אנו מודים Dibbits ברט לקבלת סיוע טכני. גידול בעלי חיים קבוצה Genomics, אוניברסיטת Wageningen, הולנד, אירח אותנו בנדיבות במעבדה שלהם. צוות של ציפור Ottenby המצפה, שבדיה, הוא הודה על השמנה הדגימה ברכיות, בפרט Hellström מגנוס, מרקוס דניאלסון, כריסטופר מגנוסון ו סטינה אנדרסון. אנו מודים וסאנה Svensson, יונתן Qvist ו Per-אקסל Gjöres לצילום בבית Ottenby ו מנו Camon לצילום במעבדה. דניאל Bengtson סיפק תמונות ברווז יפה עבור חלק הווידאו של פרסום זה. חומר נוסף חינם מן הספרייה הציבורית של ה-CDC הבריאות תמונה (פיל; <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/</a> ) שימש: מיקרוסקופ אלקטרונים (מס &#39;280, על ידי ד&quot;ר ארסקין פאלמר) ואיור (מס&#39; 11823; על ידי דאגלס ירדן) של נגיף השפעת. תמיכה כספית ניתנה על ידי KNJV (רויאל הולנד ציידים האגודה), משרד הולנדית החקלאות, Faunafonds ואת דה Stichting Eik נאמנויות (הן הולנד), השוודית המועצה למחקר (לא מענק. 2007-20774) ואת EC מבוסס Newflubird הפרויקט. כימיקלים RNA הבידוד היו מתנה נדיבה של Ambion, Inc, חברת RNA. זוהי תרומה מס &#39;245 של בירד Ottenby המצפה.

1. ברווז השמנה סחיטה ביוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלכודת שכשוך ברווזים של אנס הסוג (או ציפורים אחרות) בכלוב ידי משיכת אותם עם ברווזים לפתות או מזון, והכניס אותם לתוך קופסאות לוח הפרט כרטיס. זמן תחבורה בתיבת צריכה להיות מינימלית, למשל, על ידי התקנת תחנת השדה במרחק קצר אל המלכודת. בנסיבות לוגיסטיים עשויים להשתנות במחקר זה. העצה ואישור של החיה הרלוונטית ועדת האתיקה צריכה להיות חיפשו כל חדש הגדרת. לחלופין, גם צייד הציפורים נורו ניתן שנדגמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הברווז של התיבה על ידי החזקת כנפיו הדוקה לגוף שלה. לדוגמא הטלת טרי, אשר יהיה נוכח ברוב המקרים, ישירות מהחלק התחתון של התיבה. לאסוף אותם עם ספוגית סטרילית וליישם את נוזל לכרטיס Whatman FTA. אם לא, לבצע שטיפת ביוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הברווז על גבו. זה מאפשר גישה אל הביב ומקל הדגימה. הביב הוא מבנה בולט ממוקם מתחת בבטן, קרוב לבסיס הזנב. אדם מנוסה יכול להחזיק המדגם ציפור באותו זמן, או אחר אדם נוסף יכול לסייע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס פלסטיק סטרילית זהורית ספוגית (קופאן, איטליה) כ 1 ס&quot;מ וליצור מערבולת עדינה של הביב. מגלגלים את ספוגית עם הנוזלים מן הביב על פני השטח של כרטיס Whatman FTA. שחרור מיידי לאחר שבוצעה דגימה של החיה רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הקלפים FTA בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות 1, אז כל חנות בנפרד מדגם בשקיות נייר (מעטפות, לדוגמה). אחסון אפשרי בטמפרטורת החדר, אולי עם חרוזי סיליקה באקלים לח. שליחה וקבלה של biosafety &quot;מוסדות קצינים יכולים להרשות לשלוח כרטיסי FTA בדואר רגיל, שכן פתוגנים הופכים פעיל במגע עם המשטח כרטיס FTA. </li></ol> 2. בידוד נגיפי RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את החומר כרטיס FTA כולל צואה / נוזל ביוב. Punch שלוש דיסקיות עם אגרופן האריס 2 מ&quot;מ במקום כל אלה לתוך באר של צלחת חינם 96well RNase. בין כל דגימה חדשה, לנקות את אגרופן בזהירות עם אלכוהול דיוק קים לנגב (Kimtech). השתמש תמיד שולט חיוביים ושליליים. פקד חיובית יכולה להיות מורכבת זן מעבדה להחיל טרי לכרטיס FTA, או מדגם טבעי שהוא יודע להניב תוצאה חיובית. כפי בקרה שלילית, אגרוף החוצה דיסקים מכרטיס FTA ריק. בנוסף, לעזוב נוסף חינם גם עבור פקד ה-PCR בהמשך הניסוי שלך (עם המים כתבנית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 70μl RNA פתרון מהיר החילוץ (Ambion) וחום חותם את הצלחת (AbGene Thermo-אוטם). דגירה 5 דקות על שייקר צלחת בטמפרטורת החדר במהירות נקבע כי אינו גורם לשפוך מעל (זה תלוי את המודל המשמש צלחת שייקר; בדיקה מראש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Carry ויראלי בידוד RNA על פי פרוטוקולים של היצרן עם MagMAX-96 נגיפי RNA ערכת בידוד (Ambion). בקיצור: הוסף 130μl מוכן תמוגה / פתרון מחייב (מ בערכה) היטב כל אחד. העברת 50μl חילוץ חומר FTA כרטיס היטב כל אחד. Shake צלחת דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20μl לערבב חרוז מוכן (מ בערכה) לדגום כל ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה. תלחצו על מהירות נחוש במשך 5 דקות. מולקולות רנ&quot;א יהיה לאגד את חרוזים מגנטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את צלחת מגנטי 96-היטב לעמוד כדי ללכוד את החרוזים. בהתאם לדגם של מעמד מגנטי בשימוש, זה יכול לקחת יותר מ 5 דקות. כאשר הפתרון הפך ברור לחלוטין, להסיר ולסלק supernatant. ואז להסיר את צלחת מדוכן מגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים פעמיים עם פתרון לרחוץ 1 ופעמיים עם פתרון לשטוף 2 (מ בערכה). עבור כל אחד 4 שלבים לשטוף להוסיף לשטוף 150μl פתרון מוכן מדגם זה, ללחוץ במשך דקה 1 על מהירות נחוש, לעבור את הצלחת לעמוד המגנטי, ללכוד חרוזים כ -5 דקות (או עד הפתרון הוא ברור לחלוטין), הסר להשליך את supernatant. ואז להסיר את צלחת מדוכן מגנטי, להוסיף את הפתרון לשטוף הבא, ולבצע את הצעדים כביסה כמו בעבר. לאחר שלב הכביסה האחרון, להסיר פתרון לשטוף כמה שיותר אוויר יבש החרוזים בטמפרטורת החדר ב שייקר צלחת במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μl של חיץ elution (מ בערכה) לשחרר RNA מן החרוזים ולנער במשך 4 דקות על שייקר צלחת. לכידת חרוזים כפי שתואר לעיל. Supernatant כרגע המכיל את הרנ&quot;א מבודדים אשר מוכן יישומים במורד הזרם. </li></ol> 3. RT-PCR של מטריקס AIV ג&#39;ין ביצוע PCR שעתוק הפוך (RT-PCR) עם One-Step RT-PCR גישה למערכת (Promega) ב 25 תגובות μl (מנוכה מן קראוס ואח&#39; 18 ו Fouchier ואח&#39; 22..): <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Nuclease מים חינם </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 חיץ </td&gt; <td> 5μl </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> פריימר M52C 22 (10 מיקרומטר) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> פריימר M253R 22 (10 מיקרומטר) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 מ&quot;מ) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV הפוך transcriptase (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> פולימראז TFL (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> רנ&quot;א מדגם </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> תנאי ה-PCR ב T1 Biometra thermocycler הם: שעתוק לאחור הראשונית של 45 דקות 45 ° C, ואחריו denaturation 2 דקות הראשונית ב 94 ° C ו 40 מחזורים של: 94 ° C עבור 1 דקה, 56 ° C למשך דקה 1, 68 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. התארכות נוסף 7 דקות 68 ° C מסכם את ההגברה. 4. הקרנת עבור AI חיובי דוגמאות וטיהור של קטעים מתוך ממוקד ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 2μl של המוצר PCR מעורבב עם צבע 2μl טעינת 5x (BioRad) ומים 6μl על 1% agarose ג&#39;ל (Roche) מוכתם ברומיד ethidium 1% (2.5μl לכל ג&#39;ל מ&quot;ל 100) להקרנה מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרץ את הג&#39;ל שעה 1 ב 120V, יחד עם תקן ה-DNA גודל (עומס BioRad EZ 100 סולם bp), לדמיין עם מערכת תיעוד ג&#39;ל. ראה דוגמה באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר דגימות עם שברי מוגבר בטווח גודל הצפוי (בין 200 נ&quot;ב ל -300 נ&quot;ב (שבר היעד הוא 244 נקודות בסיס). טעינת נפח תגובה כל PCR (מתוכם ~ 23μl נותרים) של מועמדים אלה עם צבע 6μl טעינת 5x על 2 ethidium ברומיד% מוכתם agarose ג&#39;ל ולהפעיל למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הג&#39;ל על transilluminator-UV (Bioblock מדעי) ובחן ויזואלית. ראה דוגמה באיור 2. להקות והבלו הגודל הנכון של ג&#39;ל עם אזמל והניח לתוך צינורות בודדים 1.5 תגובה מ&quot;ל. לטהר שברי מן ג&#39;ל, למשל עם השחזור Zymoclean ג&#39;ל DNA Kit (Zymo מחקר). </li></ol> 5. סידור וזיהוי של PCR מוצרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע סנגר רצף של שברי היעד, למשל על ברצף ABI 3730 נימי עם ABI ביג דיי 3.1 כימיה (Applied Biosystems). הכן התגובות ברצף בכמויות 10μl המכיל 10-20 ng ג&#39;ל מטוהרים cDNA תבנית, דילול 1.75μl 5x חיץ, 0.5μl ביג premix דיי v3.1, 1 פריימר קדימה μl (M52C 20, 10 מ&quot;מ), ו ddH2O. תנאי רכיבה על אופניים הם: 1 denaturation דקות הראשונית, ואחריו 25 מחזורים של: 10 שניות על 96 מעלות צלזיוס, 5 ים ב 45 ° C ו 4 דק &#39;ב 60 ° C. לטהר ולהכין את התגובה סידור לפי פרוטוקולים פנימיים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי וכתוצאה מכך רצפי cDNA מול מסדי נתונים נוקלאוטיד כגון GenBank23, למשל על ידי כלים מבוססי אינטרנט כגון תפציץ במרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה (צמח השדה, <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. נציג תוצאות: מולארד (אנס platyrhynchos) נדגמו על Ottenby Bird Observatory בדצמבר 2007. מתוך כל ברכייה מדגם על FTA כרטיס נלקח כמתואר בפרוטוקול זה. לאחר המשלוח, הקלפים FTA נשמרו במקפיא ב -20 ° C למשך שנתיים. המדגם אותו כרטיס FTA המעבדה לבודד נבדק קראוס ואח&#39;. 18 נכלל כביקורת חיובית, כמו גם תשעה דילולים סדרתי פי עשרה מזה. שני פקדים היו שליליות i) מיצוי מכרטיס FTA ריקה, כדי לבחון אם יש לשאת מעל מ אגרופן, ואת ii) RT-PCR תגובה שבה מים nuclease חינם שימש כתבנית, כדי לבדוק אם הזיהום התרחשו במהלך, או כהכנה התגובה PCR. 84 דגימות נותחו. תמונה ג&#39;ל של מוצרי ה-PCR מתוך 84 דגימות אלה ניתן למצוא באיור 1. ממדגמים טבעי מספר רב של להקות נוקבים ניתן לצפות בשל נוכחותם של זיהומים חיידקים שונים הצואה. עם זאת, שבר היעד של הצמד פריימר הוא 244 נ&quot;ב ארוך. נפח כולו PCR-תגובת משנה של דגימות שהפיקה שברי בטווח של כ הגודל הנכון (בין 200 נ&quot;ב ל -300 נ&quot;ב) הועמס על ג&#39;ל (איור 1). איור של איזה להקות קוצצו מן הג&#39;ל ניתן למצוא באיור משלים 1. בנוסף שליטה חיובית, שניים דגימות אלה (69,899 ו 69,912) היו חיוביות ידי פרוטוקול חדש. חיפוש תפציץ נגד באתר צמח השדה נוקלאוטיד חשפה את זהותם כמו AI מטריצה ​​גן (איור 3), בעוד כל הלהקות האחרות דמה רצפים חיידקי צמוד ביותר, או לא הניב רצף קריא בכלל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" /> באיור 1. ג&#39;ל תמונה של סינון ראשוני של מוצרי ה-PCR. 2 μl מוצר ה-PCR חיובי של שליטה, שלדילולים erial שליטה חיובית, שני פקדים שלילית 84 דגימות ביוב הועמסו. 48 דגימות מוצגים בלוח ג&#39;ל העליון, 48 דגימות בלוח התחתון. החיצים האדומים מציינים נתיבים ג&#39;ל המשמש 100 רגיל בגודל bp-DNA. לצורך המחשה, עיגולים אדומים להראות להקות טווח הגודל המצופה. חוגים כחול עולה amplicon נוקבים (למעלה משמאל) או דימר פריימר artefact להלן 100 נ&quot;ב בגודל (מימין למטה). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" /> איור 2. דוגמאות מבחר דוגמאות עם שברי בטווח הגודל הנכון. עם להקות בין 200 נ&quot;ב ל -300 נ&quot;ב (שבר יעד 244 נ&quot;ב) נבחרו. החץ הירוק מצביע על שליטה חיובית, שני החצים האדומים מצביעים על דגימות אשר אושרו להיות חיוביים AIV ידי השוואת רצפי cDNA שלהם באתר צמח השדה נוקלאוטיד. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" /> איור 3. לכידת מסך של חיפוש פיצוץ היציג באותו צמח השדה. אחד רצפי cDNA שהתקבלו שברי נכרת היה שאילתה מול מסד הנתונים של נוקלאוטיד באתר צמח השדה. המדגם מזוהה כהלכה כמו שבר גן מטריקס AI. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">כדי לצפות בגרסה בגודל מלא של תמונה זו, לחץ כאן.</a> <img alt="משלים איור 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" /> איור משלים S1. להקות של דגימות נבחר נכרת מן ג&#39;ל. תמונה זו נלקח הג&#39;ל מתואר באיור 1 אחרי להקות מועמד בין 200 נ&quot;ב ל -300 נ&quot;ב נחתכו החוצה.

<ol>
	<li>Pulido, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+and+evolution+of+avian+migration.">The genetics and evolution of avian migration.</a> BioScience. 57, 165-174 (2007).</li><li>Bin Muzaffar, S., Ydenberg, R. C., Jones, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza:+An+ecological+and+evolutionary+perspective+for+waterbird+scientists.">Avian influenza: An ecological and evolutionary perspective for waterbird scientists.</a> Waterbirds. 29, 243-257 (2006).</li><li>Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+virulence+of+the+1918+"Spanish"+influenza+virus.">The origin and virulence of the 1918 "Spanish" influenza virus.</a> Proc. Am. Philos. Soc. 150, 86-112 (2006).</li><li>Butler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+flu+goes+global.">Swine flu goes global.</a> Nature. 458, 1082-1083 (2009).</li><li>Normile, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza.+Wild+birds+only+partly+to+blame+in+spreading+H5N1.">Avian influenza. Wild birds only partly to blame in spreading H5N1.</a> Science. 312, 1451-14 (2006).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+dynamics+of+global+H5N1+outbreaks+match+bird+migration+patterns.">Spatio-temporal dynamics of global H5N1 outbreaks match bird migration patterns.</a> Geospat. Health. 4, 65-78 (2009).</li><li>Si, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+factors+influencing+the+spread+of+the+highly+pathogenic+avian+influenza+H5N1+virus+in+wild+birds+in+Europe.">Environmental factors influencing the spread of the highly pathogenic avian influenza H5N1 virus in wild birds in Europe.</a> Ecol. Soc. 15, 26-26 (2010).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+dissemination+of+H5N1+viruses+isolated+during+an+influenza+outbreak+in+migratory+waterfowl+in+Western+China.">Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China.</a> J. Virol. 80, 5976-5983 (2006).</li><li>Gaidet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+viruses+in+water+birds.">Avian influenza viruses in water birds.</a> Africa. Emerg. Infect. Dis. 13, 626-629 (2007).</li><li>Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+in+migratory+birds+and+evidence+of+limited+intercontinental+virus+exchange.">Influenza in migratory birds and evidence of limited intercontinental virus exchange.</a> PLoS Pathog. 3, e167-e167 (2007).</li><li>Parmley, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild+bird+influenza+survey,+Canada,+2005.">Wild bird influenza survey, Canada, 2005.</a> Emerg. Infect. Dis. 14, 84-87 (2005).</li><li>Wallensten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+influenza+A+virus+in+migratory+waterfowl+in+northern+Europe.">Surveillance of influenza A virus in migratory waterfowl in northern Europe.</a> Emerg. Infect. Dis. 13, 404-411 (2007).</li><li>Munster, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+high-throughput+influenza+A+virus+surveillance+studies+of+wild+birds+by+use+of+molecular+diagnostic+tests.">Practical considerations for high-throughput influenza A virus surveillance studies of wild birds by use of molecular diagnostic tests.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 666-673 (2009).</li><li>Latorre-Margalef, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+influenza+A+virus+infection+on+migrating+mallard+ducks.">Effects of influenza A virus infection on migrating mallard ducks.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1029-1036 (2009).</li><li>Runstadler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+RRT-PCR+analysis+and+virus+isolation+to+determine+the+prevalence+of+avian+influenza+virus+infections+in+ducks+at+Minto+Flats+State+Game+Refuge,+Alaska,+during+August+2005.">Using RRT-PCR analysis and virus isolation to determine the prevalence of avian influenza virus infections in ducks at Minto Flats State Game Refuge, Alaska, during August 2005.</a> Arch. Virol. 152, 1901-1910 (2007).</li><li>Evers, D. L., Slemons, R. D., Taubenberger, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+preservative+on+recoverable+RT-PCR+amplicon+length+from+influenza+A+virus+in+bird+feces.">Effect of preservative on recoverable RT-PCR amplicon length from influenza A virus in bird feces.</a> Avian Dis. 51, 965-968 (2007).</li><li>Forster, J. L., Harkin, V. B., Graham, D. A., McCullough, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sample+type,+temperature+and+RNAlater+(TM)+on+the+stability+of+avian+influenza+virus+RNA.">The effect of sample type, temperature and RNAlater (TM) on the stability of avian influenza virus RNA.</a> J. Virol. Methods. 149, 190-194 (2008).</li><li>Kraus, R. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+influenza+surveillance:+On+the+usability+of+FTA+cards+to+solve+biosafety+and+transport+issues.">Avian influenza surveillance: On the usability of FTA cards to solve biosafety and transport issues.</a> Wildfowl. , 215-223 (2009).</li><li>Smith, L. M., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting,+archiving+and+processing+DNA+from+wildlife+samples+using+FTA+databasing+paper.">Collecting, archiving and processing DNA from wildlife samples using FTA databasing paper.</a> BMC Ecol. 4, 4-4 (2004).</li><li>Rogers, C. D. G., Burgoyne, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription+of+an+RNA+genome+from+databasing+paper+(FTA).">Reverse transcription of an RNA genome from databasing paper (FTA).</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 31, 219-224 (2000).</li><li>Rogers, C., Burgoyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+typing:+Storing+and+processing+of+stabilized+reference+bacteria+for+polymerase+chain+reaction+without+preparing+DNA+-+An+example+of+an+automatable+procedure.">Bacterial typing: Storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing DNA - An example of an automatable procedure.</a> Anal. Biochem. 247, 223-227 (1997).</li><li>Fouchier, R. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+influenza+a+viruses+from+different+species+by+PCR+amplification+of+conserved+sequences+in+the+matrix+gene.">Detection of influenza a viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene.</a> J. Clin. Microbiol. 38, 4096-4101 (2000).</li><li>Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Sayers, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GenBank.">GenBank.</a> Nucleic Acids Res. 38, 46-51 (2009).</li><li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes.">Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li><li>Muthukrishnan, M., Singanallur, N. B., Ralla, K., Villuppanoor, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FTA+cards+as+a+laboratory+and+field+sampling+device+for+the+detection+of+foot-and-mouth+disease+virus+and+serotyping+by+RT-PCR+and+real-time+RT-PCR.">Evaluation of FTA cards as a laboratory and field sampling device for the detection of foot-and-mouth disease virus and serotyping by RT-PCR and real-time RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 151, 311-316 (2008).</li><li>Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FTA+filter+paper+for+the+molecular+detection+of+Newcastle+disease+virus.">Use of FTA filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus.</a> Avian Pathol. 35, 93-98 (2006).</li></ol>

השמנה, טיפול דגימה של ציפורים נעשו בעקבות החקיקה הארצית אושרו על ידי מועצת שוודית החקלאות החיה מחקר ועדת האתיקה.

פרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה משלים מסך דגימות צואה או דומה לנוכחות של AIV. הוא תוכנן במיוחד כדי להפוך אוסף מדגם מהירה וקלה. זה מאפשר לאנשים מיומנים פחות, כמו ציידים או מנהלי טבע, לתרום מעקב AI. אין רשתות מגניב צריך להיות מיושם, למרות הקפאת דגימות מומלץ במידת האפשר. כמה ימים של בטמפרטורת החדר, למשל במהלך ההובלה למעבדה, לא היו בעיה של מולקולות RNA על כרטיסי FTA, כל עוד כרטיסים נותרו יבשות. אחרים ללא כוונת מקורר מערכות אחסון מוערכים כיום על ידי קהילת המחקר, כגון אלכוהול 15 או 16 guanidine, דורשים הסדרים משלוח מיוחד בשל אופיו מסוכנים שלהם. לעומת זאת, השיטה כרטיס FTA אינו מחייב משלוח של חומרים מסוכנים. עם זאת, אחר בינוני אחסון מעניין בהקשר זה הוא RNAlater ™ זה לא מסוכן, או 17. ניתוח לדוגמה יכול להתבצע במעבדה כל מולקולרי רגיל. אין ציוד מיוחד אחר מאשר כרגיל PCR תגובות וסדר נימי היה צורך. כל השלבים יכול להתבצע ללא רמה biosafety כי כבר אוסף המדגם סוכני פתוגניים פוטנציאל היו מומת על ידי פעילות נגד חיידקים נגיפים של כרטיס FTA. חוצה זיהום ובעקבות דגימות חיוביות כוזבות לא נצפו בניסויים שלנו עם דגימות צפור פראית. עם זאת, כאשר עובדים עם RNA ו-PCR זה תמיד רצוי להקדיש תשומת לב מיוחדת לנקות מקומות עבודה בחדרים נפרדים עבור שלבים לפני ואחרי-PCR. עבודה במנדף עשן מקטין את הסיכון של זיהום אירוסול במעבדה. Pipetting צריך להתבצע עם טיפים הסינון. ממחקר קודם על דגימות שנלקחו בעת ובעונה אחת מן ברווזים אותו אנו יודעים כי שישה מתוך 84 דגימות היו חיוביות ידי RealTime המסורתי RT-PCR שיטה 24 והערכים Ct מ RealTime RT-PCR ידועים. שתי דגימות חיוביות זוהה על ידי גזע השיטה שלנו ברווזים שהיו ערכים Ct &lt;30 (המעיד על ריכוז גבוה של רנ&quot;א נגיפי). ארבע הדוגמאות האחרות אשר היו חיוביות עם פרוטוקול המסורתי היו לערכים Ct&gt; 30 (מרוכז פחות) לא יכול להיות מזוהים על ידי פרוטוקול שלנו. דגימות נגיף רק עם titers גבוהה יחסית היו חיוביות assay שלנו, סביר להניח כי הרגישות של השיטה היה מקור הכישלון כדי לזהות את כל דגימות חיוביות. יתר על כן, גודל המדגם במחקר הנוכחי היה נמוך מאוד ואת השיטה ניתן לפתח לחלוטין להעריך אם ניסויים מבוקרים יותר קפדני מתבצעות. עם זאת, אם אלה היו דוגמאות שנאספו באזור מרוחק, ניתוח מסורתי לא היה אפשרי בכלל. בנוסף, אלה התוצאות הראשונות נובעות ניסויי פיילוט אשר צריך אופטימיזציה נוספת. תקופה של שנתיים אחסון בתוך מקפיא רגיל -20 ° C לאחר איסוף דגימת כנראה השפיע גם על האיכות של רנ&quot;א נגיפי. זו השפלה אפשרי RNA הוא נושא חשוב בהתמודדות עם אחסון בטמפרטורת חדר של וירוסים מומת. דוגמאות מאוחסנים נוזלים חלופה כאמור סובלים השפלה משמעותי אשר משפיע על ניתוח מותח יותר של הגנום הויראלי 16. אמנם לא נבדק במחקר שלנו, כרטיסי FTA הוכיחו להיות מתאים גם כדי לשמור על שלמות מולקולות RNA אחרות מערכות רנ&quot;א דומים מאוד נגיפי שפעת העופות 25, 26.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב או מכשיר </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> פלסטיק זהורית יבש ספוגית </td><td> קופאן, איטליה </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> כרטיס FTA </td><td> Whatman </td><td></td><td> כמה אפשרויות </td></tr><tr><td> האריס מיקרו אגרוף 2mm עם מחצלת </td><td> Whatman </td><td> 1154409 </td><td></td></tr><tr><td> RNase חינם 96well צלחת </td><td> גריינר Bio-One </td><td> 652290 </td><td> או דומה </td></tr><tr><td> קים דיוק מגבונים </td><td> Kimtech </td><td> 75512 </td><td></td></tr><tr><td> RNA פתרון מהיר החילוץ </td><td> Ambion </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX-96 ערכת בידוד נגיפי </td><td> Ambion </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> One-Step RT-PCR גישה למערכת </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> או דומה </td></tr><tr><td> Agarose MP </td><td> רוש </td><td> 1388991001 </td><td> רב תכליתי agarose </td></tr><tr><td> טעינת 5x חיץ </td><td> BioRad </td><td></td><td> נמסר עם סולם DNA </td></tr><tr><td> EZ 100 נ&quot;ב לטעון סולם </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> או דומה </td></tr><tr><td> Ethidium ברומיד 1% </td><td> Fluka </td><td> 46067 </td><td> או דומה </td></tr><tr><td> תגובה צינורות 1.5ml </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> או דומה </td></tr><tr><td> Zymoclean ג&#39;ל DNA התאוששות ערכת </td><td> Zymo מחקר </td><td> D4001 </td><td> או דומה </td></tr><tr><td> ABI גדול לצבוע 3.1 כימיה </td><td> Applied Biosystems </td><td></td><td> או דומה </td></tr></tbody></table>

avian influenza surveillance with fta  cards: field methods, biosafety, and transportation issues solved

נגיפי שפעת העופות (AIVs) להדביק יונקים רבים, כולל בני אדם 1. AIVs אלה הם מגוונים המארחים הטבעי שלהם, מחסה כמעט את כל תת ויראלי אפשרי 2. מגיפות שפעת במקור של האדם נובעות AIVs 3. במקרים רבים אדם קטלנית במהלך התפרצויות H5N1 בשנים האחרונות דווחו. באחרונה זן חדש AIV הקשורות ששטפו את האוכלוסייה האנושית, גרימת 4 של מגיפת שפעת החזירים &quot;. למרות סחר אנושי פעילות התחבורה שנראה אחראי להתפשטות של זנים פתוגניים מאוד 5, הפיזור יכול גם לייחס בחלקו ציפורי בר 6, 7. עם זאת, המאגר בפועל של כל זני AIV הוא ציפורי בר. בתגובה זו מול הפסדים מסחרי חמורה בענף העופות, תוכניות מעקב גדול יושמו ברחבי העולם כדי לאסוף מידע על האקולוגיה של AIVs, ולהתקין מערכות התרעה לגילוי זנים פתוגניים מסוימים מאוד 8-12. שיטות מסורתיות דורשות virological וירוסים להיות שלמים מעובדים לפני ניתוח. זה מחייב רשתות קר מחמירים עם מקפיאים עמוק וכבד נהלים biosafety להיות במקום במהלך ההובלה. מעקב לטווח ארוך ולכן הוא מוגבל בדרך כלל תחנות בשדה כמה קרוב במעבדות מצוידות היטב. באזורים מרוחקים ולא ניתן שנדגמו אלא הליכים מסורבלים מבחינה לוגיסטית מיושמים. בעיות אלה הוכרו 13, 14 והשימוש אחסון חלופי ואסטרטגיות תחבורה נחקר (כהלים או guanidine) 15-17. לאחרונה, הציג קראוס ואח&#39;. 18 שיטה לאסוף, לאגור ולהעביר דגימות AIV, המבוסס על נייר מסנן מיוחד. FTA כרטיסים 19 לשמר RNA על בסיס אחסון יבש 20 ו לדקלם פתוגנים פעיל במגע 21. מחקר זה הראה כי כרטיסי FTA יכול לשמש כדי לזהות AIV רנ&quot;א הפוכה שעתוק PCR וכי cDNA וכתוצאה מכך יכול להיות רצף גנים וירוס ונחוש. במחקר של קראוס ואח&#39;. 18 מעבדה לבודד של AIV היה בשימוש, דגימות טופלו בנפרד. בשנת ההארכה שהוצגו כאן, דגימות צואה מן ציפורי בר ממלכודת ברווז על ציפור Ottenby במצפה (SE שוודיה) נבדקו ישירות כדי להמחיש את התועלת של שיטות בתנאי שדה. לתפוס ברווזים אוסף מדגם ידי דגימות ביוב מודגם. פרוטוקול הנוכחית כוללת למעלה דרוג של זרימת עבודה מתוך טיפול צינור אחד לעצב 96-היטב. למרות רגיש פחות מאשר שיטות מסורתיות, שיטת FTA כרטיסי מספק תוספת מצוינת תוכניות מעקב גדולים. היא מאפשרת איסוף וניתוח של דגימות מכל מקום בעולם, ללא צורך בשמירה על שרשרת מגניב או תקנות הבטיחות לגבי משלוח של חומרים כימיים מסוכנים, כגון אלכוהול או guanidine.

Watch this Scientific Journal Video about Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved at JoVE.com

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

שיטה לשמר, לזהות רצף הרנ&quot;א מפני וירוסים שפעת העופות היה תוקף המורחבת באמצעות דגימות צואה טבעיים ציפורים. טכניקה זו מסירה את הצורך של שמירה על שרשרת מגניב וטיפול וירוסים זיהומיות ניתן ליישם תוכנית ההתקנה של תפוקה גבוהה 96-היטב.

מעקבים שפעת העופות FTA עם כרטיסי: שיטות שדה, biosafety, וסוגיות התחבורה נפתר

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

avian-influenza-surveillance-with-fta-cards-field-methods-biosafety

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K Views.  Wageningen University. שיטה לשמר, לזהות רצף הרנ"א מפני וירוסים שפעת העופות היה תוקף המורחבת באמצעות דגימות צואה טבעיים ציפורים. טכניקה זו מסירה את הצורך של שמירה על שרשרת מגניב וטיפול וירוסים זיהומיות ניתן ליישם תוכנית ההתקנה של תפוקה גבוהה 96-היטב.

Video: Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Rapid Diagnosis of Avian Influenza Virus in Wild Birds: Use of a Portable rRT-PCR and Freeze-dried Reagents in the Field

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory flyways. Sampling of wild birds for avian influenza virus (AIV) is often conducted in remote regions, but results are often delayed because of the need to transport samples to a laboratory equipped for molecular testing. Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (rRT-PCR) is a molecular technique that offers one of the most accurate and sensitive methods for diagnosis of AIV. The previously strict lab protocols needed for rRT-PCR are now being adapted for the field. Development of freeze-dried (lyophilized) reagents that do not require cold chain, with sensitivity at the level of wet reagents has brought on-site remote testing to a practical goal.
Here we present a method for the rapid diagnosis of AIV in wild birds using an rRT-PCR unit (Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device or RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT) that employs lyophilized reagents (Influenza A Target 1 Taqman; ASAY-ASY-0109, Idaho Technologies). The reagents contain all of the necessary components for testing at appropriate concentrations in a single tube: primers, probes, enzymes, buffers and internal positive controls, eliminating errors associated with improper storage or handling of wet reagents. The portable unit performs a screen for Influenza A by targeting the matrix gene and yields results in 2-3 hours. Genetic subtyping is also possible with H5 and H7 primer sets that target the hemagglutinin gene.
The system is suitable for use on cloacal and oropharyngeal samples collected from wild birds, as demonstrated here on the migratory shorebird species, the western sandpiper (Calidrus mauri) captured in Northern California. Animal handling followed protocols approved by the Animal Care and Use Committee of the U.S. Geological Survey Western Ecological Research Center and permits of the U.S. Geological Survey Bird Banding Laboratory. The primary advantage of this technique is to expedite diagnosis of wild birds, increasing the chances of containing an outbreak in a remote location. On-site diagnosis would also prove useful for identifying and studying infected individuals in wild populations. The opportunity to collect information on host biology (immunological and physiological response to infection) and spatial ecology (migratory performance of infected birds) will provide insights into the extent to which wild birds can act as vectors for AIV over long distances.

This study describes diagnosis of avian influenza in wild birds using a portable rRT-PCR system. The method takes advantage of freeze-dried reagents to screen wild birds in a non-laboratory setting, typical of an outbreak scenario. Use of molecular tools provides accurate and sensitive alternatives for rapid diagnosis.

אבחון מהיר של וירוס שפעת העופות בעופות בר: שימוש ניידים rRT-PCR ו מיובשים בהקפאה ריאגנטים בתחום

Wild birds have been implicated in the spread of highly pathogenic avian influenza (HPAI) of the H5N1 subtype, prompting surveillance along migratory ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or specific treatments for the disease caused by these viruses, and work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories, significantly limiting the research on these viruses. Lifecycle modeling systems model the virus lifecycle under biosafety level 2 conditions; however, until recently such systems have been limited to either individual aspects of the virus lifecycle, or a single infectious cycle. Tetracistronic minigenomes, which consist of Ebola virus non-coding regions, a reporter gene, and three Ebola virus genes involved in morphogenesis, budding, and entry (VP40, GP1,2, and VP24), can be used to produce replication and transcription-competent virus-like particles (trVLPs) containing these minigenomes. These trVLPs can continuously infect cells expressing the Ebola virus proteins responsible for genome replication and transcription, allowing us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions. Importantly, the viral components of this systems are solely derived from Ebola virus and not from other viruses (as is, for example, the case in systems using pseudotyped viruses), and VP40, GP1,2 and VP24 are not overexpressed in this system, making it ideally suited for studying morphogenesis, budding and entry, although other aspects of the virus lifecycle such as genome replication and transcription can also be modeled with this system. Therefore, the tetracistronic trVLP assay represents the most comprehensive lifecycle modeling system available for Ebola viruses, and has tremendous potential for use in investigating the biology of Ebola viruses in future. Here, we provide detailed information on the use of this system, as well as on expected results.

Work with infectious Ebola viruses is restricted to biosafety level 4 laboratories. Tetracistronic minigenome-containing replication and transcription-competent virus like particles (trVLPs) represent a lifecycle modeling system that allows us to safely model multiple infectious cycles under biosafety level 2 conditions, relying exclusively on Ebola virus components.

דוגמנות מחזור החיים של נגיף האבולה תחת 2 תנאים ברמת בטיחות ביולוגיים עם חלקיקים כמו וירוס המכילים Tetracistronic Minigenomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

שיתוף immunoprecipitation של חלבון העכבר MX1 עם nucleoprotein וירוס השפעת

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.