עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית NHMRC גרנט # 568969 (PSS) ו הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת New South Wales, יוזמת לתאי גזע (KSS).

כל ההנחיות המפורטות להלן מתבצעות באמצעות טכניקות אספטיים בתוך השנייה מחלקה biosafety הממשלה. חומרים כימיים וציוד המשמשים מפורטים בטבלה שלהלן. 1. הכנת אלגינט 1.1% (W / V) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.275 גרם של נתרן אלגינט מטוהרים (glucuronic גבוהה חומצה תוכן ≥ 60%, צמיגות&gt; 200 מגפ&quot;ס S, ו רעלן פנימי ≤ 100 האיחוד האירופי / g) בצינור סטרילי 50 מ&quot;ל ולהוסיף 25 מ&quot;ל פתרון סטרילי ג&#39;לטין 0.1% הכין קודם לכן (0.5g gelatin/500 מ&quot;ל אלפית ש H 2 O ו מומס על ידי מעוקר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערבולת צינור כ 30 שניות כדי להמיס את האבקה חלקית אלגינט ואז למקם את הצינור על מערבל מסלולית ב XG 10 את הלילה (בטמפרטורת החדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 2.778 מ&quot;ל של NaCl סטרילית 9% (4.5 גרם של NaCl/50 מ&quot;ל אלפית ש H 2 O) ל 25 מ&quot;ל של תמיסת אלגינט. המערבולת צינור כ 30 שניות ואחריו צנטריפוגה ב XG 95 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפתרון אלגינט ב 4 °; C לאחסון לטווח קצר (1-2 חודשים) או -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך (כשנה). </li></ol> 2. הכנת אמבט 2 רטיבות CaCl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 14.7 גרם של CaCl 2. 2H 2 O ו - 2.38 גרם של HEPES ב 1 ליטר של אלפית ש H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים את רמת החומציות ל 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטיבות אמבטיה ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר (6-12 חודשים). </li></ol> 3. הכנת Decapsulating פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 500 מ&quot;ל של פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (D-PBS), מוסיפים 50 מ&quot;ל של EDTA 0.5m ו 5 מ&quot;ל של HEPES 1M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר באמצעות מסנן או 0.22 מיקרומטר החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הפתרון decapsulating בטמפרטורת החדר (6-12 חודשים). </li></ol> 4. הכנת סרום החלפת בינוני (SR) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני אנקפסולציה, להכין בינוני SR מראש כמו דהscribed בטבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד. </li></ol> 5. הכנת אינהיביטור רוק (Y-27632) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל Y-27632 אבקת ב 0.1% האנושי סרום אלבומין (HSA) ב D-PBS לעשות פתרון 5 מ&quot;מ. </li></ol> 6. הכנת hESC אנקפסולציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטיפול המקדים תאים עם התקשורת culturing השלימו עם 10 מיקרומטר של מעכב רוק (RI) במשך שעתיים ב -37 מעלות צלזיוס (הגנה מן האור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הטיפול RI, לשטוף את התאים עם D-PBS פעמיים לסלק את התאים מצלחות תרבות enzymatically עם accutase 10 דקות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד את התאים עם פיפטה מגרד או תא ולאסוף בצינור 15 מ&quot;ל. לנטרל את accutase עם המדיום SR ביחס 1:1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את ההשעיה תא בודד, לסנן את התאים מנוטרלים באמצעות מסנן 40 מיקרומטר ולאסוף ב צינור צנטריפוגות טרי 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המספר הכולל של תאים בתמיסה באמצעות hemacytometer. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה ההשעיה התא XG 95 דקות 5 ובזהירות לבטל supernatant לאחר מכן. שוטפים את התאים עם מחומם מראש NaCl 0.9%. סרכזת XG 95 דקות 5 וזורקים supernatant. </li></ol> 7. אנקפסולציה של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מזרק 1 מ&quot;ל מחובר צינור פלסטיק רך של 14 גר קטטר X 2 ד &quot;. זה משמש לשאוב ההשעיה התא להיות טעון על משאבת מזרק כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את התאים עם פתרון מחומם מראש אלגינט בצפיפות של 1.25 מיליון תאים / מ&quot;ל ​​אלגינט. מערבבים בעדינות עם מזרק ולמנוע יצירת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת גנרטור חרוז, משאבת מזרק מד זרימת אוויר, כפי שמוצג באיור 1. פרטים נוספים של מכשירים אלה מוצגים לפי טבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם התאים aspirated לתוך מזרק, לבטל את צינורות הפלסטיק של קטטר IV ולצרף את המזרק מכונת אנקפסולציה. ודא כי קיים פער 10 ס&quot;מ להיות<html> tween בסופו של המכונה אנקפסולציה ונקודת איסוף כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמצת את התאים על ידי הגדרת משאבת מזרק בשיעור 20 מ&quot;ל אוויר / שעה, הזרימה ב L 8 / דקה ואת הלחץ של kPa 100 (בגודל של קפסולות ניתן לשנות על ידי שינוי קצב זרימת אוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים כמוס לתוך צלחת פטרי (100 x 15 מ&quot;מ) מלא 20 מ&quot;ל של אמבטיה מחומם מראש משקעים דקות 7 לייצב את הכמוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים כמוס על ידי שאיפה עדינה לתוך 50 מ&quot;ל צנטריפוגות מבחנות מלאות 20 מ&quot;ל של 0.9% NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הכמוסות להתיישב לתוך החלק התחתון של הצינור ואז להשליך בעדינות supernatant. חזור על תהליך הכביסה עם NaCl 0.9%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים הגלום בינוני מחומם מראש culturing השלימו עם RI (10 מיקרומטר), להעביר לתוך הבקבוק תרבות מודגרות ב 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol> 8. דיפרנציאציה של hESC Encapsulated כדי DA נוירונים ve_content &quot;&gt; hESC Encapsulated מטופלים עם RI במשך 3 ימים לפני בידול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע העכבר קו סטרומה התא, PA6 תאים בצפיפות של 1.0 x 10 4 ל 2 ס&quot;מ ב 0.1% ג&#39;לטין מצופה T75 בקבוק ומצבו את PA6 תאים בינוניים בידול התובע עצבית (טבלה חומרים) 24 שעות לפני בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הכמוסות לצינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל ולאפשר להם להתיישב לתוך החלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק supernatant ו resuspend את הכמוסות במדיום PA6 DA תא ממוזג בידול עצבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות hESC במארז עם monolayer PA6 תאים (9 x 10 6 hESCs ל 7.5 x 10 5 PA6 תאים) במשך 28 ימים עם שינוי המדיה ביום 4 וכל כמה ימים לאחר מכן (לשנות רק מחצית בינונית בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 שבועות בתרבות עם PA6 תאים, להשלים את המדיום התובע בידול עצבית עם 100 ng / mL ששש ו 100 ng / mL FGF8a שבוע הנותר. </li&gt; </ol> 9. Decapsulation של hESC Encapsulated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הכמוסות לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל ולאפשר להם להתיישב בחלק התחתון של הצינור. לאחר מכן לבטל את supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הכמוסות עם D-PBS פעמיים. בואו הכמוסות להתיישב בחלק התחתון של הצינור ולאחר מכן להסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל פתרון decapsulating על קפסולות. מערבבים את ההשעיה באופן יסודי באמצעות שאיפה לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך 4-5 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה תאים decapsulated XG ב 95 דקות 3 וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התא גלולה עם D-PBS ואחריו צנטריפוגה XG ב 95 דקות 3. חזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים decapsulated יכול להיות מתורבת יותר כמו monolayer או להשתמש בהם ניתוח במורד הזרם. </li></ol> 10. נציג תוצאות הקוטר של microcapsules אלגינט הוא 400-500 מיקרומטר. מספר התאים בתוך הקפסולה היתה estimatאד על ידי חישוב המספר הכולל של תאים מחולק במספר הכולל של קפסולות בכל ריצה. לכן, כ 5.0 x 10 4 תאים בכל כמוסה הוערך. מכאן, אנו מעריכים כי המספר המרבי של הקפסולה תאים יכול להכיל הוא כ 1.0 x 10 5. הכדאיות של hESC במארז הוא&gt; 80% (איור 2) כפי שנקבע על ידי שימוש באמצעות diacetate carboxyfluorescein succinimidly אסתר (CFDA) / יודיד propidium (PI) assay. אנחנו מותאם לתנאי אנקפסולציה hESC ידי הפחתת ריכוז אלגינט מ 2.2% עד 1.1% ועל ידי שינוי אמבטיה המשקעים בריום כלוריד כדי סידן כלוריד. מתוך תנאים אלו, אנו מראה כי רק את התאים אשר היו ארוזים עם אלגינט סידן 1.1% הצליחו לשרוד, להתרבות וליצור EBS במבחנה 1. כדי לייעל עוד יותר את המצב, ההשפעות של המדיה culturing ו RI, Y-27632 נחקרו. הנתונים כפי שהוצגו באיור 2 ו 3 מראים כי prevente RIד דיסוציאציה הנגרמת אפופטוזיס ומתוחזק על כדאיות התא והיווצרות אשכול לקדם 1,6. יתר על כן, את הכדאיות של hESC Encapsulated בתרבית RI + hFF-CM היה גבוה באופן משמעותי מאשר קבוצות אחרות ללא תוספת RI, אך זה לא היה שונה באופן משמעותי hESC Encapsulated בתרבית RI + SR. כמו כן, התפשטות תאים באמצעות assay BrdU עלה מ 25% עד 75% כמו תאים בודדים התפתח אשכולות (איור 3). Assay אפופטוזיס על ידי TUNEL גילה כי תאים בודדים microcapsules בתרבית בינוני SR היו אפופטוטיים (מידע לא מוצג) ואילו אשכולות שנמצאו CM-hFF היו שליליות בעיקר TUNEL. במידה מסוימת, hFF ס&quot;מ בתוספת bFGF גם קידם הישרדות ריבוי hESCs הגלום בהיעדר Y-27632. עם זאת, הטיפול ב-Y לפני 27,632 (2 שעות) ואחרי אנקפסולציה (למשך 4 ימים נוספים) משופרת במידה ניכרת, הכדאיות שגשוג היווצרות אשכול hESC Encapsulatedב microcapsules אלגינט 1.1% סידן. בעבר הראינו כי hESC במארז יכול להיות מובחן בהצלחה האנדודרם סופי 1. כאן בדקנו את היישום של אנקפסולציה תא כפלטפורמה 3D להבדיל hESC Encapsulated בתוך הנוירונים התובע. hESC, שיצר גופים embryoid (EB) בכמוסות היו ישירה מבודל על decapsulation בתנאים המתוארים הראו מורפולוגיה עצבית מתקדמת (איור 4) לאחר 2-3 ימים של תרבות עם כדאיות יותר מ 90%. ניתוח Gene הביטוי הראה את ויסות של סמן pluripotent, OCT4 תוך ציון neuroprogenitor, PAX6 ו סמן התובע העצבית, TH עלו ב-מוסדר לאחר 7 ימים של בידול (5 א &#39;איור). מכתים Immunofluorescent גילה כי hESC הבדיל היו PAX6 חיובי (&gt; 80%), אך OCT4 שלילית ביום 7. HESC מובחן נוסף הראה TH-חיוביות (&gt; 90%) נוירונים לאחר 21 יום (5 ב איור). ניתוח המערבי כתם הראה גםאת ויסות הביטוי TH מיום 14 (איור 5 ג) תוך PAX6 הביטוי היה למטה מוסדר אחרי יום 21. לעומת זאת, התאים בתרבית תחת סביבת דו ממדי (2D) בתנאים דומים (למשל RI לפני הטיפול 2 שעות ו RI שלאחר הטיפול במשך 3 ימים לפני התמיינות) שמר על אחוז גבוה של תאים PAX6 חיובי (&gt; 80 %) במשך כל תקופת בידול ולא היו יעילים כמו הבחנה כדי TH-חיוביות תאים (&lt;60%) כמו בסביבת 3D מסופק על ידי אנקפסולציה (איור 5 א &#39;ו - ג&#39;).

<ol>
	<li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm.">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li><li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation.">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li><li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance.">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li><li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+for+stem+cell+differentiation.">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li><li>Orive, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulation:+promise+and+progress.">Cell encapsulation: promise and progress.</a> Nat. Med. 9, 104-107 (2003).</li><li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled,+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture.">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li><li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells.">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li><li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus.">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li><li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li><li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

מספר מחקרים באמצעות העכבר גזע עובריים לתאים hESC הוכיחו את היתרונות של מערכת התרבות 3D ב biomaterials והנדסת רקמות 2,3. השתמשנו אלגינט microcapsules סידן כפלטפורמה 3D מתאים ללמוד התפשטות hESC והבחנה בהשוואה אלגינט בריום מאז hESC הראו כדאיות גבוהה יותר משמעותית כאשר הגלום אלגינט סי?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות </td></tr><tr><td> אלגינט (Pronova למעלה MVG) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td> glucuronic גבוהה תכולת חומצות ≥ 60%, צמיגות&gt; 200 מגפ&quot;ס S, ו רעלן פנימי &lt;100 האיחוד האירופי / g </td></tr><tr><td> ג&#39;לטין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890-100 גרם </td><td></td></tr><tr><td> 0.9% NaCl </td><td> בקסטר הבריאות </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> סוג J1 חרוז גנרטור </td><td> ניסכו הנדסה בע&quot;מ </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-Phaser מזרק משאבה </td><td> חדש משאבת עידן מערכות בע&quot;מ </td><td> דגם NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi-Flow רפואי flowmeter </td><td> גסקון מערכות</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> מרק </td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td> האדם אלבומין בסרום </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14 גר x 2 &quot;קטטר IV </td><td> Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> נוק אאוט, DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td> עבור SR בינוני (הבסיס) </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> עבור SR בינוני (2 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> נוק אאוט סרום החלפת </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> עבור SR בינוני (20%) </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td> עבור SR בינוני (2.5 U / ml) </td&gt; </tr><tr><td> אינסולין transferrin, סלניום (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 41400045 </td><td> עבור SR בינוני (1x) </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> עבור SR בינוני (0.1 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> MEM פתרון NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> עבור SR בינוני (5 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> גלזגו בינוני Essential Minimum </td><td> Invitrogen </td><td> 11710035 </td><td> עבור בינוני בידול התובע עצבית (הבסיס) </td></tr><tr><td> נוק אאוט סרום החלפת </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> עבור בינוני בידול התובע עצבית (10%) </td></tr><tr><td> נתרן פירובט </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td> עבור בינוני בידול התובע עצבית (1 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> MEM פתרון NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> עבור התובע nבידול בינוני eural (0.1 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> עבור בינוני בידול התובע עצבית (0.1 מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> סוניק הקיפוד (ששש) </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> על בידול התובע עצבית (100 ng / ml) </td></tr><tr><td> גידול פיברובלסטים גורם 8 א (FGF8a) </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 4745-F8-050 </td><td> על בידול התובע עצבית (100 ng / ml) </td></tr></tbody></table>

alginate microcapsule as a 3d platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hesc) to different lineages

בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) הם מתעוררים כמקור חלופה אטרקטיבית עבור טיפול חלופי תא שכן ניתן להרחיב בתרבות הבדיל ללא הגבלת זמן לכל סוגי התאים בגוף. סוגים שונים של biomaterials יש גם שימש בתרביות תאים גזע לספק microenvironment מחקה נישה תא גזע 1-3. זו האחרונה היא חשובה לקידום התא אל התא אינטראקציה, התפשטות תאים, והתמיינות אל שושלות ספציפיות, כמו גם הארגון רקמה על ידי מתן תלת ממדי (3D) סביבת 4 כגון אנקפסולציה. עקרון אנקפסולציה התא כולל המלכוד של תאים חיים בגבולות קרום חדיר למחצה בתרבויות 3D 2. קרומים אלה מאפשרים לחילופי חמצן, חומרי מזון גירויים על פני הממברנות, ואילו הנוגדנים ותאי החיסון של המארח שגודלם עולה על גודל הנקבוביות הקפסולה מודרים 5. הנה, אנחנו מראששלח את הגישה לתרבות להבדיל hESC נוירונים התובע ב microenvironment 3D באמצעות microcapsules אלגינט. יש לנו תרבות שונה התנאים 2 כדי לשפר את הכדאיות של hESC כמוס. הראינו בעבר כי תוספת של p160-Rho הקשורים מעכבי קינאז סליל מפותל, (רוק), Y-27632 ואנושי בינוני העובר פיברובלסטים אוויר החלפת בסרום (hFF-CM) לפלטפורמה 3D משופרת באופן משמעותי את הכדאיות של hESC Encapsulated שבו התאים לידי ביטוי מוחלטות סמן גנים האנדודרם 1. השתמשנו עכשיו זה פלטפורמה להפצת 3D של בידול hESC ויעיל נוירונים התובע. חלבון הגן ניתוחים ביטוי לאחר השלב האחרון של בידול התובע העצבית הראו ביטוי מוגבר של hydroxylase טירוזין (ה &#39;), הסמן של התובע נוירונים,&gt; 100 קפלי לאחר 2 שבועות. החוקרים שיערו כי הפלטפורמה שלנו 3D באמצעות microcapsules אלגינט אולי כדאי ללמוד את התפשטות וביים בידולשל hESC כדי שושלות שונות. מערכת 3D גם מאפשר הפרדת תאים מזין מן hESC במהלך תהליך של התמיינות, וכן יש פוטנציאל בידוד-החיסונית בעת השתלת בעתיד.

Watch this Scientific Journal Video about Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages at JoVE.com

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

יש לנו אופטימיזציה טכניקה מיקרואנקפסולציה כפלטפורמה 3D יעיל להפצת והבחנה בתאי גזע עובריים כדי האנדודרם ואת דופאמין (DA) נוירונים. הוא גם מספק הזדמנות בידוד החיסונית של תאים המארח במהלך ההשתלה. פלטפורמה זו ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים.

אלגינט microcapsule כפלטפורמה 3D עבור ריבוי והתמיינות של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) כדי שושלות שונות

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

alginate-microcapsule-as-3d-platform-for-propagation-differentiation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

16.2K Views.  The University of New South Wales. יש לנו אופטימיזציה טכניקה מיקרואנקפסולציה כפלטפורמה 3D יעיל להפצת והבחנה בתאי גזע עובריים כדי האנדודרם ואת דופאמין (DA) נוירונים. הוא גם מספק הזדמנות בידוד החיסונית של תאים המארח במהלך ההשתלה. פלטפורמה זו ניתן להתאים את סוגי תאים אחרים.

Video: Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

סיבוב תרבית תאים מערכות התרבות תאים אנושיים: תאים Trophoblast האדם כמודל

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

בונה אלגינט Layered: פלטפורמה עבור Co-תרבות של אוכלוסיות תאים הטרוגניות

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

מיקרוסקופיה מולטי-פוטונית תוך-וינטלית בזמן אמת להדמיית טיפולים ממוקדים באולטרסאונד ובמיקרו-חלוק כדי להגביר את חדחול מחסום הדם-מוח

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

במבחנה אינדוקציה של תאי גזע עיסת שיניים אנושית לכיוון שושלות הלבלב

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...