקו bacterially

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

הקמתה של זיהום נגיפי וניתוח של התערבות מארח-וירוס דרוזופילה Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in response to various immune stimuli. ROS generated during immune activation exerts potent antimicrobial activity primarily through the ability of ROS to damage DNA and proteins, causing death of microorganisms. Being able to measure ROS production reproducibly and with ease is necessary in order to assess the contribution of various pathways and molecules to this mechanism of host defense. In this paper, we demonstrate the use of fluorescent probes and flow cytometry to detect ROS production. Although widely used, fluorescent measurement of ROS is notoriously problematic, especially with regards to measurement of ROS induced by specific and not mitogenic stimuli. We present a detailed methodology to detect ROS generated as a result of specific Fc&#947;R stimulation beginning with macrophage generation, priming, staining, Fc&#947;R cross-linking, and ending with flow cytometric analysis.

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&amp;#947;R Cross-linking

This study demonstrates the use of flow cytometry to detect reactive oxygen species (ROS) production resulting from activation of the Fc&#947;R. This method can be used to assess changes in the antimicrobial and redox signaling function of phagocytes in response to immune complexes, opsonized microorganisms, or direct Fc&#947;R cross-linking.

מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...