ברפואה רגנרטיבית, פרוטוקול חזק של התברואה של תאי גזע פלוריפוטנטיים כלפי סוג תא עצבי מסוים הוא כלי רב ערך. במקרה שלנו, פרוטוקולים אלה היו מאוד שימושי ללמוד הן התפתחות גליובלסטומה ומחלת פרקינסון. אז קודם, הדור של אורגנואיד תלת מימדי יש את היתרון של חיקוי הדוק התפתחות פיזיולוגית, וגם את הייצור של נוירוספרות כיול גודל מתאים גזע pluripotent יש רבייה גבוהה.
ההליך הבא יוכח על ידי מנון לוקטלי, דוקטורנט מהמעבדה שלנו. 24 שעות לפני תחילת תרבות תלת-מימד, החלף את מדיום hESC במדיום נטול סרום בתוספת מעכבי רוק 10 מיקרומולרים. התאים צריכים להיות ב- 60%confluency.
למחרת, לנתק מושבות hESC כתאים בודדים על ידי הסרת המדיום ושטיפה עם סידן ומגנזיום חינם PBS. לאחר מכן, מוסיפים חמישה מיליליטר של פתרון פירוק אנזימטי ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 עד 2 דקות. לאחר מכן, לאסוף את התאים במדיום ללא סרום עם מעכבי רוק 10 מיקרומולרי צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.
לאחר צנטריפוגה, לבדוק את הגודל של גלולת התא. הסר את supernatant ולסופר את התאים ב 10 מיליליטר של מדיום ללא סרום בתוספת מעכבי רוק 10 מיקרומולר. במקביל, לשטוף את צלחת microwell עם שני מיליליטר של מדיום ללא סרום ל הבאר צנטריפוגה הצלחת ב 1, 200 פעמים גרם במשך חמש דקות כדי להסיר את כל הבועות על מנת למנוע היווצרות נוירוספרה.
לאחר מכן, הכינו 28.2 מיליון תאים ב-12.5 מיליליטר של מדיום נטול סרום בתוספת מעכבי רוק 10 מיקרומולריים. לוותר על 1,000 תאים למיקרווול. צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים g במשך חמש דקות ולבדוק את ההפוגה הומוגנית של תאים בצלחת microwell תחת מיקרוסקופ.
מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, לבחון את צלחת microwell כדי לבדוק את הגודל של כדורים שנוצרו בכל microwell. מעבירים את הכדורים לצלחת שש בארות באמצעות המדיום בתוספת קוקטייל עיכוב SMAD כפול כדי לקדם אינדוקציה עצבית מהירה.
מצעד זה ואילך, הספירות מתורבתות בסיבוב ב-60 סל"ד כדי למנוע מהן להידבק זו לזו או לצלחת. ביום הראשון עד הרביעי, לשנות את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים לפני ביצוע אינדוקציה עצבית. מהיום הרביעי עד ה -11, לקדם התפשטות של רוזטות עצביות hESC נגזר על ידי הוספת EGF ו bFGF ב 10 ננוגרם למיליליטר למדיום B27 בתוספת קוקטייל SMAD כפול.
מיום 11 עד 13, תרבות הספירות ב B27 בינוני בתוספת 0.5 מעכב BMP מיקרומולר. מיום 13 עד 21, תרבות הספירות ב B27 בינוני בתוספת GDNF ו BDNF ב 10 ננוגרם למיליליטר ומעכב גמא-secretase מיקרומולר אחד. ביום 21, מניחים צלחת תרבות אחת להוסיף באר אחת של צלחת שש בארות חדשה.
לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של B27 בינוני בתוספת גורמי גדילה ומעכבים לכל גם מתחת לתוספת הממברנה. לאחר מכן, צלחת הכדורים על קרום PTFE הידרופילי שהופקד על צלחת תרבות להוסיף ולשנות את המדיום כל יומיים עד שלושה במשך שלושת השבועות הבאים של בידול. הפסק את הסיבוב בשלב זה.
נוכחותם של רוזטות מצביעה על התחלת ההתברלות העצבית. מיום 21 עד 25, לטפח אורגנואידים עצביים אנושיים באותו מדיום התבגרות עצבית. לאחר מכן, מהיום 25 עד 28, רק להשלים B27 בינוני עם מעכב גמא-secretase מיקרומולר אחד.
מיום 28 עד 39, להפסיק להוסיף את מעכב גמא-secretase ולהמשיך את התרבות האורגנואידית העצבית האנושית במדיום B27 בלבד. לאחר שלושה שבועות, אורגנואידים עצביים מוכנים לשימוש עבור השתלת GIC. ביום אפס, הגבר את ה- hESCs בתרבות דו-מיתת עד 60%confluency.
לאחר מכן, החלף את מדיום תאי הגזע המשמש לשמירה על תכונות pluripotency של hESCs עם מדיום ללא סרום המכיל קוקטייל עיכוב SMAD כפול כדי להתחיל אינדוקציה עצבית מעכבי רוק 10 מיקרומולרי כדי להגדיל את שיעור ההישרדות של תאים במהלך המעבר למחרת. ביום הראשון, להכין את צלחת microwell עם 2.5 מיליליטר לגם של מדיום ללא סרום המכיל את אותו ריכוז של מעכבי רוק ומולקולות עיכוב SMAD כפול. כדי להבדיל בין תאים לכיוון תבנית הגחון של הצינור העצבי, הוסף SHH ו- FGF8 ב- 100 ננוגרם למיליליטר ושני מיקרומולרים אגוניסט החלקה.
לאחר הוספת המדיום, צנטריפוגה הצלחת ב 1, 200 פעמים גרם במשך חמש דקות כדי להסיר בועות אוויר מן microwells. לאחר צלחת microwell מוכן לשימוש עם בינוני מ בידוי למחצה, להסיר את המדיום של hESCs ולשטוף במהירות עם סידן ומגנזיום כלורי ללא PBS. נתק את המושבות להשעיה חד-תאית על-ידי הוספת 7.5 מיליליטר של פתרון אנזימטי רקומביננטי בבקבוק T75.
דגירה התאים במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן להוסיף 7.5 מיליליטר של DMEM F12. לאחר מכן, לאסוף את ההשעיה התא צנטריפוגה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את העל-טבעי וספיר את התאים באותו מדיום המשמש להכנת צלחת המיקרווול.
התאם את הנפח הבינוני כדי לקבל מתלה תא המאפשר ליצור נוירוספרות המכילות 1,000 תאים למיקרווול על ידי הכנת 4.7 מיליון תאים ב 2.5 מיליליטר של מדיום, והוספתו 2.5 מיליליטר הקודם של בינוני כבר ממוקם בצלחת. על מנת להפיץ כראוי את התאים בכל מיקרווול, לנער בעדינות את הצלחת צנטריפוגה אותו ב 300 פעמים גרם במשך חמש דקות. לאחר מכן, הדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות כדי ליצור כדורים.
ביום השני, שוטפים בעדינות את המיקרווולים במדיום ומעבירים את הכדורים בצלחת שש בארות שטופלה ברקמות. מניחים את הכדורים בסיבוב על 37 מעלות צלזיוס ולשנות חצי המדיום עם מדיום טרי כל יומיים עד שלושה ימים. ביום השלישי עד ה -13, כדי לשפר אינדוקציה עצבית ולהמיר אבות עצביים עם זהות midbrain, להשלים את המדיום עם מעכבי GSK-3-בטא שלושה מיקרומולריים.
לפצל את המדגם לשתי צלחות חדשות שטופלו ברקמות שש בארות כדי להפחית את צפיפות הכדור ולהימנע צבירת כדור. ביום השמיני, להתחיל את ההבשלה העצבית על ידי מעבר למדיום חדש עם גורמי גדילה ולשנות את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים. ביום 21, מניחים צלחת תרבות אחת להכניס באר אחת של צלחת שש באר חדשה ולהוסיף 1.2 מיליליטר של מדיום התבגרות עצבית המשמש בידול neurosphere מתחת לתוספה קרום.
לאחר מכן, להדיח את קרום PTFE על צלחת תרבות להוסיף. לבסוף, כדי ליצור את האורגנואיד העצבי, זרע סביב 100 נוירוספרות בתנאי ממשק נוזלי אוויר על קרום PTFE. הפסק את הסיבוב בשלב זה ושנה את המדיום כל יומיים עד שלושה ימים עד להשגת נקודת הזמן הנדרשת של ההידול.
הנה סכמטי של פרוטוקול מתוקן לדור של אורגנואידים עצביים דופאמין. ניתוח immunofluorescence של אורגנואידים עצביים דופאמין המוצגים בתמונות אלה מצביע על תאים אימונוראקטיביים TH דו דיכוי Nurr1, סמן ספציפי midbrain. שני גרפים אלה מייצגים את הקינטיקה של ביטוי גנים TH ו- Nurr1 המוערך על ידי RT-PCR כמותי.
להלן דוגמה לנתונים גולמיים שנרשמו בפלטפורמת MEA. כל ספייק מוצג על ידי קו אנכי ואילו העקבות הנותרים הם רעש. והתמונה הזאת מייצגת נוירוספרה שהופקדה על MEA.
גרפים אלה מציגים את הסופרפוזיציה של קוצים טיפוסיים שזוהו מהנתונים הגולמיים. העקומה השחורה המודגשת מציינת את הממוצע של הקימורים האדומים המתאימים. עלילה זו של רסטר מציגה את חותמות הזמן המשויכות לכל ספייק שזוהה.
הצבעים השונים מדגישים את האלקטרודות השונות. פרוטוקולים אלה מאפשרים לחוקר לענות על שאלה על אינטראקציה בין תאים סרטניים עם אורגנואיד עצבי, כמו גם הקרנה ישירה עם אורגנואיד דופאמין.
