Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.

1. מינים יתושים וגידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על A. G3 gambiae וא &#39; זני aegypti ליברפול IB12 (המשמשים במחקרי הנציג להלן) או זנים אחרים של עניין על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר לעיל 23,24. </li></ol> 2. dsRNA וsiRNA עיצוב והפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים עיצוב לבניית תבניות dsRNA ארוכות ספציפיות לגן של עניין. השתמש בכלי E-RNAi 25. לייצר dsRNA לפי השיטה של בחירה או כפי שתואר לעיל 19. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביקורת שלילית, לסנתז dsRNA 19 מתאים לרצף של חלבון ירוק ניאון, β-galactosidase (β-gal) (GFP), או כמה גנים אחרים לא באו לידי ביטוי ביתושים. אם כך רצוי, dsRNA 19 מנוצלים כדי ליצור את תוצאות הנציג מסוכמות להלן יכולים לשמש כביקורת חיובית. חנות dsRNA מומס במי RNase ללא ב -80 °; C עד צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, siRNA גן ספציפי עיצוב על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר לעיל 10. לטרוף את הרצף של siRNA מציאה לעצב siRNA שליטה השלילי שאינו מתאים לכל גן יתושים. לרכוש siRNAs המותאמת אישית, אשר זמינות באמצעות מספר ספקים בעלי מוניטין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כך רצוי, siRNAs 20,21 המנוצל כדי להשיג את תוצאות הנציג מסוכמות להלן יכול לשמש כביקורת חיובית. חנות siRNA מומס במי RNAse חינם ב -80 ° C עד צורך. </li></ol></li></ol> 3. הכנת Chitosan / מפריעים RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתרן גופרתי שהוכן מראש, RT 100 מ&quot;מ (100 מ&quot;מ Na 2 SO 4 בH 2 O deionized) ו -0.1 M נתרן אצטט (0.1 מ &#39;NAC 2 H 3 O 2 -0.1 M חומצה אצטית, pH 4.5 בH 2 O deionized) מאגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר chitosan (≥75%deacetylated) ב 0.1 חיץ אצטט M נתרן לעשות 0.02% (w / v) פתרון עובד ולשמור על הפתרון בRT לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר dsRNA או siRNA ב -50 μl deionized H 2 O ולהוסיף אותו למאגר נתרן גופרתי 100 מ&quot;מ לעשות פתרון 100 μl של 32 מיקרוגרם של dsRNA / siRNA לשל נתרן גופרתי 50 מ&quot;מ 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון chitosan לפתרון dsRNA / siRNA 100 μl ולאחר מכן לחמם את התערובת באמבט מים ב 55 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. הגדר את שליטה על ידי הוספה של נתרן גופרתי 50 מ&quot;מ לפתרון chitosan 100 μl 100 μl ולפי אותו הנוהל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרונות באופן מיידי למשך 30 שניות על ידי vortexing במהירות גבוהה ב RT כדי להקל על ההיווצרות של חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת על 13,000 XG במשך 10 דקות ב RT, לאחר שהזמן גלולה צריכה להיות גלויה. מעביר את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר חדש. אוויר יבש גלולה ל≈10 דקות ב RT לפני השימוש בו כדי להכין אוכל יתושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Measure הריכוז של dsRNA / siRNA בsupernatant באמצעות supernatant מהשליטה (ראה 3.5) כריק כדי לחשב את הסכום הכולל של dsRNA / siRNA שנותר בsupernatant. השתמש בהבדל בין כמויות התחלה של dsRNA / siRNA וסכומים שנותרו בsupernatants כדי לחשב את אחוז dsRNA / siRNA הממולכד בחלקיקים. יעילות טעינה זה היא בדרך כלל מעל 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך, אם יש צורך יותר חלקיקים. השתמש בחלקיקים היבשים באופן מיידי. ההשפעה של קירור של חלקיקים לפני השימוש לא נבדקה. </li></ol> 4. הכנת מזון המכיל Chitosan יתוש / מפריע RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר של פתרון agarose 2% (w / v) במים ללא יונים, להמס את agarose, ולשמור על פתרון agarose נמס באמבט 55 מעלות צלסיוס מים לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב פתיתי מזון לדגים (47% חלבון גולמי, דקות. שומן גולמי 10%, מקסימום. סיבים גולמיים 3%) ושמרים יבשים ביחס של 2: 1 (w / w). טוחנים את התערובת לחלקיקים קטנים עם מכתש ועלי (סביר דרך מס &#39;50 מסננת בדיקה סטנדרטית ארה&quot;ב). השתמש במזון הקרקע, שאמורה להיות חום בצבע, מייד או לאחסן אותו במכל אטום על 4 מעלות למשך מספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 1.5 מיליליטר, לערבב 6 מ&quot;ג מזון קרקע עם חלקיקים המיובשים מסעיף 3.7 עם קיסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של פתרון agarose ג&#39;ל 2% מראש מומס לתערובת מזון-ננו-החלקיקים; מערבב מייד וביסודיות על ידי שימוש בקצה קיסם או pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בג&#39;ל המכיל מזון וחלקיקים כדי להאכיל את זחלי היתושים באופן מיידי. לחלופין, פעם ג&#39;ל הוא התגבש לגמרי בRT, לאחסן את הג&#39;ל על 4 ° C ולהשתמש ביום שלמחרת, או ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 5. האכלת זחלי יתוש עם מזון המכיל Chitosan / מפריע RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א האכלה זחלי יתושים gambiae: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר siגלולה ngle ג&#39;ל מצינור 1.5 מיליליטר באמצעות קיסם ולחתוך אותו לפרוסות שווים 6 באמצעות סכין גילוח נקי או איסוף שן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 20 זחלי instar שלישיים לצלחת פטרי המכילה 500 מיליליטר של מים deionized 100 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את זחלי יתושים על ידי הוספת פרוסה אחת של גלולה ג&#39;ל (קצוצה דק לחתיכות קטנות יותר) לכל צלחת פטרי פעם ביום למשך ארבעה ימים. הקפדתי למלא האכלת זחלים על גלולה, שאמור להיות מופחת באופן משמעותי בגודל או נעדרת לחלוטין על ידי ביום שלמחרת. לאחר הזמן, יתושים יתפתחו זחלי instar רביעי מאוחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט כל שינוי פנוטיפי גלוי במהלך הניסוי. בדוק את רמות התמליל ושינויי פנוטיפי אחרים כאמור בסעיף 6 בתום התקופה של ארבעה ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א האכלה זחלי יתושים aegypti: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גלולה ג&#39;ל ל6 פרוסות שווים באמצעות סכין גילוח נקי או קיסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 50 שעות 24 מסונכרנות גיל לאחר fi ביצת בקיעהזחלי instar הראשונים לצלחת פטרי ב≈40 מיליליטר מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את זחלי פרוסה אחת לכל צלחת פטרי במשך 4 שעות / יום, ולאחר מכן להעביר זחלים חזרה לתזונה הרגילה זחל של 2: פתיתי מזון 1 קרקע דגים ושמרים יבשים לשארית היום. חזור על הליך יומי לאורך ארבעת instars הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את רמות התמליל ושינויי פנוטיפי אחרים כאמור בסעיף 6 בנקודות הזמן התפתחותי הרצויות. </li></ol></li></ol> 6. אישור של ג&#39;ין מציאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות תמליל יחסית על ידי qRT-PCR בא aegypti וא &#39; זחלי gambiae. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ולנתח מבחני qRT-PCR עם שלושה משכפל ביולוגי על לפחות 10 שליטה במאגר לעומת זחלים ניסיוניים כפי שתואר 11,19,20, או על פי נוהל מעבדה סטנדרטי. תוצאות נציגים כלולות להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של חלק סוג רקמה מסוים / גוף (כלומר., מוח או אנטנה), perform qRT-PCR, כמתואר ב6.1.1 לנתיחה הבאה כדי לשחזר את הרקמות של עניין (למשל, לראות Mysore et al. 21). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור למציאה על ידי הכלאה באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז antisense שכותרת digoxygenin ולחוש על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר 26 riboprobes שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הכלאה באתר לפרוטוקול Haugen et al. 27 לאישור של מציאה כפי שתואר לעיל 11,20 ודנו בסעיף תוצאות הנציג להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור למציאה ידי אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נוגדנים כנגד מוצר החלבון של הגן הממוקד זמינים, לבצע אימונוהיסטוכימיה כפי שתואר בעבר 28, המאפשר זיהוי של אנשים עם הרמות הגבוהים ביותר של מציאה לניתוח פנוטיפ 20 כפי שהודגם בrepresentative סעיף תוצאות בהמשך. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Knipling, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+insects+of+public+health+importance.">Genetic control of insects of public health importance.</a> Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female-specific+flightless+phenotype+for+mosquito+control.">Female-specific flightless phenotype for mosquito control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).</li><li>Wise de Valdez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elimination+of+dengue+vector+mosquitoes.">Genetic elimination of dengue vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).</li><li>Harris, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+suppression+of+a+field+mosquito+population+by+sustained+release+of+engineered+male+mosquitoes.">Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+dsRNA+for+RNAi+in+insects:+an+overview+and+future+directions.">Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions.</a> Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).</li><li>Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limitation+and+possible+solutions+of+RNAi-based+technology+for+insect+pest+control.">limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control.</a> Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).</li><li>Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+genes+in+Aedes+aegypti+embryos.">Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li><li>Clemons, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+gene+targeting+in+Aedes+aegypti+embryos+reveals+that+frazzled+regulates+vector+mosquito+CNS+development.">siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development.</a> PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).</li><li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin-1a+is+required+for+Aedes+aegypti+embryonic+nerve+cord+development.">Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development.</a> PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).</li><li>Nguyen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+characterization+of+salivary+gland+development+in+Aedes+aegypti.">Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti.</a> EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).</li><li>Sarro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+commissureless2+function+during+dipteran+insect+nerve+cord+development.">Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).</li><li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti:+implications+for+pest+mosquito+control.">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> J Insect Sci. 13, 69 (2013).</li><li>Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rehydration+driven+RNAi:+a+novel+approach+for+effectively+delivering+dsRNA+to+mosquito+larvae.">Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae.</a> Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li><li>Coy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+adult+Aedes+aegypti+mosquitoes+through+oral+delivery+of+double-stranded+RNA.">Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA.</a> J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/double-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+(Anopheles+gambiae).">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).</li><li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Aedes+aegypti+olfactory+system+development+through+chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+of+semaphorin-1a.">Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).</li><li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).</li><li>Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan-mediated+orally+delivered+nucleic+acids:+a+gutful+of+gene+therapy.">Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy.</a> Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).</li><li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes.">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li><li>Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+and+egg+collection+of+Aedes+aegypti.">Culturing and egg collection of Aedes aegypti.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi:+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).</li><li>Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.+In+situ+hybridization+to+whole+mount+Drosophila+embryos.">Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos.</a> A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).</li><li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).</li><li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+protein+expression+during+Aedes+aegypti+development.">Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).</li><li>Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+diel+and+circadian+gene+expression+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae.">Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+Aedes+aegypti+using+TALENs.">Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs.</a> Methods. 69 (1), 38-45 (2014).</li><li>Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+bacterially+expressed+VP28dsRNA+to+protect+Penaeus+monodon+from+white+spot+syndrome+virus.">Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus.</a> Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticle+delivered+dsRNA+toward+genetic+control+of+insect+pests).">Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests).</a> Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).</li><li>Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+with+polyvalent+siRNA-nanoparticle+conjugates.">Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).</li><li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+RNAi+in+humans+from+systemically+administered+siRNA+via+targeted+nanoparticles.">Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles.</a> Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).</li><li>Molinaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine+and+chitosan+carriers+for+the+delivery+of+RNA+interference+effectors.">Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors.</a> Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).</li><li>Singha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+in+small-interfering+RNA+delivery.">Polymers in small-interfering RNA delivery.</a> Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Chitosan / מתודולוגיה ננו-חלקיקי RNA התערבות המתוארות במסמך זה נעשתה שימוש כדי למקד ביעילות גנים במהלך התפתחות זחל בא gambiae (איורים 2, 3) וא &#39; aegypti (איורים 4, 5, 6, לוחות 1, 2). ניתן להכין חלקיקי Chitosan גם עם dsRNA הארוך או siRNA, אשר שניהם שימשו בהצלחה ביתושים כ?...

יתושי וקטור האכלת דם של genera Anopheline וAedine לשדר גורמי המחלות אחראים לכמה מהמכות הגרועות ביותר של המין האנושי. 3.4 מליארד אנשים מוערכים הם בסיכון להידבקות במלריה, שהוא אחראי למוות למעלה מחצי מ&#39;מדי שנה ברחבי העולם. תוצאות מלריה מזיהום על ידי sp Plasmodium. טפילים, אשר מועברים לאנשים דרך העקיצות של יתושים נגועים מסוג אנופלס, כוללים הווקטור העיקרי האפריקאי אנופלס gambiae <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">(http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> , 2014) 1. Aedes aegypti הוא וקטור היתושים העיקרי לוירוס דנגה, מה שגורם לקדחת דנגה, מחלה המלווה בחום ספציפי שהיא המחלה הנפוצה arboviral והמשמעותית ביותר בעולם. וירוס דנגה הוא כיום איום ל&gt; 2.5 מליארד בני אדם באזורים הטרופיים, עם inciden שנתיce של כ -50 מיליון מקרים וכתוצאה מכך ~ 24,000 מקרי מוות בשנה <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">(http://www.cdc.gov/dengue/,</a> 2014) 2. למרות ההשפעה הגלובלית ההרסנית של מחלות שמקורן יתושים על בריאות אדם, אמצעי יעיל למניעה וטיפול במחלות אלה חסרים. הדברת יתושים היא כיום השיטה הטובה ביותר למניעת מחלה. הפוטנציאל לשליטה במחלות שמקורן בפרוקים-רגליים על ידי המניפולציה הגנטית של חרקים וקטור הוכר במשך ארבעה עשורים 3. זנים מהונדסים של א &#39; aegypti שתוכנן להיות בפנוטיפ לעוף נשי ספציפי repressible עשה בתקופה האחרונה את הפוטנציאל לשימוש באסטרטגיות בקרת וקטור מהונדסים מציאות 4-6. התקדמות אלה אתגרה חוקרים לזהות מטרות גנטיות חדשניות לבקרת וקטור ואמצעים נוספים של המניפולציה תפקוד גן ביתושי וקטור. שינוי של d ביטוי גניםפיתוח uring, כפי שהיה במקרה ביתושי נקבה-לעוף 4, עשוי לקדם את ההבהרה של אסטרטגיות בקרת וקטור רומן. עם זאת, במידה רבה בשל אתגרים טכניים, הפונקציות של מעט מאוד גנים מתאפיינות בפיתוח של א &#39; gambiae, א aegypti, או מיני יתושים אחרים. מאז גילויו בג 7 elegans, התערבות RNA (RNAi), שנשמרת בבעלי חיים, צמחים, ומיקרואורגניזמים, כבר בשימוש נרחב למחקרים גנטיים פונקציונליים במגוון רחב של אורגניזמים, כולל חרקים 8,9. מסלול RNAi הוא ביוזמת דייסר, שדבק dsRNA הארוך לתוך siRNAs ארוך נוקלאוטיד 20-25 קצר המתפקדים כRNA להתערב רצף ספציפי. גני שתיקה siRNAs כי הם משלימים ברצף על ידי קידום מחזור תמליל, מחשוף, ושיבוש התרגום 9. מולקולות ארוכות dsRNA (בדרך כלל 300-600 נקודות בסיס) או siRNAs מיקוד המותאם אישית particulaרצף r ניתן להשתמש במעבדת המחקר להשתקה כל גן של עניין. על ידי ניהול כאשר מפריע מועבר RNA, חוקרים יכולים לקבוע את הזמן שבו גן השתקה יוזמת. יתרון זה הוא שימושי כפי שהוא יכול להשתמש בו כדי להתגבר על אתגרים כגון קטלני או עקרות התפתחותית, אשר יכול לעכב את הייצור ותחזוקה של זני נושאות מוטציות תורשתיות, תהליך יקר ועתירת עבודה שאינו זמין עדיין בכל מיני החרקים. למרות התואר של השתקת גנים על ידי RNAi יכול להשתנות מגן לגן, רקמה לרקמה, ובעלי חי בעלי חיים, RNAi הוא בשימוש נרחב לניתוח פונקציונלי של גנים ביתושים וחרקים אחרים 8,9. שלוש אסטרטגיות משלוח RNA להתערב כבר בשימוש ביתושים: microinjection, יישום שריה / אקטואלי, ובליעה. להיסטוריה והשוואה של השימוש בשלוש הטכניקות הללו בחרקים מפורטים, עיין באל יו et 8. Wדואר השתמש בהצלחה microinjection 10 כאמצעי לאספקת siRNAs למקד גני התפתחותיים בא עוברי aegypti, זחלים, גלמים ו11-14. עם זאת, אסטרטגית משלוח עתירת עבודה זו דורשת גם התקנת microinjection ומיומנת יד. יתר על כן, microinjection מלחיץ את האורגניזם, גורם מבלבל, במיוחד כאשר פנוטיפים התנהגותיים יוערכו. לבסוף, משלוח microinjection לא ניתן להרחיב לתחום עבור בקרת וקטור. כחלופה, שריה האורגניזם להתערב פתרון RNA הפכה גם אמצעי פופולרי של גרימת השתקת גנים, כפי שהוא נוח ודורש ציוד או עבודה קטן. שריה יש בעיקר יושמה בשורת תאי חרקים לומד 8, אך במחקר שנערך לאחרונה, מציאה הושגה בא זחלי aegypti שקועים בפתרון של 15 dsRNA, שבעלי החיים הופיעו לבליעה. עם זאת, למחקרים שכלל ניתוח של experimenta מרובהקבוצות l או פנוטיפים, שריה היא די יקרה. לופז-מרטינז et al. 16 תיארו להחזרת נוזלים מונעים RNAi, גישה חדשנית להתערבות משלוח RNA שכרוכה התייבשות בתמיסת מלח והחזרת נוזלים עם טיפה אחת של מים המכילים RNA להתערב. גישה זו אין לחתוך את העלויות כרוכות בטבילת בעלי חיים שלמה, אבל הוא יקר יותר מאשר microinjection ועשויה להיות מוגבלת בבקשתו למינים שיכולים לסבול לחצים האוסמוטי גבוהים. יתר על כן, קשה לדמיין איך טבילה או מתודולוגיה טבילה / התייבשות התייבשות יכולה להיות מותאמת לבקרת וקטור בתחום. מסיבות אלה, ללימודי פוסט-עובריים, לידה בהתערבות RNA עם אוכל לבלוע היא אסטרטגיה חלופית בת קיימא. למרות שאסטרטגיות מבוססות בליעה לא עובדות בכל מיני החרקים, אולי בעיקר melanogaster דרוזופילה, משלוח אוראלי של התערבות RNA מעורבב עם מזון קידם si הגןlencing במגוון רחב של חרקים 8,17 א כולל, מבוגרים aegypti 18. שתארנו RNAi בתיווך ננו-חלקיקי chitosan בא זחלי gambiae 19 ויישם גישה זו של הפחתה של ביטוי גנים בא בהצלחה זחלי aegypti 20,21. כאן, מתודולוגיה להליך RNAi זה, הכולל כולא בהתערבות RNA על ידי chitosan הפולימר, היא מפורטת. Chitosan / חלקיקי RNA להתערב נוצרים על ידי הרכבה עצמית של polycations עם התערבות RNA באמצעות הכוחות אלקטרוסטטיים בין מטענים החיוביים של קבוצות אמינו בchitosan ומטענים שליליים המבוצעים על ידי קבוצות פוספט בעמוד השדרה של התערבות RNA 19. ההליך המתואר תואם עם שתי מולקולות ארוכות dsRNA (להלן כפי dsRNA) או גדילים כפולים siRNA (להלן כפי siRNA). סינתזה, chitosan / חלקיקי RNA להתערב הבאים מעורבבים עם מזון זחל ונמסרו לזחלים באמצעות בליעה דרך הפה. מתודולוגיה זו היא זולה יחסית, דורשת ציוד ועבודה 19 קטנים, ומאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של פנוטיפים מרובים, כוללים ניתוח של התנהגויות 20,21. מתודולוגיה זו, אשר יכולה להיות מותאמת ללימודי השתקת גנים בחרקים אחרים, כוללים וקטורי מחלה אחרים ומזיקים בחקלאות חרקים, העלול לשמש להשתקת גנים במגוון רחב של בעלי חיים אחרים. יתר על כן, chitosan, פולימר זול, שאינו רעיל ומתכלה 22, עלול להיות מנוצל בתחום של בקרת מינים ספציפי יתושים.

<table><tbody><tr><td>0.02 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR20</td><td>for resuspension of interfering RNA</td></tr><tr><td>0.2 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR200</td><td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>0.5 ml graduated tube&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-120</td><td>for aliquoting resuspended interfering RNA</td></tr><tr><td>1 ml pipetteman</td><td>Rainin</td><td>PR1000</td><td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>1.5 ml graduated tube&amp;nbsp;</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-408-046</td><td>for preparation of interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>1M Sodium Acetate, pH 4.5</td><td>TEKnova</td><td>S0299</td><td>to prepare sodium acetate buffer</td></tr><tr><td>Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade</td><td>BDH</td><td>VWR BDH3092-500MLP</td><td>to prepare sodium acetate buffer</td></tr><tr><td>Agarose Genetic Technology Grade</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>800668</td><td>to coat prepared interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf AG</td><td>5415D</td><td>to pellet interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Chitosan, from shrimp shells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646-25G</td><td>to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Dry Yeast</td><td>Universal Food Corp</td><td>NA</td><td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>E-RNAi tool</td><td>German Cancer Research Center</td><td>NA</td><td>for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td></tr><tr><td>goldfish food</td><td>Wardley</td><td>Goldfish FLAKE FOOD</td><td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Heated water bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>51221048</td><td>to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Ice</td><td>not applicable</td><td>not applicable</td><td>for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-591-44</td><td>for storage of ice used during the procedure</td></tr><tr><td>liver powder</td><td>MP Biomedicals LLC.</td><td>900396</td><td>to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment</td></tr><tr><td>Microwave oven</td><td>A variety of vendors</td><td>not applicable</td><td>to prepare 2% agarose solution</td></tr><tr><td>petridish (100 x 15 mm)</td><td>Fischer Scientific</td><td>875713</td><td>interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae</td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>S220</td><td>for preparation of buffers</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-640</td><td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Thermo Scientific/Dharmacon</td><td>custom</td><td>for preparation of siRNA/nanoparticles</td></tr><tr><td>Sodium Sulfate, Anhydrous (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>BDH/distributed by VWR</td><td>VWR BDH0302-500G</td><td>to prepare 50 mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>VWR</td><td>61066-046</td><td>to measure the water bath temperature</td></tr><tr><td>Tooth picks</td><td>VWR</td><td>470146-908</td><td>for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets</td></tr><tr><td>Ultralow freezer</td><td>A variety of vendors</td><td>not applicable</td><td>for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-216-108</td><td>for preparation of chitosan/interfering RNA</td></tr><tr><td>Weight paper</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC9798735</td><td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td></tr></tbody></table>

chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae

יתושי וקטור לגרום יותר סבל אנושי מכל אורגניזם אחר - ולהרוג יותר ממיליון אנשים בכל שנה. פרויקטי הגנום היתוש הקלו מחקר בהיבטים חדשים של ביולוגיה יתושים, כוללים מחקרים גנטיים תפקודיים בווקטור העיקרי אפריקה המלריה אנופלס gambiae ודנגי וקדחת צהובה וקטור Aedes aegypti. השתקת interference- RNA (RNAi-) בתיווך הגן נעשתה שימוש כדי למקד את הגנים של עניין בשני מיני יתושים וקטור מחלה אלה. כאן אנו מתארים הליך להכנת chitosan / מפריעים חלקיקי RNA שמשולבים עם אוכל ומעובדים על ידי זחלים. זה תפוקה גבוהה מבחינה טכנית פשוטה, ומתודולוגיה זולה יחסית, אשר תואם עם RNA הארוך גדילים הכפול (dsRNA) או מולקולות קטנות מפריעות RNA (siRNA), היו בשימוש כבר מציאה המוצלחת של מספר גנים השונים בא gambiae וא &#39; aegyptiזחלים. בעקבות האכלות זחל, מציאה, אשר מאומת באמצעות qRT-PCR או הכלאה באתר, יכולים להימשך, לפחות עד השלב מאוחר גלמים. מתודולוגיה זו עשויה להיות ישימה למגוון רחב של יתושים ומיני חרקים אחרים, כוללים מזיקים בחקלאות, כמו גם אורגניזמים שאינם מודל אחרים. בנוסף לשירות שלה במעבדת המחקר, בעתיד, chitosan, פולימר זול, שאינו רעיל ומתכלה, עלול להיות מנוצל בתחום.

<html> א gambiae: חלקיקי Chitosan / dsRNA נוצרים כתוצאה מהאינטראקציה אלקטרוסטטית בין קבוצות אמינו של chitosan וקבוצות פוספט של dsRNA. היעילות של שילוב dsRNA לתוך חלקיקים היא בדרך כלל מעל 90%, כפי שנמדד על ידי דלדול של dsRNA מהפתרון. תמונות במיק...

Watch this Scientific Journal Video about Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae at JoVE.com

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  Kansas State University.  כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים. 

Video: Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran insects account for a number of economically substantial pests of plants that cause damage to crops by feeding on phloem sap. The brown marmorated stink bug (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) and the Asian citrus psyllid (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) are hemipteran insect pests introduced in North America, where they are an invasive agricultural pest of high-value specialty, row, and staple crops and citrus fruits, as well as a nuisance pest when they aggregate indoors. Insecticide resistance in many species has led to the development of alternate methods of pest management strategies. Double-stranded RNA (dsRNA)-mediated RNA interference (RNAi) is a gene silencing mechanism for functional genomic studies that has potential applications as a tool for the management of insect pests. Exogenously synthesized dsRNA or small interfering RNA (siRNA) can trigger highly efficient gene silencing through the degradation of endogenous RNA, which is homologous to that presented. Effective and environmental use of RNAi as molecular biopesticides for biocontrol of hemipteran insects requires the in vivo delivery of dsRNAs through feeding. Here we demonstrate methods for delivery of dsRNA to insects: loading of dsRNA into green beans by immersion, and absorbing of gene-specific dsRNA with oral delivery through ingestion. We have also outlined non-transgenic plant delivery approaches using foliar sprays, root drench, trunk injections as well as clay granules, all of which may be essential for sustained release of dsRNA. Efficient delivery by orally ingested dsRNA was confirmed as an effective dosage to induce a significant decrease in expression of targeted genes, such as juvenile hormone acid O-methyltransferase (JHAMT) and vitellogenin (Vg). These innovative methods represent strategies for delivery of dsRNA to use in crop protection and overcome environmental challenges for pest management.

This article demonstrates novel techniques developed for oral delivery of double-stranded RNA (dsRNA) through the vascular tissues of plants for RNA interference (RNAi) in phloem sap feeding insects.

שיטות משלוח כפול גדילי RNA אוראלי לזירוז התערבות RNA שיפה וחרקים Hemipteran צמח sap-האכלה

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Environment

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

שימוש Densovirus יתוש רקומביננטי כמו וקטור משלוח ג'ין לניתוח פונקציונלי של גנים רימות היתוש

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Developmental Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi בתיווך ג&#39;ין מציאה ו<em&gt; In vivo</em&gt; Diuresis Assay ב נקבה בוגרת<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; יתושים

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

<meta charset="utf8"></head><body>הזנת dsRNA בתיווך ננו-חלקיקים להשתקת גנים בזחלי תולעי משי

Larval RNA Interference in Silkworm Bombyx mori through Chitosan/dsRNA Nanoparticle Delivery

The silkworm, Bombyx mori, is an important economic insect with thousands of years of history in China. Meanwhile, the silkworm is the model insect of Lepidoptera with a good accumulation of basic research. It is also the first insect in Lepidoptera with its complete genome sequenced and assembled, which provides a solid foundation for gene functional study. Although RNA interference (RNAi) is widely used in reverse gene functional study, it is refractory in silkworms and other Lepidopteran species. Previous successful RNAi-related research to deliver double-stranded RNA (dsRNA) was performed through injection only. Delivery of dsRNA through feeding is never reported. In this article, we describe step-by-step procedures to prepare the chitosan/dsRNA nanoparticles, which are fed to the silkworm larvae by ingestion. The protocol includes (i) selection of the proper stage of silkworm larvae, (ii) synthesis of dsRNA, (iii) preparation of the chitosan/dsRNA nanoparticles, and (iv) feeding the silkworm larvae with chitosan/dsRNA nanoparticles. Representative results, including gene transcript confirmation and phenotype observation, are presented. dsRNA feeding is a simple technique for RNAi in silkworm larvae. Since silkworm larvae are easy to rear and large enough to operate, it provides a good model to demonstrate larval RNAi in insects. In addition, the simplicity of this technique stimulates more student involvement in research, making silkworm larvae an ideal genetic system for use in a classroom setting.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: קידום מחקר השתקת גנים בתולעי משי עם העברת dsRNA באמצעות הזנת ננו-חלקיקי צ'יטוזן

Presented here is a protocol for chitosan/dsRNA nanoparticle delivery in silkworm Bombyx mori larvae to induce gene silencing through ingestion.

התערבות RNA זחל בתולעי משי Bombyx mori באמצעות Chitosan/dsRNA אספקת ננו-חלקיקים

The silkworm, Bombyx mori, is an important economic insect with thousands of years of history in China. Meanwhile, the silkworm is the model insect of ...

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video