The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.

<ol>
	<li>Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Billion+dollar+babies--biotech+drugs+as+blockbusters.">Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters.</a> Nat. Biotechnol. 25 (4), 380-382 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs. , BIO021D (2013).</li><li>Lai, M. C., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+chemical+stability+of+proteins+and+peptides.">Solid-state chemical stability of proteins and peptides.</a> J. Pharm. Sci. 88 (5), 489-500 (1999).</li><li>Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations:+some+practical+advice.">Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice.</a> Pharm. Res. 14 (8), 969-975 (1997).</li><li>Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+stable+lyophilized+protein+formulations:+theory+and+practice.">Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice.</a> Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).</li><li>W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+determination+in+solution+by+NMR+spectroscopy.">Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 265 (36), 22059-22062 (1990).</li><li>Ilari, A., Savino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+structure+determination+by+x-ray+crystallography.">Protein structure determination by x-ray crystallography.</a> Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).</li><li>Brunger, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+crystallography+and+NMR+reveal+complementary+views+of+structure+and+dynamics.">X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics.</a> Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).</li><li>Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amorphous+pharmaceutical+solids:+preparation,+characterization+and+stabilization.">Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization.</a> Adv Drug. Deliv. Rev. 48 (1), 27-42 (2001).</li><li>Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+infrared+spectroscopy+to+monitor+protein+structure+and+stability.">Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability.</a> Expert. Rev. Proteomics. 2 (5), 731-743 (2005).</li><li>Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+solid-state+analysis+of+freeze-dried+protein+formulations+using+NIR+and+Raman+spectroscopies.">Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (7), 2871-2875 (2011).</li><li>Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+determination+of+protein+conformation+in+the+solid+state+using+near+infrared+(NIR)+spectroscopy.">Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy.</a> J. Pharm. Sci. 94 (9), 2030-2038 (2005).</li><li>Pikal, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+state+chemistry+of+proteins:+II.+The+correlation+of+storage+stability+of+freeze-dried+human+growth+hormone+(hGH)+with+structure+and+dynamics+in+the+glassy+solid.">Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid.</a> J. Pharm. Sci. 97 (12), 5106-5121 (2008).</li><li>Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sucrose+level+on+storage+stability+of+proteins+in+freeze-dried+solids:+II.+Correlation+of+aggregation+rate+with+protein+structure+and+molecular+mobility.">Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility.</a> J. Pharm. Sci. 98 (9), 3145-3166 (2009).</li><li>Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+protein+secondary+structure+during+spray-drying+of+antibody/mannitol+formulations.">Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 65 (1), 1-9 (2007).</li><li>Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+mapping+of+a+monoclonal+antibody+against+human+thrombin+by+H/D-exchange+mass+spectrometry+reveals+selection+of+a+diverse+sequence+in+a+highly+conserved+protein.">Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein.</a> Protein. Sci. 11 (6), 1300-1308 (2002).</li><li>Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+mapping+by+amide+hydrogen/deuterium+exchange+coupled+with+immobilization+of+antibody,+on-line+proteolysis,+liquid+chromatography+and+mass+spectrometry.">Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry.</a> Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23 (5), 639-647 (2009).</li><li>Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+based+tools+to+investigate+protein-ligand+interactions+for+drug+discovery.">Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery.</a> Chem. Soc. Rev. 41 (11), 4335-4355 (2012).</li><li>Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+differentially+affect+IgG1+conformation+and+receptor+binding.">Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (8), 1716-1728 (2010).</li><li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies.">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> J. Pharm. Sci. 100 (6), 2071-2086 (2011).</li><li>Dorman, G., Prestwich, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photolabile+ligands+in+drug+discovery+and+development.">Using photolabile ligands in drug discovery and development.</a> Trends. Biotechnol. 18 (2), 64-77 (2000).</li><li>Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoaffinity+labeling+combined+with+mass+spectrometric+approaches+as+a+tool+for+structural+proteomics.">Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics.</a> Expert. Rev. Proteomics. 3 (4), 399-408 (2006).</li><li>Greenspan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humidity+fixed+points+of+binary+saturated+aqueous+solutions.">Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions.</a> Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A (1), 8 (1977).</li><li>Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+1.+Exchange+mapping.">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 718-726 (2012).</li><li>Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+inexpensive+refrigerated+LC+system+for+H/D+exchange+mass+spectrometry.">An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22 (8), 1472-1476 (2011).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy:+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis.">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic. Acids. Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li><li>Sophocleous, A. M., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+hydration+in+lyophilized+myoglobin+by+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry.+2.+Exchange+kinetics.">Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics.</a> Mol. Pharm. 9 (4), 727-733 (2012).</li><li>Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+Protein+Aggregation+during+Storage+in+Lyophilized+Solids+Using+Solid+State+Amide+Hydrogen/Deuterium+Exchange+with+Mass+Spectrometric+Analysis+(ssHDX-MS).">Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS).</a> Mol. Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals.">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).</li><li>Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+buffer+composition+and+processing+conditions+on+aggregation+of+bovine+IgG+during+freeze-drying.">Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying.</a> J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein+structure+in+amorphous+solids+using+hydrogen/deuterium+exchange+with+mass+spectrometry.">Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 366 (1), 18-28 (2007).</li><li>Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+conformation+in+amorphous+solids+by+FTIR+and+by+hydrogen/deuterium+exchange+with+mass+spectrometry.">Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry.</a> Biophys. J. 95 (12), 5951-5961 (2008).</li><li>Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolytic+labeling+to+probe+molecular+interactions+in+lyophilized+powders.">Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders.</a> Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).</li><li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (81), e50839 (2013).</li><li>Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H/D+exchange+and+mass+spectrometry+in+the+studies+of+protein+conformation+and+dynamics:+is+there+a+need+for+a+top-down+approach.">H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach.</a> Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).</li><li>Jumper, C. C., Schriemer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+laser-initiated+carbene+reactions+for+protein+topographic+analysis.">Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis.</a> Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+excipients+on+protein+conformation+in+lyophilized+solids+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).</li><li>Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+and+calcium+exert+site-specific+effects+on+calmodulin+conformation+in+amorphous+solids.">Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids.</a> Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מספר מחקרים הראו כי הסביבה המקומית בדגימות lyophilized משפיעה פירוק חלבונים 5,29,30. עם זאת, הקמת מערכת יחסים ישירים בין מבנה חלבון ויציבות במצב המוצק לא הייתה אפשרית בשל חוסר שיטות אנליטיות ברזולוציה גבוהה. היישום של שיטות קיימות ברזולוציה גבוהה כגון HDX וPL לאבקות lyophilized דורש שינוי של פרוטוקולי פתרון ופרשנות נתונים זהירים. HDX-MS וPL-MS אומצו ברציפות לפקח על תצורות חלבון במצב המוצק. התוצאות שהוצגו כאן ובמקומות אחרים 27,28,31-33 הדגימו את היכולת של שיטות אלה כדי לפקח קונפורמציה חלבון עם רזולוציה גבוהה בסביבה המוצקה. למרות שהשלבים הקריטיים בניתוח הנתונים אינם משתנים מתיוג בפתרון 34-36, שיקולים חשובים בעת התקנה ניסיונית ופרשנות נתונים נדרשים לחמי מצב מוצקתיוג cal. בחירה של מגיב התיוג חייבת להיות מבוססת על גודל ומנגנון של תיוג. הגודל הקטן של דאוטריום מאפשר את עמוד השדרה פפטיד שחקר בקלות, ואילו הגודל גדול יחסית של pLeu מגביל תיוג לצד הרשתות. שני ssHDX וssPL לא מראים העדפה לכל חומצת אמינו, כך שהתיוג תלוי רק בעמוד השדרה וצד-שרשרת חשיפה למטריצה. לחקור ביעילות תצורות חלבון במצב מוצק, הגורמים החיצוניים המשפיעים על תהליך התיוג חייבים להיות מבוקרים בקפידה. הסכום הכולל ואת הפריסה המרחבית של סוכן תיוג במוצקים lyophilized שונה מתמיסות מימיות. בssHDX, הסכום של D 2 O במטריצה ​​המוצקה עשוי להשפיע על השיעור של חלבון התגלגלות (או התגלגלות חלקי), מקפלים, וחילופי דאוטריום. זה לא המקרה עם הפתרון HDX, שבמדגם החלבון בדרך כלל מדולל עם נפח מספיק של D 2 O.סינון קפדני של ההשפעות של לחות בשיעור ssHDX יכול ליידע את הבחירה של תנאי RH אידיאליים. כדי לשלוט בקצב ספיחת לחות ולמנוע קריסה של האבקה בניסוחים המכילים חומרים בלתי פעיל hygroscopic (למשל סוכרוז וtrehalose), ssHDX עשויה להתבצע בתנאי קירור (2-8 מעלות צלזיוס). המחקר הקודם שלנו על השפעות לחות הראה גדילת שיעור והיקף של חליפין עם עלייה בתכולת לחות, כצפוי. בחלק גדול מהעבודה שלנו, RH ביניים של 43% ב -5 ° C הוכיח להיות אידיאלי להבחין ניסוחים בזמן סביר 24. התגובה מתבצעת בדרך כלל עד שתגיע לרמה. הדבר מבטיח כי ספיחת הלחות ודיפוזיה לתוך מוצק לא שולטים בקצב HDX. השימוש בגדלי מדגם מוצקים קטנים עם מראש lyophilization נפח של ≤2 מיליליטר גם מסייע להבטיח כי ספיחת אדי D 2 O היא למעשה מלאה בתחילת תקופת החליפין. למרות ssHDX-MS מספקמידע כמותי על קונפורמציה של חלבון במצב מוצק, יש תנאים מסוימים שבם פרשנות של נתונים אינן יכולה להתבסס אך ורק על מחקר ssHDX לבד. זה אפשרי כי ספיגת דאוטריום ירד נצפתה במדגם (בהשוואה לקבוצת ביקורת) יכולה להיות בגלל השימור גבוה יותר של מבנה חלבון או הכמות המשמעותית של אגרגטים חלבון בדגימה. במקרה כזה, פרשנות של נתונים ssHDX דורשת תוצאות משיטות משלימות אחרות. הרחבת שיא בספקטרום המוני deuterated נצפתה במשך כמה ניסוחים Mb 27,28. זה יכול להיות בגלל גורמים שונים כמו הנוכחות של אוכלוסיית חלבון מקופלת באופן חלקי, ההטרוגניות המרחבית במדגם, או הדרגתיים המרחבית בריכוז D 2 O. עם זאת, גורמים אלה לא הבחינו בssHDX-MS וזקוק לחקירה נוספת. כssPL-MS הוא חדש יחסית בהשוואה לשיטות אחרות, למידה מתמשכת abאת היישומים ואת מגבלותיו נדרש. בssPL, התמונה צולבת-מקשר הוא lyophilized עם החלבון. חוסר הלחות מגביל את הניידות של רכיבים בתוך המטריצה ​​המוצקה, וההרפיה המבנית החלקית שעלולות להתרחש עם ספיחת לחות בssHDX אינה תופעה בssPL. זה מגביל תיוג בssPL לסביבה הקרובה של התמונה צולבת-מקשר. עם זאת, בניגוד לHDX-MS, ניתוח MS / MS של החלבון הנקרא קוולנטית יכול לספק מידע מבני ברמת שאריות. מאז תיוג ssPL הוא קוולנטיים ובלתי הפיך, חזרה בורסה אינה מתרחשת וניתן להכין דגימות וניתחו ללא חשש לאובדן של תווית. כדי להקל על דיפוזיה של סוכן תיוג ולשפר את יעילות תיוג במוצקה-מטריצה, ssPL ניתן לבצע עם הגדלת% RH. ספיגת pLeu גם ניתן לשפר על ידי הגדלת הריכוז של סוכן photoreactive. היחס טוחנת של חלבון לpLeu יכול להיות מגוון לפי צורך. באופן כללי, עודף 100x טוחנת של pLeu לפרוחלבון יבטיח תיוג הולם. עם זאת, ריכוז pLeu גבוה עלול לגרום לאובדן של מבנה שליישונים במטריצה ​​המוצקה. לפיכך, בנוסף לקינטיקה תיוג והרכב ניסוח, בחירה של ריכוז pLeu חייבת גם להיות מבוססת על שמירה על השלמות מבנית של חלבון. כpLeu nonselectively תוויות XH (כאשר X = C, N, O) קבוצה, ייתכן שחומרים בלתי פעיל עם אתרי תיוג דומים יכולים להשפיע על הרמה של תיוג חלבון מאוד. ההתערבות של חומרים בלתי פעילים בזמינות pLeu לתיוג חלבון עדיין לא מאופיינת. זה ידוע שהקרבן שנוצר מהפעלת diazirine לא שאריות ספציפי, אולם מחקר אחד מדווח הטיה כלפי ASP וGlu 36. אמנם זה טוב ללמוד על אינטראקציות שאריות ספציפיות, מידע פפטיד-הרמה הוא גם שימושי וניתן להשתמש בם כדי לעצב חומרים בלתי פעילים לחסום אזורים עם חשיפה גבוהה מטריצה ​​במצב המוצק. ssPL-MS מספק מידע איכותי מפורט, אולםנתונים כמותיים צריכים להשיג ומדדים חזקים צריכים להיות מפותחים כדי לנתח הבדלי ניסוח פני מגוון רחב של מערכות lyophilized. השימוש בתווית שאריות ספציפיות בשילוב עם ניתוח MS / MS יכול לשפר עוד יותר את הרזולוציה לרמת חומצות אמינו. ריאגנטים תיוג כגון 2,3-butanedione לתייג Arg, נגזרי -hydroxysuccinimide N נגזרי -alkylmaleimide ליס וN לCys יכול לשמש כדי למפות בדיוק אינטראקציות מולקולריות באבקת lyophilized. עם זאת ריאגנטים אלה הם pH תלוי והתגובות לא יכולות להיות מבוקרות היטב כתיוג photolytic במצב מוצק. גישה חלופית היא לשלב התמונה צולבת-מקשר לתוך רצף החלבון עם השימוש בקווי auxotrophic תא, מוטגנזה מכוונת או derivatization שרשרת צד. מחקרי ssHDX-MS וssPL-MS הקודמים שלנו הראו כי תיוג של חלבון תלוי באופי וכמות חומרים בלתי פעילהמשמש 24,27,28,31-33,37,38. ssHDX-MS של Mb שיתוף lyophilized עם hydrochloride guanidine (Gdn.HCl) הראה ספיגת דאוטריום גדולה מMb במשותף עם lyophilized נמוך משקל מולקולרי סוכרים 32. במחקר שssPL-MS נפרד, Mb שיתוף lyophilized עם Gdn.HCl הראה הגנה טובה יותר מתיוג photolytic מ Mb עם סוכרוז 33. יתר על כן, מדידות כמותיות מssHDX-MS כבר מתאם גבוה עם היציבות של חלבון במהלך אחסון לטווח ארוך 28. מחקרים אלו מצביעים על כך שssHDX או ssPL של חלבון משקף את היקף ההחזקה מבנית של החלבון באבקת lyophilized. אנו מאמינים כי השמירה על מבנה המשני באבקות lyophilized מספקת סביבה נוחה לתיוג שרשרת צד עם pLeu והגנה של מימן אמיד מחילופי דאוטריום. עם זאת, השוואה מפורטת של התוכן אינפורמטיבי מהשיטות הללו צריכה להתבצע בעתיד. למרות הקמת השירות של ssHDX-MS וssPL-MSככלי מיון ניסוח סופו של דבר יהיה עליו להיות מיושמים על חלבונים רבים, תוצאות מהמחקרים האחרונים שלנו תומכת באימוץ הרחב יותר שלה. עם התפתחות נוספת, שיטות אלו צפויים להיות שימושיים נרחב לאפיון ניסוחים חלבון מצב מוצק בתעשיית הביו-פרמצבטיקה.

תרופות חלבון הן המגזר בעל הצמיחה המהירה ביותר של תעשיית הביו-פרמצבטיקה ומציעות טיפולים חדשים ומבטיחים לטיפול במחלות סוררות בעבר, כוללים הפרעות הורמונליות, סרטן ומחלות אוטואימוניות 1. בשינה 2012, שוק biotherapeutics העולמי הגיע 138,000,000,000 $ והוא צפוי להגיע 179,000,000,000 $ על ידי השינה 2018 2. החלבונים הם גדולים יותר ושבירים יותר מתרופות מולקולה קטנה קונבנציונליות ולכן הם רגישים יותר לסוגים רבים של השפלה 3. כדי להבטיח חיי מדף ויציבות נאותים, תרופות חלבון לעתים קרובות כפי שנוסחו lyophilized (כלומר, מיובש בהקפאה) אבקות מוצקות. עם זאת, חלבון, עדיין עשוי לעבור השפלה במצב המוצק, במיוחד אם המבנה המקורי שלו לא נשמר במהלך 4,5 תהליך lyophilization. הבטחת המבנה שנשמר היא אפשרית רק אם יש שיטות אנליטיות שיכולה לחקור קונפורמציה חלבון במצב המוצק עם sufficienהרזולוציה t. ספקטרוסקופיה NMR 6 וקריסטלוגרפיה רנטגן 7 הן שיטות הרזולוציה גבוהה הנפוצה המשמשות להערכת מבנה חלבון במוצקים גבישיים ופתרון 8. בגלל האופי של חומרים בלתי פעיל ושיטות העיבוד משמשות, ניסוחים חלבון lyophilized הם בדרך כלל אמורפי ולא גבישים 9. חוסר האחידות וסדר מיקרוסקופי הופך את הטכניקות שהוזכרו לעיל מעשיים עבור חלבונים במוצקים אמורפיים. ספקטרוסקופיית פורה (FTIR) 10, ספקטרוסקופיית ראמאן 11 וספקטרוסקופיה אינפרא אדום הקרובה (NIR) 12 היו בשימוש באופן קבוע על ידי תעשיית הביו-פרמצבטיקה להשוות מבנה שניוני באבקות lyophilized לזה של המבנה-פתרון של המדינה האם. עם זאת, שיטות אלה הן ברזולוציה נמוכה, ורק יכולות לספק מידע על שינויים הגלובליים במבנה משני. אפיון מבני של מצב מוצק באמצעות FTIRהראה גם 13,14 החלש או מתאם 15 עני עם יציבות אחסון לטווח ארוך. מגבלות אלו מדגישות את הצורך בשיטות ברזולוציה גבוהה מתאימות לזהות הפרעות מבניות של חלבונים במצב המוצק. תיוג כימי יחד עם proteolysis וניתוח ספקטרומטריה התפתח גישה רבת עוצמה לניטור מבנה חלבון ואינטראקציות מולקולריות בתמיסה מימית. בפיתוח תרופות, HDX-MS שמש במשך מיפוי epitope באינטראקציות אנטיגן-נוגדן 16,17, כדי למפות אינטראקציות קולט סמים 18, כדי לפקח על ההשפעות של שינויים, שלאחר translational בקונפורמציה של תרופות חלבון 19, וכדי להשוות וריאציה אצווה לתצווה בפיתוח biosimilars 20. באופן דומה, ligands photoactivatable כבר משמש לזיהוי מטרות תרופה ולקבוע זיקה וספציפיות של תגובות בין תרופתי קולט 21,22 מחייבת. לדוארספקטרומטריית Xtend היישום של שיטות אלה לניסוחי lyophilized, הקבוצה שלנו פיתחה מצב מוצק המוני חילופי דאוטריום המימן (ssHDX-MS) וספקטרומטר מסת תיוג photolytic מצב מוצק (ssPL-MS) ללמוד תצורות חלבון ואינטראקציות חומר לא פעילות בדגימות lyophilized עם רזולוציה גבוהה. בשני ssHDX-MS וssPL-MS, החלבון מתויג תחת תנאי תגובה אידיאליים במוצקים lyophilized, ולאחר מכן הדגימות מחדש ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה עם או בלי עיכול מפרקי חלבונים. ssHDX-MS מספק מידע על חשיפת שרשרת העיקרית לאדי דאוטריום, בעוד ssPL-MS מספק מידע על הסביבה של רשתות בצד (איור 1). שתי שיטות ובכך יכולות לספק מידע משלים לגבי קונפורמציה חלבון במצב המוצק. כאן, אנו מספקים פרוטוקול כללי ללימוד חלבונים במוצקים lyophilized באמצעות ssHDX-MS וssPL-MS (איור 2), תוך שימוש בMb כחלבון מודל. אנחנו מראים את היכולת של שתי שיטות ללהבחין בהבדלים בניסוחים עם שני חומרים בלתי פעילים שונים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig1.jpg" /> איור 1:. מבנה חלבון מידת ssHDX וssPL במוצקים lyophilized באמצעות מנגנוני תיוג שונים (א) בHDX, אמיד עמוד השדרה מימנים חליפין עם דאוטריום כפונקציה של מבנה החלבון ו- D 2 O נגישות. במצב המוצק, השיעור ומטבע זר דאוטריום המידה תלויה ברמה של D 2 O וספיחה, ניידות חלבון (התגלגלות וקפל שוב את האירועים) והטבע של החומרים לא הפעילים קיימים במטריצה ​​המוצקה. (ב) בPL, קרינת UV ב365 ננומטר יוזם את הקמתה של קרבן תגובת ביניים מהקבוצה הפונקציונלית diazirine של pLeu והוכנס אינו ספציפי לכל אג&quot;ח XH (x = כל אטום) או, מודעהטוליפ אין על פני אג&quot;ח = C C בסביבתו הקרובה. במצב המוצק, השיעור ושל תיוג המידה תלויה בריכוז המקומי סוכן התיוג של, זמן הקרנה, מבנה חלבון והטבע של חומרים לא פעילים קיימים במטריצה ​​המוצקה. לוחות A ו- B להראות התיוג התיאורטי המרבי שיכול להתרחש על עמוד השדרה וצד-רשתות בהתאמה בחלבון. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig2.jpg" /> איור 2: מצב מוצק מראה סכמטי HDX-MS () וPL-MS (B) לחלבון בניסוח lyophilized.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Name of Material/ Equipment</td>
			<td >Company</td>
			<td >Catalog Number</td>
			<td >Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equine myoglobin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0630-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td >#T9531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td >#240850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-Photo-leucine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td >#22610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium phosphate monobasic</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium phosphate dibasic</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Deuterium Oxide</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td >#DLM-4-PK</td>
			<td>Alternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Immobilized pepsin</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td >#2-3132-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td >#V511A</td>
			<td>Chymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water, Optima LC/MS grade</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >#7732-18-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Acetonitrile</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >#34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formic acid</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td >#28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ESI-TOF Calibrant</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >#G1969-85000</td>
			<td>Highly flammable liquid</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Protein microtrap</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td >TR1/25108/03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peptide microtrap</td>
			<td>Michrom Bioresources</td>
			<td >TR1/25109/02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Analytical column</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >Zorbax 300SB-C18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freeze dryer</td>
			<td>VirTis AdVantage Plus</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stratalinker equipped with five 365 nm lamps</td>
			<td>Stratagene Corp.</td>
			<td >Stratalinker 2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HPLC</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >1200 series LC</td>
			<td>Refrigerated LC system for HDX-MS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ESI-qTOF MS</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td >6520 qTOF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HDExaminer (HDX-MS data analysis software)</td>
			<td >Sierra Analytics</td>
			<td ></td>
			<td>http://www.massspec.com/HDExaminer.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders

מימן אמיד / החלפת דאוטריום (ssHDX-MS) ותיוג photolytic צד שרשרת (ssPL-MS) ואחריו ניתוח ספקטרומטריה יכולים להיות בעל ערך לאפיון הניסוחים lyophilized של תרופות חלבון. תיוג ואחרי עיכול מפרקי חלבונים מתאים מאפשר מבנה החלבון והאינטראקציות להיות ממופים עם רזולוציה ברמה-peptide. מאז חלבון אלמנטים מבניים התייצבו על ידי רשת של קשרים כימיים מהראשיות-הרשתות וצד-שרשרות של חומצות אמינו, תיוג ספציפי של אטומים בשאריות חומצת אמינו מספק תובנה המבנה והמבנה של החלבון. בניגוד לשיטות שגרתיות משמשות ללמוד חלבונים במוצקים lyophilized (למשל, FTIR), ssHDX-MS וssPL-MS לספק מידע כמותי וספציפי לאתר. התאגדות דאוטריום ופרמטרים הקינטית המידה יכולה להיות קשורה במהירות ובאיטיות להחלפת בריכות אמיד (מהיר N, N איטי) וישירות משקף את מעלותרי של קיפול חלבונים ומבנה בניסוחי lyophilized. תיוג photolytic יציב אינו עובר בחזרה לבורסה, יתרון על פני ssHDX-MS. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לשני ssHDX-MS וssPL-MS, באמצעות מיוגלובין (Mb) כחלבון מודל בניסוחי lyophilized המכילים גם trehalose או סורביטול.

כאן, ssHDX-MS וssPL-MS היו בשימוש כדי לחקור את ההשפעה של חומרים בלתי פעילים באינטראקציות קונפורמציה ומצב המוצק של תצורות Mb lyophilized. הריכוזים של חלבון וחומרים בלתי פעילים ששמשו במחקר זה מוצגים בטבלת 1. נציגי תוצאות מניתוח ssHDX-MS וssPL-MS של Mb lyophilized מתקבל על ידי הבא הפרוטוקולים מעל מוצגים. ספיגת דאוטריום ברמת חלבון שלמה ssHDX-MS הוא מסוגל להבחין בין הניסוחים Mb ברמה שלמה. ספקטרה ההמונית deconvoluted של Mb ללא פגע הבא 144 שעות של ssHDX מMBS הניסוח הראתה ספיגת דאוטריום גדולה מניסוח MBT (איור 3 א). בממוצע, MBS הראה ספיגת דאוטריום 46% יותר מאשר MBT (טבלה 2). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig3.jpg"/&gt; איור 3: ssHDX-MS לMb שלם: (א) ספקטרום המוני Deconvoluted של Mb ללא פגע deuterated מניסוחי MBT (קו מוצק) וMBS (קו מקווקו) הבא 144 שעות של ssHDX. הספקטרום ההמוני deconvoluted של Mb ללא פגע undeuterated מוצג גם (קו מקווקו). (ב) קינטיקה ssHDX לMb ללא פגע בניסוחי MBT (קו מוצק) וMBS (קו מקווקו). במהלך ssHDX הזמן היה מצויד למשוואה עבור עמותת מעריכי שני שלב באמצעות גרף Pad Prism גרסת תוכנת 5 (n = 3, ± SD). קינטיקה deuteration לMBS שלם וMBT דומה בנקודות זמן מוקדמות (1-4 שעות), אבל MBS הראה גדילת חילופי דאוטריום עם עלייה בזמן (8-144 שעות) (איור 3). הדבר מצביע על החשיבות של בחירת נקודות זמן ארוכה יותר לssHDX בתנאי RH וטמפרטורה נמוכים יותר. כמו כן, תהליך הספיחה ודיפוזיה 2 O D עשוי להשפיע על השיעור של ssHDX בפו המוקדם הזמןints. המחקרים הקודמים שלנו הראו כי ספיחת לחות בssHDX תושלם בתקופה של שעות, ויש לו תרומה מינימאלית להחליף קינטיקה מעבר לכך זמן. השיעור ומטבע זר במידה שנצפה לכן אינו פשוט אמצעים של D 2 O adsorbtion 27,28. הברים הקטנים השגיאה באיור 3, המצביעים על סטיות תקן משלוש דגימות ssHDX-MS עצמאיות, עולים כי הניסוי הוא מאוד לשחזור. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> דאוטריום הספיג (%) ב </td><td> ג המהיר N </td><td> k ג המהיר </td><td> ג האיטי N </td><td> k ג האיטי </td></tr><tr><td> MBT </td><td> 15.9 ± 0.5 </td><td> 13.1 (0.8) </td><td> 0.43 (0.03) </td><td> 11.0 (0.9) </td><td> 0.019 (0.001) </td></tr><tr><td> MBS </td><td> 23.2 ± 0.5 </td><td> 15.4 (0.7) </td><td> 0.49 (0.04) </td><td> 19.2 (0.6) </td><td> 0.024 (0.002) </td></tr><tr><td> % השינוי ד </td><td> 46% </td><td> 18% </td><td> 14% </td><td> 75% </td><td> 26% </td></tr></tbody></table> טבלה 2:. מדדי כמותיים של ספיגת דאוטריום במחקרי ssHDX של ניסוחים Mb ראה טבלה 1 להרכב ספיגת דאוטריום אחוזים ב ביחס למקסימום תיאורטי על ידי Mb ללא פגע אחרי 144 שעות של HDX ב 5 מעלות צלזיוס, 43% לחות יחסית (n = 3. , פרמטרים ממוצעים ± SD). ג נקבעו על ידי רגרסיה ליניארית של נתונים קינטית ssHDX-MS. כמובן זמן של חילופי דאוטריום לMb שלם היה מצויד למודל עמותת biexponential (Eqn. 2). ערכים בסוגריים סטיות התקן של הפרמטרים רגרסיה. ד השינוי באחוזים במדידות היו calcul<html> ated כמו 100 x [(ערך מMBS - הערך מMBT) / (ערך מMBT)]. הפרמטרים רגרסיה (מהיר N, N איטי, k מהיר ואיטי k) לקינטיקה ספיגת דאוטריום לMBT MBS ומוצגים בטבלה 2. למרות ערכים מהירים ואיטיים N N גדולים יותר לMBS מ MBT, הבדלים בN האיטי ערכים היו גדולים יותר מהבדלים בערכים מהירים N. באופן ספציפי, הערך המהיר N הוא רק 18% יותר מאשר בMBS MBT, ואילו הערך האיטי N הוא 75% יותר מאשר בMBS MBT. הדבר מצביע על כך את הערכים איטיים N הקטנים יותר בMBT יכולים להיות בגלל השימור גבוה יותר של מבנה Mb או הגנה של קבוצות אמידי בחומרים בלתי פעילים שנחשפים לD 2 O בMBS. עם זאת, המנגנונים מפורטים אינם מובן באופן ברור. קבועי קצב (k מהיר ואיטי k) עבור שני הניסוחים דומים מאוד. = &quot;Jove_content&quot; ילדה&gt; ספיגת דאוטריום ברמת פפטיד בעקבות עיכול פפסין, כולל של 52 פפטידים זוהו. שישה שברים שאינם המתאימים למיותרים של רצף Mb 100% שמשו לניתוח דיווח כאן. ניתן להשיג מידע נוסף על ידי שימוש שבברים חופפים, כפי שדווח על ידי הקבוצה שלנו בעבר 24. ספיגת דאוטריום אחוזים לכל פפטיד חושב והתוצאות מדגימות 144 שעות זממו (איור 4 א). קינטיקה HDX לשישה שברים פפטי הראתה התנהגות biexponential (איור 4), עולה בקנה אחד עם תת-אוכלוסיות של אטומי מימן אמיד שעברו תמורה &quot;מהירה&quot; ו&quot; איטי &quot;. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig4.jpg" /> איור 4: ssHDX-MS לMb ברמת פפטיד: (א) ספיגת דאוטריום אחוזים במשך 6 שאינו reduשברים פפטי ndant מMb בניסוחי MBT (אפור) וMBS (לבן) הבאים 144 שעות של HDX. קינטיקה (B) ssHDX לשישה שברים פפטי אינם מיותרים מMb בניסוחי MBT (קו מוצק) וMBS (קו מקווקו). במהלך ssHDX הזמן היה מצויד למשוואה עבור עמותת מעריכי שני שלב באמצעות גרף Pad Prism גרסת תוכנת 5 (n = 3, ± SD). פרמטרים רגרסיה לפפטידים nonredundant מוצגים באיור 5. כקבועי קצב המותאמים לברי פפטיד אינם קבועים שיעור הממוצע אורגניים חיבור בודד, קבועי קצב שנצפו לברים פפטי לא יכולים להיות קשורים באופן ליניארי לאלו של החלבון שלם. הערכים מהירים N עבור רוב שברים פפטי (למעט 56-69 בר) בMBS ניסוחים היו מעט גדולים יותר מאלה בMBT (איור 5 א). באופן דומה, הערכים מהירים k בדרך כלל הראו הבדל קטן בין formulations ובאזורים שונים של מולקולת Mb (איור 5). עם זאת, הערכים איטיים איטיים וk N לMBS הם גדולים יותר באופן משמעותי בכל הברים מאשר לMBT (איור 5 ג ו5D). הגידול הניכר בk האיטי וN האיטי לMBS עשוי לשקף ניידות רבה יותר של קבוצות אמידי בבריכות &quot;איטיות&quot; החלפה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig5.jpg" /> איור 5: פרמטרים הקינטית ssHDX לפפטידים פפטי Mb: N מהיר (א), k המהיר (B), N האיטי (C) וk ערכים איטיים (D) המתקבלים מרגרסיה ליניארית של נתונים קינטית ssHDX-MS לשישה פפטידים פפטי אינם מיותרים מMb בניסוחי MBT (אפור) וMBS ( לבן) (n = 3, ± SE). &lt;/ P&gt; תיוג photolytic ברמת חלבון שלם Mb מוקרן בנוכחות 20x pLeu העודף נוצר Mb-pLeu adducts מרובה, כפי שזוהה על ידי LC-MS (איור 6 א). ספקטרום deconvoluted לMBT מוקרן במשך 40 דקות עם 20x pLeu הראה עד 3 תוויות עם התוספת של 115, 230 וDa 345 למסה של Mb ללא תווית. MBS מוקרן באופן דומה עם 20x pLeu הראה פחות ספיגת pLeu ברמה שלמה, עם עד 2 אוכלוסיות שכותרתו זוהו על ידי LC-MS. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig6.jpg" /> איור 6: ssPL-MS לMb שלם: (א) ספקטרום המוני Deconvoluted לMBT (קו מוצק) וMBS (קו מקווקו) שכותרתו עם 20x עודף (5% w / w) pLeu. ספקטרום המוני Deconvoluted של Mb ילידים (Mb lyophilized ומוקרן בהעדר pLeu) מוצג כקו המקווקו. U </em&gt; מציין אוכלוסייה של חלבון שנותרה ללא תווית לאחר הקרנה. אוכלוסיות של חלבון נושא 1, 2 ו -3 תוויות pLeu מיוצגות כ1 ליטר, 2L ו3L בהתאמה. קינטיקה (B) ssPL-MS לMb ללא פגע בניסוחי MBT (מעגלים סגורים) וMBS (עיגולים פתוחים) כפונקציה של ריכוז pLeu. כל הדגימות היו מוקרנים במשך 40 דקות. ברים שגיאה נמצאים בסימנים. (C) קינטיקה ssPL-MS לMb ללא פגע בניסוחי MBT (מעגלים סגורים) וMBS (עיגולים פתוחים) lyophilized ומוקרן בנוכחות 100x pLeu העודף (20.7% w / w) כפונקציה של זמן הקרנה. ברים שגיאה נמצאים בסימנים. במחקרים הקינטית, אחוזים של חלבון שכותרתו גדלו באופן אקספוננציאלי עבור שני MBS MBT ועם זמן הקרנת הגדלת (איור 6). MBS הראה פחות ספיגת pLeu מ MBT בכל פעם שקרינה. שני הניסוחים הופיעו להגיע לרמה של 40 דקות. לפיכך, מחקר הקינטית יכול להיות לנו<html> eful כדי לקבוע את משך ההקרנה הדרושה כדי להשיג הפעלת pLeu מלאה. קינטיקה התיוג נחקרו גם כפונקציה של ריכוז pLeu (איור 6 ג). אחוזים מהחלבון שכותרתו גדלו עם ריכוז pLeu עבור שני MBS MBT ו. עם זאת, ב20.7% w / w pLeu, MBT הראה ירידה בספיגת pLeu. זה יכול להיות בגלל ההרחקה של pLeu מפני שטח של החלבון בריכוז גבוה pLeu. לפיכך, יש לבצע מחקר עם משתנה ריכוז של pLeu כדי לבחור את ריכוז pLeu המתאים המאפשר תיוג מספיק על פני השטח החלבון ללא הדרת פני השטח. במחקר זה, 20x pLeu העודף נבחר למחקרים נוספים ברמה-peptide. הכוללים ירידה בתיוג נצפה עבור MBS מציע נגישות צד שרשרת עניה למטריצה ​​המכילה pLeu. זה עולה בקנה אחד עם שינוי קונפורמציה בנוכחות סורביטול כי תוצאות תיוג מופחת. תוכן &quot;&gt; תיוג photolytic ברמת פפטיד בהתבסס על מחקרי תיוג חלבון שלמים, 20x pLeu העודף נבחר כדי להשוות MBT MBS וברמת פפטיד. דגימות שכותרתו היו מתעכלים עם טריפסין ונותחו על ידי LC-MS. סך של 40 פפטידים המקביל לשל רצף Mb 100% אותרו עבור דגימות MBT MBS ו. בחלק מהמקרים, עיכול tryptic עשוי לספק כיסוי רצף חלבון מוגבל אם שאריות ליס ו / או Arg מסומנים בכבדות. כדי לשפר את כיסוי רצף, תערובת של טריפסין וchymotrypsin ניתן להשתמש כדי לעכל את החלבון שכותרתו. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52503/52503fig7.jpg" /> איור 7: ssPL-MS לMb ברמת פפטיד: ייצוג קריקטורה של Mb שכותרתו עם 20x pLeu העודף (5% w / w) בנוכחות trehalose () וסורביטול (B). החלבון שכותרתו היה מתעכל עם trypsin ופפטידים שכותרתו מופו על המבנה הגבישי של Mb (PDB מזהה 1WLA). אזורי שכותרתו וללא תווית בצבע ארגמן וירוק, בהתאמה. ssPL-MS עם עיכול טריפסין מספק מידע איכותי על פפטידים להיות מתויגים. בהתחשב באוכלוסיות שכותרתו השונות ברמה שלמה, המנגנון המופקר של תיוג pLeu והבדלים ביעילות יינון של פפטידים שכותרתו וללא תווית, שקשה להשיג מדדי כמותיים לssPL-MS לאחר עיכול. עם זאת, המידע האיכותי עדיין יכול לספק תובנה שינויי קונפורמציה חלבון ברמת פפטיד. במחקר זה, ניסוחים שני MBT MBS והראו ספיגת pLeu פני רוב שטח החלבון. בהשוואה לMBS, שברי פפטיד 32-42, 134-139 ו146-153 מMBT הראו תיוג pLeu (איור 7). הדבר מצביע על כך בצד-השרשרות של חומצות אמינו אלה חשופות לpLeu, כסלילים בregio אלהns הם שלמים במטריצת MBT. בניגוד לכך, ההגנה מפני תיוג pLeu במטריצת MBS עולה בקנה אחד עם הפרעות מבניות באזורים אלה. בסך הכל, התוצאות מssHDX-MS וssPL-MS מצביעות על כך שהשיטות יכולות לספק מידע ברמה-peptide ברזולוציה גבוהה משלים על עמוד השדרה (ssHDX-MS) וצד-שרשרת (ssPL-MS) השפעות חשיפה וחומר לא פעיל בניסוחי חלבון lyophilized .

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders at JoVE.com

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

mass-spectrometric-approaches-to-study-protein-structure-interactions

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Biochemistry

SCIENTISTS IN ACTION

15.6K Views.  Purdue University. Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design. 

Video: Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass determination allows one to evaluate the correctness of protein primary sequences, the presence of mutations and/or post-translational modifications, the possible protein degradation, the sample homogeneity, and the degree of isotope incorporation in case of labelling (e.g. 13C labelling).
Electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) is widely used for mass determination of denatured proteins, but its efficiency is affected by the composition of the sample buffer. In particular, the presence of salts, detergents, and contaminants severely undermines the effectiveness of protein analysis by ESI-MS. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is an attractive alternative, due to its salt tolerance and the simplicity of data acquisition and interpretation. Moreover, the mass determination of large heterogeneous proteins (bigger than 100 kDa) is easier by MALDI-MS due to the absence of overlapping high charge state distributions which are present in ESI spectra.
Here we present an accessible approach for analyzing proteins larger than 100 kDa by MALDI-time of flight (TOF). We illustrate the advantages of using a mixture of two matrices (i.e. 2,5-dihydroxybenzoic acid and &#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid) and the utility of the thin layer method as approach for sample deposition. We also discuss the critical role of the matrix and solvent purity, of the standards used for calibration, of the laser energy, and of the acquisition time. Overall, we provide information necessary to a novice for analyzing intact proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Accurate mass measurement represents an important step during the investigation of proteins. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) can be used for such determination and its key advantage is the tolerance to salts, detergents and contaminants. Here we illustrate an accessible approach for the analysis of proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון זמן של טיסה (MALDI-TOF) Mass ניתוח Spectrometric של חלבונים שלמים גדול מ100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia coli&#160;ATP synthase. Bacterial F-type ATP synthase is the target of a new, FDA-approved antibiotic to combat drug-resistant tuberculosis. Understanding bacteria-specific auto-inhibition of ATP synthase by the C-terminal domain of subunit &#949;&#160;could provide a new means to target the enzyme for discovery of antibacterial drugs. The C-terminal domain of &#949;&#160;undergoes a dramatic conformational change when the enzyme transitions between the active and inactive states, and catalytic-site ligands can influence which of &#949;&#39;s conformations is predominant. The assay measures kinetics of &#949;&#39;s binding/dissociation with the catalytic complex, and indirectly measures the shift of enzyme-bound &#949;&#160;to and from the apparently nondissociable inhibitory conformation. The Bio-layer Interferometry signal is not overly sensitive to solution composition, so it can also be used to monitor allosteric effects of catalytic-site ligands on &#949;&#39;s conformational changes.

The protocols here describe kinetic assays of protein-protein interactions with Bio-layer Interferometry. F-type ATP synthase, which is involved in cellular energy metabolism, can be inhibited by its &#949; subunit in bacteria. We have adapted Bio-layer Interferometry to study interactions of the catalytic complex with &#949;&#8217;s inhibitory C-terminal domain.

Interferometry Bio-שכבה למדידת קינטיקה של חלבונים אינטראקציות והשפעות יגנד allosteric

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. In this method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography mass spectrometry (py-GC-MS) volatile compounds are analyzed during a first desorption run. In the second run, the same dried sample is pyrolyzed for analysis of non-volatile compounds such as pigments and polymers. These can be identified by their specific decomposition patterns. Additionally, this method can be used to differentiate original from counterfeit inks. Easy screening methods for data evaluation using the average mass spectra and self-made pyrolysis libraries are applied to speed up substance identification. Using specialized evaluation software for pyrolysis GS-MS data, a fast and reliable comparison of the full chromatogram can be achieved. Since GC-MS is used as separation technique, the method is limited to volatile substances upon desorption and after pyrolysis of the sample. The method can be applied for quick substance screening in market control surveys since it requires no sample preparation steps.

This method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography with mass spectrometric detection and data evaluation protocol can be used for multi-component analysis of tattoo inks and discrimination of counterfeit products.

דו-שלב פירוליזה-גז כרומטוגרפיה שיטה עם זיהוי ספקטרומטרי המוני לזיהוי של החומרים דיו קעקועים מוצרים מזויפים

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the past decade. Interest in the bio-nano interface arises from the fact that the biomolecular corona confers a biological identity to NMs and thus causes the body to identify them as &#8220;self&#8221;. For example, previous studies have demonstrated that the proteins in the corona are capable of interacting with membrane receptors to influence cellular uptake and established that the corona is responsible for cellular trafficking of NMs and their eventual toxicity. To date, most research has focused upon the protein corona and overlooked the possible impacts of the metabolites included in the corona or synergistic effects between components in the complete biomolecular corona. As such, this work demonstrates methodologies to characterize both the protein and metabolite components of the biomolecular corona using bottom-up proteomics and metabolomics approaches in parallel. This includes an on-particle digest of the protein corona with a surfactant used to increase protein recovery, and a passive characterization of the metabolite corona by analyzing metabolite matrices before and after NM exposures. This work introduces capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry (CESI-MS) as a new technique for NM corona characterization. The protocols outlined here demonstrate how CESI-MS can be used for the reliable characterization of both the protein and metabolite corona acquired by NMs. The move to CESI-MS greatly decreases the volume of sample required (compared to traditional liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (LC-MS) approaches) with multiple injections possible from as little as 5 &#181;L of sample, making it ideal for volume limited samples. Furthermore, the environmental consequences of analysis are reduced with respect to LC-MS due to the low flow rates (&#60;20 nL/min) in CESI-MS, and the use of aqueous electrolytes which eliminates the need for organic solvents.

Here we present a protocol to characterize the complete biomolecular corona, proteins, and metabolites, acquired by nanomaterials from biofluids using a capillary electrophoresis &#8211; mass spectrometry approach.

ספקטרומטריית מסה אלקטרופורזיס נימית גישות לאפיון החלבון וקורונה מטבולית שנרכשו על ידי ננו-חומרים

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool for this purpose, especially for protein systems that are difficult to study by traditional methods. To study a protein&#39;s structure by MS, specific chemical reactions are performed in solution that encode a protein&#39;s structural information into its mass. One particularly effective approach is to use reagents that covalently modify solvent accessible amino acid side chains. These reactions lead to mass increases that can be localized with residue-level resolution when combined with proteolytic digestion and tandem mass spectrometry. Here, we describe the protocols associated with use of diethylpyrocarbonate (DEPC) as a covalent labeling reagent together with MS detection. DEPC is a highly electrophilic molecule capable of labeling up to 30% of the residues in the average protein, thereby providing excellent structural resolution. DEPC has been successfully used together with MS to obtain structural information for small single-domain proteins, such as &#946;2-microglobulin, to large multi-domain proteins, such as monoclonal antibodies.

The experimental procedures for performing diethylpyrocarbonate-based covalent labeling with mass spectrometric detection are described. Diethylpyrocarbonate is simply mixed with the protein or protein complex of interest, leading to the modification of solvent accessible amino acid residues. The modified residues can be identified after proteolytic digestion and liquid chromatography/mass spectrometry analysis.

תיוג קוולנטי עם דיתילפירוקרבונט לחקר מבנה חלבון מסדר גבוה יותר על ידי ספקטרומטריית מסה

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and response to external stressors. Yet, the biochemical mechanisms and full complement of neuropeptides and their functional roles remain poorly understood. Characterization of these endogenous peptides is hindered by the immense diversity within this class of signaling molecules. Additionally, neuropeptides are bioactive at concentrations 100x - 1000x lower than that of neurotransmitters and are prone to enzymatic degradation after synaptic release. Mass spectrometry (MS) is a highly sensitive analytical tool that can identify, quantify, and localize analytes without comprehensive a priori knowledge. It is well-suited for globally profiling neuropeptides and aiding in the discovery of novel peptides. Due to the low abundance and high chemical diversity of this class of peptides, several sample preparation methods, MS acquisition parameters, and data analysis strategies have been adapted from proteomics techniques to allow optimal neuropeptide characterization. Here, methods are described for isolating neuropeptides from complex biological tissues for sequence characterization, quantitation, and localization using liquid chromatography (LC)-MS and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MS. A protocol for preparing a neuropeptide database from the blue crab, Callinectes sapidus, an organism without comprehensive genomic information, is included. These workflows can be adapted to study other classes of endogenous peptides in different species using a variety of instruments.

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Mass spectrometric characterization of neuropeptides provides sequence, quantitation, and localization information. This optimized workflow is not only useful for neuropeptide studies, but also other endogenous peptides. The protocols provided here describe sample preparation, MS acquisition, MS analysis, and database generation of neuropeptides using LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting, and MALDI-MS imaging.

חקירה ספקטרומטרית מסה רבת פנים של נוירופפטידים בקלינקטס ספידוס

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of NPAAs can provide crucial information about cellular uptake and/or function, metabolic pathways, and potential toxicity. &#946;-methylamino-L-alanine (BMAA) is a neurotoxic NPAA produced by various algae species and is associated with an increased risk for neurodegenerative diseases, which has led to significant research interest. There are numerous ways to extract AAs for analysis, with liquid chromatography-tandem mass spectrometry being the most common, requiring protein precipitation followed by acid hydrolysis of the protein pellet. Studies on the presence of BMAA in algal species provide contradictory results, with the use of unvalidated sample preparation/extraction and analysis a primary cause. Like most NPAAs, protein precipitation in 10% aqueous TCA and hydrolysis with fuming HCl is the most appropriate form of extraction for BMAA and its isomers aminoethylglycine (AEG) and 2,4-diaminobutyric acid (2,4-DAB). The present protocol describes the steps in a validated NPAA extraction method commonly used in research and teaching laboratories.

The present protocol describes the extraction of non-protein amino acids from biological matrices via trichloroacetic acid (TCA) protein precipitation and acid hydrolysis before analysis using liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

מיצוי חומצות אמינו שאינן חלבוניות מציאנובקטריה לכרומטוגרפיה נוזלית-ניתוח ספקטרומטריית מסה טנדם

Non-protein amino acids (NPAAs) are a large class of amino acids (AAs) that are not genetically encoded for translation into proteins. The analysis of ...

Microsampling in Targeted Mass Spectrometry-Based Protein Analysis of Low-Abundance Proteins

This paper presents a protocol with detailed descriptions for efficient sample cleanup of low-abundance proteins from dried samples. This is performed using bead-based proteolysis prior to proteotypic peptide affinity-capture and liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) determination. The procedure can be applied to both conventional dried samples using paper cards (e.g., dried blood spots [DBSs] and dried serum spots [DSSs]), as well as samples collected with newer sampling methods such as volumetric absorptive microsampling (VAMS). In addition to describing this procedure, the preparation of both trypsin beads and antibody-coated beads is presented in a step-by-step manner in this work. The advantages of the presented procedure are time-efficient proteolysis using beads and selective robust cleanup using peptide affinity-capture. The current procedure describes the determination of the low-abundance small-cell lung cancer (SCLC) biomarker, progastrin-releasing peptide (ProGRP), in dried serum (both DSSs and VAMS). Detailed procedures for bead preparation make it easier to implement the workflow in new applications or other laboratories. It is demonstrated that the results may be dependent on the sampling material; for the present project, higher signal intensities were seen for samples collected using VAMS compared to DSSs.

A protocol is presented for the determination of low-abundance biomarkers from dried serum samples exemplified with the biomarker progastrin-releasing peptide (ProGRP). Antibody-coated magnetic beads are used for the selective cleanup and enrichment of a proteotypic ProGRP peptide. The captured peptide is subsequently analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.

מיקרו-דגימה בניתוח חלבונים ממוקד מבוסס ספקטרומטריית מסה של חלבונים בעלי שפע נמוך

This paper presents a protocol with detailed descriptions for efficient sample cleanup of low-abundance proteins from dried samples. This is performed ...