The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouyss&#233;gur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.

1. H + בחירת הריגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שורות תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יציבות transfect תאי nhe הלקויים (למשל, הקו-נגזר CCL39 PS120 תא 16) באמצעות כל שילוב של וקטור ביטוי יונקים ושיטת transfection שיפיק תשואות transfection יעילה ובחירה בשורת תאי פיברובלסטים. הערה: במשך שנים רבות משקעים סידן זרח 19 היה בשימוש עם תשואות transfection טובות. זה הוחלף לאחרונה על ידי חומרים כימיים מסחריים כגון Lipofectamine2000, transfections מתבצע הבא הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלושה פתרונות סטרילי כפי שתוארו להלן. לעקר את הפתרונים הללו על ידי סינון (0.22 מיקרומטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 4 + פתרון Loading NH (pH 7.4) המורכב של 50 מ&quot;מ NH 4 Cl, כלוריד כולין 70 מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, GL 5 מ&quot;מucose ו -15 מ&quot;מ מגבים ב- pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון שטיפה (pH 7.0) המורכב של 120 מ&quot;מ כלוריד כולין, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, גלוקוז 5 מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון שחזור (pH 7.4) המורכב של 120 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתתחיל בבחירה, להשיג תרבית תאי חממה, שניתן להשתמש ב 37 ° C ללא CO 2 נוסף ממכל חיצוני (המכונה CO 2 - חממה &quot;חופשית&quot;), כ5% CO 2 יגרום לחציצה שעלולה לפגוע ב החמצה. להגביר את שורת התאים המבטאת את nhe של ריבית עד לכ 2 x 10 8 תאים (צלחות מ&quot;מ בדרך כלל כ -20 מחוברות 100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H + הריגת הליך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים המבטאים את nhe תאיים של עניין במשך שעה 1 בפתרון הטעינה, בשעה 37 מעלות צלזיוס בחממת -חינם CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון הטעינה ולאחר מכן לשטוף אותם פעמיים בפתרון מתואר השטיפה מעל. לבצע שלב זה ביעילות לחסל Cl השייר תאי NH 4 שיפגע ביצירת מפל + NH 4 תלול שיפיק את החמצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את מדיום השטיפה על ידי שאיפה ודגירת התאים במשך שעה אחת בפתרון התאוששות שוב על 37 מעלות צלזיוס בחממה החופשית CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את ההתאוששות בינונית עם בינוני תרבות קבועה (בדרך כלל DMEM עם 7.5% FCS) ולגדול תאים בתנאי תרבות סטנדרטיים (37 ° C באווירת humidified של 5% CO 2 ו -95% אוויר). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מחזור של בחירה זו פעמיים בשבוע עד שיבוטים יציבים לצוץ. הערה: קח טיפול מיוחד הנוגע לתרבות התא ותנאי בחירה. חודשים של עבודה יכולים להיות הרוסים על ידי כל זיהום שהוא נוטה יותר לoccur לאחר תקופה של תרבות ומניפולציות תא חוזרות ונשנות ארוכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, לבחור אם להגביר את השיבוטים ולאפיין אותם בנפרד כפי שתואר בסעיפים 2-3 נוסף, או בריכה אותם יחד כדי ליצור אוכלוסייה סלולרית לפני האפיון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בחירה מזדמנת (בערך פעם בשבועיים) כדי לשמר את תאי החמצה עמידה על ידי אלה שאולי חזרו לפנוטיפ החומצה רגישה ההורי (איור 1) בחירה לדלפק. </li></ol> 2. מדידות תאיים pH 2.1) הדמיה pH הקרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בratiometric pH רגיש BCECF הצבע / AM ניאון, שהוא רגיש pH כאשר נרגש ב 490 ננומטר והוא בעל נקודת 445 ננומטר isosbestic, הבא הפרוטוקולים של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להשתמש בבדיקות pH רגיש אחרות, הבאים הפרוטוקולים של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש con הדמיה להגדירsisting של מיקרוסקופ הפוך מצמידים את מצלמת וידאו רגישות גבוהה. לצייד את הסט הזה עם 450 ננומטר ומסנני 490 הפרעות להקת ננומטר צרים יחד עם מסננים ניטראלי צפיפות קוורץ המתאים לעירור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת האפשר, השתמש בסט המתאים של מסננים ותנאי תאורה לערכי הקרינה דומים התקנה לλ1 וλ2 כך שהיחס מתקרב 1. כמו כן להימנע ערכי הקרינה בסיסיים שנקבעים גם להרוות או נמוך מדי, הן עבור λ1 ו / או λ2. זה עשוי להניב ממצאים חשובים כמו אז היחס לא היה לגילוי למרות pH תוך התאי משתנה. הערה: מערכת זו צריכה לאפשר זלוף המהיר, עירור הזמן לשגות בשני אורכי הגל הנ&quot;ל ורכישה באורך הגל המתאים הפליטה (535 ננומטר לBCECF). לצייד את המערכת עם תוכנה המאפשרת רכישה אוטומטית של נתונים ואחסון. </li></ol></li></ol> 2.2) מדידה של nhe קדימה פעילות (שחול שלפרוטונים מCytosol) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך לחומצת תאים על ידי דגירה שעה 1 בפתרון NH 4 + טעינה (ראה שלב 1.4) בהעדר CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף BCECF-AM (ריכוז סופי 5 מיקרומטר) לפתרון לחמש דקות האחרונות ולאחר מכן לשטוף אותו עם NH 4 + פתרון טעינה לחסל את החללית תאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר התאים במיקרוסקופ ולקחת כמה תמונות כדי להקליט בסיס יציב. Perfuse פתרון השטיפה (ראה לעיל). התוצאה היא ירידה של הקרינה המתאימה להחמצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייצוב pH, ינקב כל הפתרונות מפורטים להלן למדוד שיעורי החלמה pH בתיווכו של Li + / H +, Na + + / H או K + / H + חליפין. כל פתרון מכיל קטיון צימוד פוטנציאל להיבדק לH + חליפין. אם אחד מאותם מועבר, זה יגרום לעלייה של הקרינה ב495 ננומטר שcorrespond להעלאה בpH התוך התאי: 120 מ&quot;מ LiCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 120 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 125 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 </li></ol> 2.3) מדידה של פעילות הפוכה nhe הערה: העיקרון כאן היא להפוך את מפל ריכוזי יונים הטרנסממברני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני המדידה, לטעון את התאים עם קטיון תאיים של עניין (ראה בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירתם ל5 דקות עם BCECF / AM (ראה שלב 2.2.2); לשטוף אותם, לעלות אותם במיקרוסקופ הווידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse פתרון הטעינה ולקחת כמה תמונות כדי להקליט בסיס יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ייצוב הבסיס, תמונת וריאציות pH כאשר תאי perfused עם מדיום חומציים תאי המכיל 120 מ &#39;כלוריד M כולין, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ MES ב- pH 6.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעינת LiCl, דגירה תאים עבור שעה 2 בפתרון המורכב של 120 מ&quot;מ LiCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4. ליתיום תאיים שנמדד על ידי ספקטרום בליעה אטומי מניב ערך של כ -60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לNa + טעינה, דגירה תאים במשך שעות בפתרון המורכב של 120 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ CaCl 2, 5 גלוקוז מ&quot;מ ו -15 מ&quot;מ בHEPES pH 7.4 בנוכחות ouabain 1 מ&quot;מ כדי לחסום את Na / K ATPase. בתנאים אלה, ריכוז Na + תאיים הוא בטווח של 40 מ&quot;מ. הערה: K + טעינה אין צורך כK + ריכוז cytosolic הוא בטווח של 140 מ&quot;מ ושיפוע K + כלפי חוץ מכוון לכן קל להשגה. </li></ol> 2.4) נתונים טיפול וכיול: הערה: שלב זה חל הן על המדידות קדימה לאחור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של כל ניסוי, perfuse תאים עם פתרון של 140 מ&quot;מ KCl, 20 מ&quot;מ HEPES ו -5 nigericin מיקרומטר המותאם לערכי pH בין 6.5 ו -7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתונים כמו מדידות הקרינה מהתמונות (רמות אפורות המייצגים רמות עצימות) ויצוא תחת פורמט טקסט ולטפל כפי שיוסבר להלן באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ערכי pH תוך תאיים לכל תא או אזור של עניין באמצעות המשוואה הבאה בודדים: pH = pKa דקות + (יומן (R-Rmin) / (R מקסימום -R)) x F (λ2) / F מקסימום (λ2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדקות F (λ2) / x ma F יחס אם יש הלבנת בדיקה או דליפה, וכתוצאה מכך ירידה בקרינת 450 ננומטר ברחבי הניסויים (λ2). זה אולם מאוד לעתים רחוקות נצפה בתנאי שימוש בdesניסויי cribed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנתוני כיול נמצאים בסוף כל מדידת pH, לבדוק אם הערכים מחושבים המקבילים שונים מערכי pH המשמשים לכיול. אם זה המקרה, אז להתאים את כל ערכי ה- pH בניסוי שנקבעו לכיול באמצעות ההליך הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המנה הבאה (Q, את ההבדל בין ערכים / ההבדל נמדד בין ערכי הכיול). הכפל את כל המערך על ידי ש הפוך ההתאמה הסופית על ידי הוספה או גריעה כך שהערכים מחושבים יהיו שווים את ערכי כיול המקביל. </li></ol></li></ol> 3. מדידות של מחירים ראשוניים של NHE7 ידי מהיר Li + ספיג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זרע על צלחות גם רב (6 עד 24 גם) ולהפוך לחומצתם או באמצעות NH 4 + טכניקת ההעמסה שתוארה לעיל או לחלופין nigericin אלבומין בסרום שור החמצה / (BSA) תיארה ב -20. </li><li&gt; צלחות לשטוף פעמיים במהירות באמצעות פתרון השטיפה-שתואר לעיל ולאחר מכן דגירה התאים בפתרונות ספיגה המכילים 1-10 ליתיום מ&quot;מ (מעט מתחת לערכי ק&quot;מ) וריכוזים הרצויים של קטיונים ו / או מעכבים של ריבית לסכום הרצוי של זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על משך ספיגה קצר ועקבי (בדרך כלל דקה אחת או נמוך יותר) כדי להבטיח תחבורה הפועלת בתנאי שיעורים ראשוניים. כמו כן יש לוודא כי כל הפתרונות המשמשים לספיגה הם איזוטוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של זמן הספיגה, לחסל בזהירות בינוני הספיגה ולשטוף את התאים ארבע פעמים עם פוספט קר כקרח שנאגרו (PBS). לבצע שטיפות אלה מהר ככל האפשר (פחות מ -10 שניות לארבעה מהם הוא אידיאליים) כדי למנוע זרימת ליתיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים ב- 25% חומצה חנקתית. החל 250 μl לכל טוב של 25% חומצה חנקתית ולתת לו לשבת במשך שעה לפחות 1, אז גרוטאות היטב עם כל הסוף של קצה פיפטה ולהעביר את כל ההשעיה גם במיל חדשצינור crocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את lysate ב 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב15,000 XG (טמפרטורת חדר) כדי להסיר את הפסולת התאית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את תוכן ליתיום של supernatants ידי ספקטרום בליעה אטומית 21. הערה: חברות שונות מספקות ספקטרומטרים קליטה אטומיים, אשר צריך להיות מצוידים במנורת קתודה חלולה ליתיום. עקוב אחר ההוראות של היצרן מכונה אלה הם מאוד מדויקים, אבל גם די עדינים. </li></ol>

<ol>
	<li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V-type+H+-ATPase+in+vesicular+trafficking:+targeting,+regulation+and+function.">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li><li>Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+and+the+endosomal-lysosomal+pathway:+emerging+roles+of+CLC+chloride+transporters.">Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters.</a> J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).</li><li>Kornak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+a3+subunit+of+the+vacuolar+H(+)-ATPase+cause+infantile+malignant+osteopetrosis.">Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis.</a> Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).</li><li>Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ClC-5+chloride+channel+knock-out+mouse+-+an+animal+model+for+Dent's+disease.">The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease.</a> Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).</li><li>Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+the+chloride+channel+ClC-7+leads+to+lysosomal+storage+disease+and+neurodegeneration.">Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration.</a> Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).</li><li>Poet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+storage+disease+upon+disruption+of+the+neuronal+chloride+transport+protein+ClC-6.">Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).</li><li>Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+Na+/H++exchanger+isoforms+are+distributed+to+Golgi+and+post-Golgi+compartments+and+are+involved+in+organelle+pH+regulation.">Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation.</a> J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).</li><li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC9A6+mutations+cause+X-linked+mental+retardation,+microcephaly,+epilepsy,+and+ataxia,+a+phenotype+mimicking+Angelman+syndrome.">SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome.</a> Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).</li><li>Mignot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+mutation+in+SLC9A6+gene+in+a+patient+with+Christianson+syndrome+and+retinitis+pigmentosum.">Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum.</a> Brain &amp; Development. 35 (2), 172-176 (2013).</li><li>Morrow, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+autism+loci+and+genes+by+tracing+recent+shared+ancestry.">Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry.</a> Science. 321 (5886), 218-223 (2008).</li><li>Lasky-Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+of+the+time+to+onset+of+attention+deficit+hyperactivity+disorder.">Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder.</a> Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).</li><li>Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+studies+in+ADHD.">Genome-wide association studies in ADHD.</a> Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).</li><li>Meda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+scale+multivariate+parallel+ICA+method+reveals+novel+imaging-genetic+relationships+for+Alzheimer's+disease+in+the+ADNI+cohort.">A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort.</a> Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microdeletion+in+Xp11.3+accounts+for+co-segregation+of+retinitis+pigmentosa+and+mental+retardation+in+a+large+kindred.">A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred.</a> Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).</li><li>Sardet, C., Franchi, A., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning,+primary+structure,+and+expression+of+the+human+growth+factor-activatable+Na+/H++antiporter.">Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter.</a> Cell. 56 (2), 271-280 (1989).</li><li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+mutation+abolishing+Na+/H++antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH.">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li><li>Franchi, A., Cragoe, E., Pouyss&#233;gur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+properties+of+fibroblast+mutants+overexpressing+an+altered+Na+/H++antiporter.">Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter.</a> J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intracellular+Na+/H++Exchanger+NHE7+effects+a+Na++coupled,+but+not+K++coupled+proton-loading+mechanism+in+endocytosis.">The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis.</a> Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).</li><li>Wigler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+mammalian+cells+with+genes+from+procaryotes+and+eucaryotes.">Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes.</a> Cell. 16 (4), 777-785 (1979).</li><li>Lacroix, J., Po&#235;t, M., Maherel, C., Counillon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+the+activation+of+the+Na/H+exchanger+NHE-1+by+cytoplasmic+acidification+and+mitogens.">A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens.</a> EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).</li><li>Milosavljevic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenomic+Effects+of+Cisplatin:+Acute+Inhibition+of+Mechanosensitive+Transporters+and+Channels+without+Actin+Remodeling.">Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling.</a> Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).</li><li>Boron, W. F., De Weer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pH+transients+in+squid+giant+axons+caused+by+CO2,+NH3,+and+metabolic+inhibitors.">Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors.</a> J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na+-H++exchange+in+gastric+glands+as+measured+with+a+cytoplasmic-trapped,+fluorescent+pH+indicator.">Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).</li><li>Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+image+processing+of+intracellular+pH+in+gastric+oxyntic+and+chief+cells.">Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells.</a> Nature. 325, 447-450 (1987).</li><li>Quentin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RhBG+and+RhCG,+the+putative+ammonia+transporters,+are+expressed+in+the+same+cells+in+the+distal+nephron.">RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).</li><li>Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+of+NH3+through+the+human+urea+transporter+B:+a+new+gas+channel.">Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבחור תאים לבטא תאית Na + / H + מחליפי בקרום הפלזמה מבלי לשנות הרצף הראשוני שלהם על ידי מוטגנזה מכוונת. ניתן לאפיין מחליפי האלה עכשיו. שיטה זו מבוססת על הרעילות התאית של פרוטונים תאיים כדי לבחור שורו?...

רוב התאים תאיים להציג pH luminal חומציים, שהוא פרמטר מרכזי להתבגרות, סחר, מחזור של חלבונים או הורמונים ונוירוטרנסמיטורים טעינה. הוכח כי שיפוע pH בין תוכן cytosol ולפוחי מופק על ידי H vacuolar + ATPases 1, מצמידים את מובילי כלוריד CLC לפוחי 2. שניהם בנוק-אאוט (KO) עכברים וחולים אנושיים, את החשיבות של מובילים אלה כבר מסומן על ידי פנוטיפים הכבדים הנגרמים על ידי מוטציות בגנים שלהם 3-6. בני משפחת SLC9A מחליפי נתרן-מימן, המכונים גם NHEs לNa + / H + מחליפי, הוכח להיות effectors מפתח בpH התוך התאי ורגולצית נפח תא, כמו גם בתחבורה וקטורים שווים חומצה-בסיס על פני epithelia . חוץ מזה NHEs קרום פלזמה, שלוש שמורים ביותר Na + / H + מחליפי, 6 nhe, 7ו -9 באים לידי ביטוי ברשת טרנס-Golgi ובendosomes מוקדם 7. מוטציות בגנים שלהם נקשרו עם הפרעה כמו-Angelman או כריסטנסן תסמונות 8-9, אוטיזם מבוסס משפחה 10 וקשב וריכוז והיפראקטיביות 11-12. מחליפי אלה גם היו מעורבים בבעיות ניווניות כגון אלצהיימר רגישות מחלה 13 וגנים רציפים פיגור שהכלי X צמוד תסמונות 14. יחדיו, מחקרים אלה מדגישים את החשיבות של NHEs תאיים אלה בהתפתחות מוח ו / או פונקציה. הלוקליזציה תאית של מחליפי אלה מונעת מדידות מדויקות של הסלקטיביות יונם, כיוון תחבורה, פרמטרים הקינטית, ורגולציה. כמו במקרה של כל המובילים באו לידי ביטוי בתאים תאיים, שקשה מאוד להעריך פעילות ביוכימית שלהם ומכאן להבין באופן מלא התפקידים הפיסיולוגיים שלהם וmechanהאיזמים בסיס ההשלכות פתולוגיות שלהם. בהתבסס על ריכוז K + הגבוה cytosolic, ההשערה ביותר המקובלת היו שהם עובדים כמובילי פרוטון בזרימת בשילוב K +. קיומה של נזילה כזו פרוטון ששער, כפי שהוא עשוי לאזן שאיבת פרוטון על ידי V-ATPases על מנת לשמור על pH לפוחי מצב יציב. מטרת מאמר זה היא חזותי (i) להפגין שיטה המאפשרת את הבחירה הגנטית של שורות תאים המבטאות את מובילי לפוחי כזה בקרום הפלזמה שלהם, וכן (ii) להציג שתי גישות עצמאיות כדי למדוד את הפונקציות של מובילים אלה. לפני שלושה עשורים, Pouysségur וFranchi יש חלוץ גישה גנטית שאפשרה שיבוט ואפיון המולקולריים של בני משפחת nhe 15. זו התבססה על הרעילות של פרוטונים תאיים כשיטת הקרנה. הצעד הראשון היה להשיג שורות תאים לקוייםבכל בורסה + / H + Na הביע בקרום הפלזמה, באמצעות ההפיכות של טרנספורטר זה. Fibroblasts (קו תא CCL39) היה מראש עם Na + או Li + ולאחר מכן הניח במדיום תאי חומצי (pH 6.5) עבור שעה 2. זה הוביל למותם של תאים לבטא Na + / H + חילופי פונקציונליים ולבחירה של תאי antiporter לקוי (קו תא PS120) 16. כשטפח במדיום ללא יקרבונט, תאים אלה רגישים מאוד להחמצה תאית אקוטית. כתוצאה מכך, הביטוי של כל מנגנון זרימת פרוטון פונקציונלי בקרום הפלזמה ייבחר באופן חיובי (ראה 17) אם תאים אלה מוגשים לacidifications תאית האקוטי. טכניקות החמצה כזו יכולה לשמש כדי לבודד שורות תאים עם סחר בפגמים המאפשרים ביטוי בכפייה של NHEs תאית WT בקרום הפלזמה. כאוקריוטים Na + / H+ מחליפי הם electroneutral, הם לא ניתנים למדידה על ידי גישות אלקטרו שנוצלו בהצלחה רבה כדי למדוד ערוצים. כתב-יד זה ולכן מדגים כיצד למדוד את הפעילות של מחליפי זה על ידי מדידות pH תוך תאיות וקינטיקה מהירה של ספיגת ליתיום. כמושגי יסוד הם אותו הדבר, זה מעניין לשים לב שרבים מהתהליכים שפותחו עבור סעיף הבחירה משמשים גם ישירות למדידות פונקציונליות. מעניין, יש לנו ציינו כי פגם הסחר הנוכחי בשורות התאים שנבחרו בגישה שתוארה בכתב היד הזה מוביל לביטוי גדול יותר של חלבוני לפוחי אחרים בקרום הפלזמה כגון ערוץ אשלגן לפוחי TWIK1 18. זה מצביע על כיוון הבחירה של מנגנון פגם שימור כללי לחלבונים הטרנסממברני לפוחי. מכאן הליך בחירה זו והתאים שמייצרים מאימהווה כלי מבטיח לקהילה המדעית עובדת על חלבוני הקרום של תאים תאיים. כמו גם שיטות המדידה שהוצגו כאן עשויות להיות ישימות ללימוד מובילים שאינם electrogenic אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:119px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard cell culture equipement</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Incubator with CO2</td>
			<td style="width:119px;">Sanyo</td>
			<td style="width:119px;">MCO15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Incubator without CO2</td>
			<td style="width:119px;">Heraeus instrument</td>
			<td style="width:119px;">BB6220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laminar flow hood PSM1200NF</td>
			<td style="width:119px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:119px;">52010120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:119px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS gold</td>
			<td style="width:119px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin/streptomycin</td>
			<td style="width:119px;">PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin 10X</td>
			<td style="width:119px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">L11-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ICE 3500 GFZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LiCl</td>
			<td style="width:119px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">L4408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nitric Acid</td>
			<td style="width:119px;">sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">438073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fluorescence videomicroscopy set</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Composed of many devices with different catalog numbers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted automated microscope</td>
			<td style="width:119px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">DMI6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">microscope stand</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11505180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">incident fluorescence</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11504166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">motor bracket</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11505234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11522106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LED transmission light&#160;</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8097321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">8102034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">motorized plate</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11522068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11531172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11521719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">camera output</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11507807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11541510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">images acquisition/analysis software</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11888375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">optics</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11506203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fluorescence Xenon lamp</td>
			<td style="width:119px;">leica</td>
			<td style="width:119px;">DMI6000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">camera</td>
			<td style="width:119px;">hamamatsu</td>
			<td align="right" style="width:119px;">8100601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">metafluor/Mmfluor software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td align="right" style="width:119px;">11640905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pH sensitive probe, BCECF-AM</td>
			<td style="width:119px;">life technologies</td>
			<td style="width:119px;">B1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nigericin</td>
			<td style="width:119px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N7143</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of na+/h+ exchangers of intracellular compartments using proton-killing selection to express them at the plasma membrane

החמצת endosomal היא קריטית עבור מגוון רחב של תהליכים, כגון מחזור חלבון והשפלה, הפחתת רגישות הקולטן, וטעינת מוליך עצבי בשלפוחית ​​סינפטית. החמצה זו מתוארת בתיווכה של ATPases פרוטון, מצמידים את מובילי כלוריד CLC. מאוד-נשמרים מובילי פרוטוני electroneutral, Na + / H + מחליפי (nhe) 6, 7 ו -9 גם באה לידי ביטוי בתאים אלה. מוטציות בגנים שלהם נקשרו עם מחלות ניווניות קוגניטיביים ואנושיות. באופן פרדוקסלי, את תפקידם להישאר חמקמק, כמו הלוקליזציה תאית שלהם מנעה אפיון פונקציונלי מפורט. כתב יד זה מראה שיטה לפתור את הבעיה הזו. זה כולל את הבחירה של שורות תאים שעברו מוטציה, מסוגלת לשרוד החמצת cytosolic חריפה על ידי שמירת NHEs תאית בקרום הפלזמה. לאחר מכן הוא מתאר שני פרוטוקולים משלימים כדי למדוד את הסלקטיביות היון ופעילותשל מחליפי הבאים: (i) המבוסס על מדידות pH תוך תאיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וידאו, וכן (ii) המבוסס על קינטיקה מהירה של ספיגת ליתיום. ניתן להסיק פרוטוקולים אלה על מנת למדוד מובילים שאינם electrogenic אחרים. יתר על כן, הליך הבחירה שהוצג כאן מייצר תאים עם הפנוטיפ פגום שימור תאיים. לכן תאים אלו יהיו גם להביע את חלבוני קרום לפוחי אחרים בקרום הפלזמה. האסטרטגיה הניסיונית המתוארת כאן עשויה לכן מהווה כלי רב עוצמה פוטנציאלית ללמוד חלבונים תאיים אחרים שלאחר מכן באו לידי ביטוי בקרום הפלזמה יחד עם לפוחי Na + / H + מחליפי המשמשים לבחירה.

בחירה: הבחירה + הורג H מבוססת על דיפוזיה של הבסיס החלש אמוניום, כמתואר באיור 1 א. ההשפעה של בסיסים חלשים ודיפוזיה חומצות על pH תוך התאי כבר חלוצה ידי וולטר בורון ומשתפי פעולה 22. הרעיון האלגנטי להשתמש בתופעה זו כד?...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane at JoVE.c

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

אפיון פונקציונלי של Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; מחליפי של תאיים תאים לשימוש Proton-הרג בחירה לבטא אותם בקרום פלזמה

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

functional-characterization-na-h-exchangers-intracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

9.2K Views.  Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics. The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers. 

Video: Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

קצירה וCryo-קירור גבישים של חלבונים בממברנה גדלו בMesophases Lipidic לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...