We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.

סינתזה 1. הכנת dsRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזיהוי אזור 200-800 נ&quot;ב מציאה (על מנת ליצור את dsRNA המקביל) בתוך הגן של עניין כי הוא נבא כי אין השפעות חוץ-המטרה מזוהות (למשל, לא נ&quot;ב רצף הומולוגיה ≥18 בתוך גן אחר) ו שליטה שלילית (למשל , רצף Heterologous כי הוא אינו נוכח בתוך הגנום חרק היעד, כגון הגן lacZ Escherichia coli (GenBank ג&#39;ין מזהה: 945,006). לחלופין, להשתמש כביקורת חיובית (למשל, אשר מניב פנוטיפ ציין בקלות, כגון SRPN2 21,22 ג&#39;ין מזהה, GenBank:. 1270169) רצף של SRPN2 מיקוד dsRNA מוגדר מישל ואח &#39;(2005) 21.. הערה: E-RNAi הוא משאב bioinformatic קוד פתוח כי הוא שימושי עבור זיהוי של אזורים כאלה ועבור בתהליך של תכנון פריימרים oligonucleotide 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע standard PCR הגברה (כלומר, הופיעה עם תקי DNA פולימראז באמצעות 30-35 מחזורים) באמצעות הדנ&quot;א הגנומי או תבנית cDNA להשיג תבנית סינתזה dsRNA מוקף רצף האמרגן T7 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &#39;) ו ממשיך בהכנות dsRNA ו לנקות בעזרת ערכת שעתוק מסחרית במבחנה לפי הוראות יצרן. השתמש SRPN2 PCR תנאי הגברה ומידע פריימר כפי שהוצג ב An et al. (2011) 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת תשואות amplicon RNA מטוהרים על ידי ספקטרוסקופיה ספיגת אולטרה סגול באורך גל של 260 ננומטר ולהתאים את הריכוז הרצוי (למשל, 3 מיקרוגרם / μl) במים RNase חינם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון בעיות ריכוזים RNA נמוך, להפחית נפח הנוזל על ידי ספינינג דגימות למטה בצנטריפוגה ואקום בטמפרטורת החדר או על ידי lyophilizing דגימות reconstituting בכמויות קטנות יותר של מים. הזמן הדרוש lyophilization מדגם ישתנה בהתאםעל כרכי מדגם ראשונים ריכוזי dsRNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את איכות ואורך של dsRNA על ג&#39;ל 2% agarose מוכן עם 1x TBE או טה חיץ מוכתם ברומיד ethidium (EtBr), יחד עם תבנית ה- DNA משמש התגובה שעתוק. DsRNA יהגר לאט יותר תבנית ה- DNA. איכות ואורך ניתן להעריך על ידי ומבטיח לא קיימים מוצרים dsRNA הלא ספציפית על ידי השוואת מוצרים בטוש DNA סטנדרטי, בהתאמה. הערה: EtBr הוא mutagen חזק יש לטפל בהתאם. הערה: בריכוז dsRNA של 3 מיקרוגרם / μl, 0.5 μl של המדגם הוא יותר מהדרוש להדמיה על הג&#39;ל agarose מוכתם EtBr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן dsRNA ב -20 ° C עד הצורך. מחזורי הקפאה / פשרה מרובות עלולים לגרום שפלה, כך aliquots אמור להיות מוכן עבור כמויות גדולות של dsRNA. </li></ol> 2. כן המהיר גרין FCF דיי (FGD) צינורות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל צבע ירוק FCF מהירמפתרון המניות (תוכן לצבוע ≥85%) ל -0.1% (v / v) (הפתרון עובד) במים RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 1 μl של צבע לתוך החלק התחתון של צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום צינורות בתוך גוש חום 65 מעלות צלזיוס למשך כ 3 שעות להתאדות צינורות במקום נוזל, אז בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות, כדי לקרר לפני השימוש. מוצק צבע יבש זה יהיה לשקם בתמיסה resuspension dsRNA. </li></ol> 3. מחט הזרקת Pull <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך מחטים זכוכית בורוסיליקט באמצעות חולץ מחט מחוממת בקוטר טיפ של 10-30 מיקרומטר. משוך הגדרות מתאימות: מחמם התאמה לא. 1 = 100, התאמת מחמם לא. 2 = 70. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע ניזק טיפ הנאה של המחט, למקם את כל מחטי המשך אופקיים בצלחת פטרי על רצועת קריצה מרק. הערה: פרטים נוספים על מחט נימי משייכת שיטות ניתן למצוא פרטים נוספים על מחקר המלריה והפנית מגיב מרכז משאבי MR4 ידנית 24. </li></ol> 4. כן תחנת הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף חומרים דרושים: מחטי הזכוכית microcapillary משכו עד קצה קנס, microinjector, נייר סינון דק נייר סינון עבה, צלחות פטרי, טפטפות העברה, מברשת צבע מיקרוסקופ אור לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את microinjector כפי שהורה במדריך microinjector, ולהגדיר נפח הזרקת נפח רצוי לכל דופק (למשל, לכל היותר 69 nl לכל דופק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על פלטפורמה קלה לתמרן במיקרוסקופ (למשל, צד שטוח של מתלת צינור קלקר), לערום את גיליונות נייר שני פילטר עם נייר הסינון הדק על גבי, ובטוח עם קלטת מסביב לקצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 10 μl של כל פתרון dsRNA צינורות לצבוע בצבע נפרד, ומניחים על קרח. </li></ol> 5. איסוף גלמים עבור הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים קטן 60 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ צלחת פטרי עם 10 מ&quot;ל של מים ללא יונים, ולאסוף ~ 50 גלמים חיוור (דוריng התגלמות 24 שעות לאחר הראשון) מתוך מגש insectary בעזרת פיפטה העברת פלסטיק חד פעמיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר גלמים שיש בינוני עד שיזוף לציפורן כהה. הערה: לאחר לציפורן מתחילה להשתזף, הוא הופך להיות יותר קשה לחדור לציפורן, ותוצאות הזרקה קטלנית גבוהה בהרבה. </li></ol> 6. הזרקת dsRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת המיקרוסקופ לנתח, לנתק את קצה דיסטלי של מחט הזריקה עם זוג מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחט הזריקה ידי למלא את משבצות המחט עם שמן מינרלים (באמצעות מזרק עם מחט 3 אינץ &#39;, 30 מד), וגירוש עודפי שמן עם microinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזית למלא מחט זריקה עם סכום מקסימאלי של dsRNA, והוצא דופק אחד תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את המחלק של נוזל. בכל מקרה שבו לא נוזלי נלקח למעלה / או גורשו, לבדוק את קצה דיסטלי של המחט עבור כל חסימה ולהבטיח כי המחט מאובטח היטב microinjector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 1-3 גלמים, ומניחים אותם על נייר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות המכחול, מקם את הגלמים על נייר פילטר עם גב לציפורן נגיש, ולהשתמש במכחול לדחוף על נייר סינון ולספוג של עודפי מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצב את הגולם עם קצה המכחול, ולהכניס את המחט לתוך לציפורן הגבה בין בית החזה והבטן בזווית של כ 30 מעלות ביחס לפני השטח הגבי של הגולם. הזרקת צריכה להיות מופנית כלפי הקצה האחורי של גולם ואת המחט צריך להתרגש בכיוון הקדמי אל האחורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק שני פולסים (69 nl לכל הדופק) של 3 מיקרוגרם / פתרון dsRNA μl לתוך hemolymph, ולבדוק לחלוקת צבע בכל הגוף. אם אין צבע מזוהה, להעביר את מיקום המחט הזרקת מעט כדי לנקות את קצה מחסימה וחזור משלוח נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מכחול הרטוב לעבור גולם בעדינות את המחט לתוך מים עבור culturing. Tהוא גולם צריך להיצמד המכחול לנוגע אור. </li></ol> 7. תנאים לאחר הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת פטרי עם גלמים מוזרק לתוך כלוב יתושים עם זרימת אוויר מתאים (למשל, כלוב רשת או מיכל עם מכסה רשת). תנאי גידול גלמי צריכים להישאר עקבי 27 ± 3 ° C טמפרטורה, 75 לחות ± 5% ולהיות תחת אור: חושך מחזור של 16: 8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10% (w / v) פתרון גלוקוז, ומניח כדור צמר גפן רווי פתרון כלוב יתושי רשת האכלה מבוגרת. </li></ol> 8. הערכת מציאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב נקודות הרצוי (ים), להעריך פנוטיפים בחרקים ניסיוני dsRNA מוזרק, בהשוואה לקבוצת הביקורת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך חרקי dsSRPN2 ו dsLacZ מדי יום על ידי מצמרר למטה מבוגרים במשך כ 2-3 דקות ב -20 מעלות צלזיוס, והעביר צלחת קרה ב -2 מעלות צלזיוס וזיהוי כל היווצרות פסאודו-סרטנית על ידי ניצול של מיקרוסקופ לנתח ב 15Xגדלה עם תאורת brightfield. לאחר הערכה, לחזור מבוגרים לתנאי insectary (27 ± 3 מעלות צלזיוס, 75 ± 5% לחות). הערה: dsRNAs הניסיון ושליטה מועסק בפרוטוקול זה dsSRPN2 ו dsLacZ, בהתאמה. ישנן אפשרויות רבות מתאימות שולטים; עם זאת, הוא הציע כי שליטה חיובית עבורו פנוטיפ ו / או הביטוי היא דמיינו בקלות (למשל, על ידי לנתח מיקרוסקופיה) ו / או לכמת [למשל, בזמן אמת PCR כמותי (qRT-PCR), כתם המערבי] אמור לשמש כאשר לומדים את הטכניקה הזו. חלבון SRPN2 וכימות תמליל באמצעות כתם המערבי qRT-PCR, בהתאמה, מתוארים מישל et al. (2005) 21. </li></ol></li></ol>

<ol><li>World Health Organization. World Malaria Report. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/topics/malaria/en">http://www.who.int/topics/malaria/en</a> (2014).</li>
<li>Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplicity+of+malaria+transmission%3A+a+review+of+entomological+inoculation+rate+measurements+and+methods+across+sub-Saharan+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa.</a> Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).</li>
<li>The malERA Consultative Group on Vector Control. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Research+Agenda+for+Malaria+Eradication%3A+Vector+Control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control.</a> PLoS Med. 8 (1), e1000401(2011).</li>
<li>Enyati, A., Hemmingway, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Management%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+of+Entomol%22%5BJournal%5D)">Malaria Management: Past, Present, and Future.</a> Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).</li>
<li>Edi, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP6+P450+Enzymes+and+ACE-1+Duplication+Produce+Extreme+and+Multiple+Insecticide+Resistance+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae.</a> PLoS Genet. 10 (3), 1004236(2014).</li>
<li>Mitchell, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+Target-Site+Mechanisms+Combine+to+Confer+Strong+DDT+Resistance+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92662(2014).</li>
<li>Knox, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+online+tool+for+mapping+insecticide+resistance+in+major+Anopheles+vectors+of+human+malaria+parasites+and+review+of+resistance+status+for+the+Afrotropical+region%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Vector%22%5BJournal%5D)">An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region.</a> Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).</li>
<li>Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+a+Chimeric+Chalcone+Synthase+Gene+into+Petunia+Results+in+Reversible+Co-Suppression+of+Homologous+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes.</a> Plant Cell. 2, 279-289 (2002).</li>
<li>Sen, G. L., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+RNAi%3A+the+silence+of+the+genes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A brief history of RNAi: the silence of the genes.</a> FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).</li>
<li>Romano, N., Macino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quelling%3A+transient+inactivation+of+gene+expression+in+Neurospora+crassa+by+transformation+with+homologous+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences.</a> Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Catteruccia, F., Levashina, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+in+the+Malaria+Vector%2C+Anopheles+gambiae%3A+Therapeutic+Applications+of+RNAi%3A+Methods+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols.</a> Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).</li>
<li>Garver, L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+RNAi+Assays+in+Adult+Mosquitoes+%28A%29%5BTitle%5D)+AND+%22gambiae%29.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A).</a> gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230(2007).</li>
<li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2FsiRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).</li>
<li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Aedes+aegypti+Olfactory+System+Development+through+Chitosan%2FsiRNA+Nanoparticle+Targeting+of+semaphorin-1a%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).</li>
<li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2Fdouble-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+%28Anopheles+gambiae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan%2FInterfering+RNA+Nanoparticle+Mediated+Gene+Silencing+in+Disease+Vector+Mosquito+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae.</a> J. Vis. Exp. (97), e52523(2015).</li>
<li>Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+RNAi+based+microalgal+larvicide+to+control+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+World+J%22%5BJournal%5D)">Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes.</a> Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).</li>
<li>Huvenne, H., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+dsRNA+uptake+in+insects+and+potential+of+RNAi+for+pest+control%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review.</a> J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).</li>
<li>Burand, J. P., Hunter, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi%3A+Future+in+insect+management%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">RNAi: Future in insect management.</a> J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).</li>
<li>Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+SRPN2+facilitates+midgut+invasion+by+the+malaria+parasite+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei.</a> EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).</li>
<li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li>
<li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-RNAi%3A+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).</li>
<li>Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedict%2C+MQ+%22Methods+in+Anopheles+Research%22">Methods in Anopheles Research</a>. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center. (2014).</li>
<li>Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+rearing+temperature+and+larval+density+on+larval+survival%2C+age+at+pupation+and+adult+size+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol.+Exp.+Appl%22%5BJournal%5D)">Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae.</a> Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).</li>
<li>Michel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+melanizing+activity+in+Anopheles+gambiae+does+not+affect+development+of+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).</li>
<li>Harker, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Profiling+Associated+With+Life+Cycle+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae.</a> J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).</li>
<li>Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+pupal-specific+cuticular+protein+genes+in+the+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).</li>
<li>Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pupal+cuticle+proteins+of+Manduca+sexta%3A+characterization+and+profiles+during+sclerotization%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).</li>
<li>Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profile+of+cuticular+genes+of+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori.</a> BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).</li>
<li>Zhou, X., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+specifies+pupal+development+and+mediates+the+%26%2334%3Bstatus+quo%26%2334%3B+action+of+juvenile+hormone+on+the+pupal-adult+transformation+in+Drosophila+and+Manduca%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Broad specifies pupal development and mediates the &#34;status quo&#34; action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca.</a> Development. 129, 2259-2269 (2002).</li>
<li>Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+four+Toll+related+genes+during+development+and+immune+responses+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).</li>
<li>Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-related+receptors+and+the+control+of+antimicrobial+peptide+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).</li>
<li>Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CecC%2C+a+cecropin+gene+expressed+during+metamorphosis+in+Drosophila+pupae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae.</a> Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).</li>
<li>Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Insect+Metamorphosis%3A+a+Microarray-Based+Study+of+Larval+and+Adult+Gene+Expression+in+the+Ant+Camponotus+Festinatus%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus.</a> Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).</li>
<li>Cook, P. E., Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+Anopheles+gambiae+mosquitoes+for+adult+age+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Bio%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation.</a> Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).</li>
<li>Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serpin+gene+family+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The serpin gene family in Anopheles gambiae.</a> Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).</li>
<li>Araujo, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+of+the+salivary+gland+nitrophorin+2+in+the+triatomine+bug+Rhodnius+prolixus+%28Hemiptera%3A+Reduviidae%29+by+dsRNA+ingestion+or+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection.</a> Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).</li>
<li>Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+with+the+allatoregulating+neuropeptide+genes+from+the+fall+armyworm+Spodoptera+frugiperda+and+its+effects+on+the+JH+titer+in+the+hemolymph%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph.</a> J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).</li>
<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li>
</ol>

גישה פתוחה עבור מאמר וידאו זה הוא שלם על ידי ביוג&#39;ן.

שיטות קיימות כיום גרימה הלא מהונדס RNAi ב יתושים כרוכים הזרקה ישירה של dsRNA לתוך מבוגר hemocoel 12,13 או האכלת זחל של RNAi מצופה הדק חלקיקי 14-17 או microalgae מבוסס dsRNA מולקולות 18. מיקוד היתוש הבוגר, בעוד יקר מאוד, יכול לכלול מספר רב של גנים שפועלים בתקופות התפתחותי מוקדם יותר. מציאה ביוזמת האכלת זחל עשויה להניב פנוטיפים עקביים במהלך לשלב הבוגר הנובע, בין שאר, על הפוטנציאל של התמדת חלבון משתנית דרך שלב הגלמים. לכן, מציג שיטה נוספת כי הוא מכוון באופן ספציפי על ייזום RNAi במהלך התפתחות גלמי יספק אמצעי באופן מלא יותר להעריך פונקציות גנים במהלך שלבי התפתחות טרום מבוגר, כמו גם יכול משופרים להעריך תפקוד גן בשלבי בוגרים. כמו עם גישת גן מציאה המבוססת על הזרקת dsRNA או ביטוי, ההתמדה של גן המציאהלא ניתן לחזות. לכן, רמות תעתיק או חלבון יש לבחון עבור הגן של עניין בתקופות ההתפתחותי של עניין. למרות שאנו רואים המשך של ירידה ברמות חלבון ביום 5 לאחר ההזרקה עבור SRPN2 ב SRPN2 חיות dsRNA מוזרקות, גורמים כגון מחזור חלבון מחצית חיים יכולים להיות שונים עבור מטרות שונות. זה קריטי כדי להבטיח, כמו גם, כי dsRNA לשמש להזרקה הוא גם מרוכז ומופיע ללא פגע על ג&#39;ל agarose. אנו ממליצים הנסיינים מחדש גורמים אלה אם תוצאות מציאה אינן מספיקות, וריכוזים בהתאמה של dsRNA ייתכן שיהיו הצורך להיבדק באופן אמפירי עבור מטרות גן ספציפיות. אנו מתארים שיטה לייזום של התערבות RNA בשלב הגלמים של An. פיתוח gambiae. שיטה זו מסתמכת על כניסתה באמצעות microinjection של dsRNA ישירות לתוך hemocoel של גלמים מוקדמים ומאפשרת הערכה של איכות הזרקה ידישימוש dsRNA שכותרתו לצבוע. היכולת לחזות איכות הזרקה מהווה שיפור חיוני להבטחת מציאה מוצלחת ומהווה היבט של מציאת גן מבוסס הזרקה כי לא נדונה פרוטוקולים ביותר שדווחו בעבר מבוסס dsRNA התמקדות בשלב הבוגר. על ידי מיקוד הגולם בתחילת תקופה התפתחותית זו, גנים שעשויים לשחק תפקיד בפרק זמן התפתחותי קריטי זה, או במהלך השלבים המוקדמים של בגרות ניתן להעריך מבחינה תפקודית. בנוסף, שיטה זו עשויה לאפשר משלוח dsRNA לתאים, והקמת התערבות RNA בתאים נגישים במהלך המטמורפוזה, אבל פחות נגישה יתושים בוגרים נוצרו באופן מלא. ניתוח microarray לאחרונה על ידי הארקר et al. (2012) זיהו 560 An. תמלילי gambiae שהיו למעלה מוסדר או למטה מוסדר על ידי פי 4 לפחות בשלבים התפתחותיים שונים, הנעים בין העובר לבוגר. של 560 תמלילים מזוהים, סט של 309 היה למעלה מוסדר במהלך התפתחות גלמי 27. ממצאים אלה מראים כי יש דרישות רבות עבור ביטוי גני הפרש לאורך פיתוח יתושים, כוללות אלה המתרחשים בשלב הגלמים, מרווח שבמהלכו האורגניזם עובר מטמורפוזה. במינים רבים של חרקים, כולל. gambiae, גנים המעורבים בתהליכים כגון פיתוח (כלומר, cuticular גלמי וחלבונים קושרי כיטין) 27-31 התגובה החיסונית (כלומר, חלבונים דמויי קולטן אגרה) 27,32-34 מתבטאים ביותר בשלב גלמי. לאחר מבוגר מגובש לגמרי התפתח, שם הוא המשיך ביטוי גנים בתגובה סביבתי פיסיולוגי משנה 35. יש לציין, במהלך ההתפתחות הבוגרת מוקדם, יש עלייה בביטוי של גנים התפתחותיים (כלומר, cuticular מבוגר וחלבונים sarcoplasmic) 36, וכן גנים מרכזיים אחרים (כלומר </em&gt;, חלבון הזרע ספציפי ציטוכרום P450 אנזימי מטבוליזם) 27,36. הביקורת החיובית לשמש בפיתוח של זה פרוטוקול, SRPN2, הוא An. מעכב פרוטאז סרין gambiae (סרפין). SRPN2 ממלא תפקיד חשוב בוויסות שלילית של melanization חרקים, תגובה חיסונית מולדת קשת רחבה בחרקים 21,22. מציאה של SRPN2 בתוצאות יתושים בוגרים היווצרות פסאודו גידול 21,22, פנוטיפ כי הוא ציין בקלות על ידי השימוש במיקרוסקופ אור. בהתחשב בכך פנוטיפ המובחן זה יכול להיות בקיע בקלות חרקי חיים, השתמשנו SRPN2 זריקות RNAi בשלב גלמים ראשוניים. בנוסף, SRPN2 מתבטא במהלך כל שלבי התפתחות 37, ובכך לספק מטרה טובה להזרקת RNAi בשלב גלמים והערכה של תפקוד אצל מבוגר מוקדם. אנו מראים כי השיטה שפיתחנו מסוגלת pseud דומה למבוגרים melanotic התרמה<html> היווצרות o גידולים כתוצאת זריקות dsRNA בצעו בשלב הגלמים של פיתוח. בפיתוח פרוטוקול זה, ראינו הזרקה כי במהלך התפתחות גלמי מוקדם (כלומר, השעה 24 הראשונים שלאחר נשירת זחל-הגלמים) היא קריטית להשגת הופעתה המבוגרת אופטימלית. במקרה הופעתה עניה מתקבלת לאחר הזרקה, מומלץ זמני זחלים עם דיוק רב יותר, כדי להשיג גלמים עם התקשות לציפורן נרחבת פחות ולהבטיח הזרקה בשלב גלמים מוקדם מושגת. יתר על כן, מזעור ניזק התוצאות לציפורן בשיעורי הופעתה אופטימליים גדלת הגדלה במהלך ההזרקה יכול לעזור להבטיח שהאזור המיועד אך ורק של החיה הוא נקב. אם המחט צריכה לנקב דרך לציפורן הגחון, והאיגום הנוזל צבען שכותרתו יהיה ניכר על הצד החיצוני של הגולם או יהיה להרוות את נייר הסינון. מומלץ מאוד להשליך מעליו כל גלמים שיש להן יותר לנקב לציפורן אחת. jove_content &quot;&gt; עם החוויות הנרחבות של מעבדות רבות עם הביצועים של זריקות יתושים בוגרות, גישות microinjection זוהו בעבר ניתן להתאים עם שינויי פרוטוקול פשוטים לשימוש בניסויי RNAi גלמים. בסך הכל, המטרה של שיטה זו היא לספק לחוקרים את היכולת ניתן לבצע להרחיב את מסגרת הזמן שבמהלכה הפוכה אנליזה גנטית, נוסף המאפשר מחקר יתמוך בפיתוח של אסטרטגיות בקרת וקטור הרומן. מעניין לציין, כי ניסויים במינים אחרים, כגון Rhodnius prolixus ו frugiperda Spodoptera, לחשוף גן תופעות השתקה נוטים להיות הרבה יותר באופן יזום במהלך מבוגר מראש טיולי 38,39. במהלך כל שלבי פיתוח, הגן בתיווך RNAi מציאה כפוף לשיקולים בדבר המהירות וההתמדה של להשתקת גנים, ואת היציבות של חלבונים המקודדים על ידי גנים ממוקדים. מטרת RNAi האידיאלית גנים נוטים להיות אלה לקודד protein או RNA כי יש זמן מחצית חיים קצר ושיעור תחלופה גבוהה 11,40. בעוד אסטרטגיות RNAi מהונדסות יכולות להיות מועסקות גם לטפל שיקולים לגבי מהירות והתמדה של RNAi בשלבי טרום מבוגר, טכניקות מהונדסות יש חסרונות רבים (למשל, זמן הנדרש לייצור קווים מהונדסים, מסגרות זמן ניסוי עבור הזדווגויות יתושים לייצר חרקים עם ביטוי dsRNA מוסדר, ותחזוקה של מניות מהונדסות). לעומת זאת, הפרוטוקול שלנו מספק לו שיטה קלה ומהירה עבור ייזום מציאת גן במהלך התפתחות גלמי ו בסוגי תאים שמקורם והם נגישים במהלך המטמורפוזה אבל הם פחות נגישים במבוגרים. שימוש השעיות dsRNA שכותרתו לצבוע מאפשר הערכה קלה של הצלחת הזרקה ופיזור החומר הציג בתוך גלמים. הנתונים שלנו על תחילת היווצרות גידולים אצל מבוגרי גלמים מוזרקים, לעומת חיות המוזרקות כמבוגרים, עולים בקנה אחד עם initiation של RNAi בתיווך מציאה בשלב הגלמים. באמצעות קו יתוש G3 שלנו ובתנאי insectary שלנו, אנו רואים את ההיווצרות פסאודו גידול melanotic המבוגר מוקדם ככל 10 ימים לאחר ההזרקה של מבוגרים מוזרקות שלושה עד חמישה ימים הופעתה פוסט. על ידי ביצוע הזרקה גלמי בשלב מוקדם, אנו צופים היווצרות פסאודו הגידול melanotic גלוי מוקדם ככל חמישה ימים לאחר ההזרקה (כלומר, שלושה עד ארבעה ימים לפרסם הופעתה). נתונים אלו מרמזים כי שיטה זו מאפשרת התחלת מציאת הגן במהלך תקופה התפתחותית תת למדה בעבר (כלומר, פיתוח גלמים). שיטת התיוג לצבוע שלנו יכולה להיות יעילה גם עבור פיתוח פרוטוקולי הזרקת זחל חדשים, בשל האופי השקוף של לציפורן במהלך כל instars הזחל. בעוד השליטה בשימוש במחקר זה דורשת התקדמות לתוך לשלב בוגר כדי להציג פנוטיפ מציאה, בניסויים עתידיים להעריך פנוטיפים בשלב ספציפי גולם לאחר הזרקה של גלמים מוקדם תספקתובנה חשובה לגבי ההתרחבות של שיטה זו לתוך תקופות התפתחותיות נוספות כגון פיתוח גלמים מאוחר. לסיכום, שיטה זו מספקת פרוטוקול RNAi ערך עבור ייזום בשלב גלמים של מציאת גן בתיווך RNAi ומרחיבה את כלי גנום התפקודי זמין לשימוש בתוך קהילת מחקר חרקי וקטור.

מלריה היא מחלה זיהומית יתושים המשפיעה מיליונים רבים של אנשים בכל שנה. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מדווח כי בשנת 2013 היו כ 584,000 מקרי מוות עקב מלריה, 78 אחוזים מהם התרחשו אצל ילדים מתחת לגיל חמש שנים 1. הפתוגנים שגורמים מלרית אדם הם טפילים נבגוניות בתוך Plasmodium הסוג והם מועברים בין מארחי האדם שלהם על ידי יתושי אנופלס נקבה. הילוכים מתרחשים כאשר היתוש לוקח ארוחת דם ביחיד נגוע, ולאחר מכן פיקדונות טפילים מזהם בתוך אדם נגוע בארוחת דם עוקבת. בתוך הסוג אנופלס, אנופלס gambiae הוא המין עם קיבולת וקטורים הגדולה הוא וקטור מלריה הבולטים באפריקה שמדרום לסהרה 1-3. נכון לעכשיו, בקרת וקטור יתושים על ידי פריסה של הדברה ממשיכה bדואר השיטה הגדולה מועסקת על מנת להפחית את הניטל של מלרית אדם. למרות השימוש הדברה מאז 1960 הוכיחה להיות מוצלח מאוד, עליית התנגדות חרקים העלתה צורך בפיתוח חומרי הדברה הרומן ואסטרטגיות בקרת וקטור אלטרנטיבה 4-7. במהלך שנת 2010, סך של 49 מתוך 63 מדינות דיווח ארגון הבריאות העולמי הצביע על התרחשות של התנגדות הדברה וקטורים מלריה 1. בנוסף, הכלי Mapper IR, אשר מנצל ספרות ביקורת עמיתים להעריך נתונים התנגדות באזורים Afrotropical, מדווח כי בין השנים 2001 ו -2012 היו 46% ו -27% עליות התנגדות pyrethroids ו dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT), בהתאמה 7. התערבות RNA (RNAi) זוהה בתחילת 1990 כטכניקה שיכול להיות מועסק על מנת להשבית את הגנים בצמח פטוניה 8,9 וב הפטרייה Neurospora crassa 9,10. זמןקצר לאחר מכן,בשנת 1998, RNAi תועדה לראשונה ב elegans Caenorhabditis כאמצעי לצמצום ביטוי גנים במודל חיה על ידי כניסתה של antisense או RNA פעמיים גדיל (dsRNA) באמצעות שיטות הזרקה או האכלה 9,11. מאז גילויו, RNAi יש מהפכה במרדף עידן הגנומיקה בכך שהוא מאפשר לחוקרים לנצל גנטיקה הפוכה כדי לחקור את התפקידים התפקודיים במהירות של גנים של עניין באמצעות מנגנון להשתקת גנים סלקטיבית מאוד שלאחר תעתיק. באורגניזמים מסוימים, כגון תסיסנית, שימוש האורגניזם מהונדס מבטאים בונים RNA מפריע הצליח נרחב עבור מציאת גן (KD). למרות השימוש transgenes ב An. gambiae עבור RNAi נוצל ועשוי להיות שימושי עבור מסכים בקנה מידה גדולה, הדור של זני יתושים מהונדסים הוא גם העבודה וזמן אינטנסיבי, לוקח בדרך כלל שניים עד שלושה חודשים כדי לעבור את זיהוי של גן המעניין את generatiעל של מנייה מהונדסת מתאימה 12. נכון לעכשיו, השיטה העיקרית של KD גן ב An. gambiae הוא בזריקה לתוך hemolymph, בשלב המבוגר, של dsRNA ספציפי גן מסוים 12,13. תהליך זה בדרך כלל לוקח בערך חודש ללכת מהזדהות של גן של עניין להערכה של KD הגן, להוכיח להיות הרבה יותר מהיר מאשר שיטות מהונדסות 12. שיטות-בשלב הזחל RNAi הוקמו לאחרונה ב An. gambiae ו Aedes aegypti באמצעות ננו-חלקיקי האכלת 14-17 או על ידי משלוח אוראלי של microalgae המבוסס dsRNA מולקולות 18, המציעות הזדמנויות לבצע ניתוח גנומי תפקודי במהלך בשלבים מוקדמים של פיתוח. ב הזרקה ישירה, האכלה, ושיטות משלוח nanoparticle, dsRNA נלקח באופן אוטונומי על ידי התא היעד ביקע ידי האנזים דייסר לתוך 21-25 נוקליאוטידים-ארוך &quot;קצר מפריעים RNAs&quot; (siRNAs) 19,20. siRNAs אלה אז incorporated לתוך השתקה המושרה RNA מורכב (RISC), שממנו גדיל אחד ייפסל, המאפשר במתחם RISC הנכנס RNA להיקשר ודבק mRNA היעד ובכך להפחית את רמתו ומעכבות ותרגומו 19,20. מאפיינים מהותיים רבים של ביולוגית יתוש בסיסית לווסת קיבולת וקטורים, לרבות נטייתו מארח (למשל, חוש ריח, gustation), הזדווגות, רבייה וחסינה. לאור החשיבות של תהליכים ביולוגיים אלה, סביר להניח כי האפנון שלהם ברמה גנטית או תרופתית יציע הזדמנויות חדשות עבור בקרת וקטור, כוללים עקיפה של התנגדות חרקים, ולספק כלים חדשים גישות משולבות רחב יותר לניהול וקטור. השימוש גנומיקה תפקודי להעריך את התפקידים של גנים הבסיסיים תכונות ביולוגיות המהותיות אלה יאפשר זיהוי של מטרות חדשות ולספק תובנה חדשות על איך אנחנו יכולים ליצור ביעילות חדשה, strateg שליטה אפקטיבית יותרies. אנו מתארים את הפיתוח ושימוש שיטת הזרקה מהירה לייזום RNAi בשלב הגלמים של An. gambiae. אנו צופים כי הזרקה בשלב גלמים של טריגר RNAi מאפשרת תצפית של פנוטיפים כתוצאה במבוגרים בשלב מוקדם, כלומר, במוקדם לאחר הופעתה מ יהיה ציין אם גן המציאה הופעל מבוגרים שלאחר הופעתה. שיטות זה מאפשרת מציאת גן מתחיל בזמן ההפסקה התפתחותי הגלמים והארכה לשלבים בוגרים, כך מציאת גן היזם במהלך התפתחות גלמי יכולה להתמיד להשפיע סוגי תאי hemolymph נגיש בוגרים מוקדמים, כמו גם סוגי תאים, כי הם יותר hemolymph-נגישים במהלך המטמורפוזה מאשר מבוגר, כגון עצב סנסורי נמצא נספחים מבוגרים לאחר הופעתה.

<table><tbody><tr><td>MEGAscript RNAi kit</td><td>Ambion</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II injector</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II foot switch</td><td>Drummond</td><td>3-000-026</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Glass micropipette puller</td><td>Narishigne</td><td>PB-7</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF dye</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td>Can substitute with a non-toxic food dye.</td></tr><tr><td>Plastic transfer pipettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>1371150</td><td>&amp;frac14; inch cut from tip to create a wider opening.</td></tr><tr><td>Whatman &amp;ldquo;thin&amp;rdquo; filter paper&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>1001-090</td><td>This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.</td></tr><tr><td>Western blot &amp;ldquo;thick&amp;rdquo; filter paper</td><td>BioRad</td><td>107-3931</td><td>This is the filter paper generally used for Western blots.</td></tr><tr><td>Petri dishes (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush (size 0)</td><td>Michael&amp;rsquo;s Art</td><td>10474940</td><td>Brush size and brand can vary based on availability and user preference.</td></tr><tr><td>Dissecting light microscope</td><td>&amp;nbsp;----&amp;nbsp;</td><td>-----</td><td>This can vary based on availability and user preference.</td></tr></tbody></table>

rnai trigger delivery into anopheles gambiae pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

הזרקת גלמים עבור תשואות KD גן תוצאות אופטימליות כאשר ההזרקה מתבצעת בשלב הגלמים מוקדם, כאשר רמות שיזוף לציפורן נמוכות (איור 1 א &#39;, שמאל, ו -1 B). גברת שיזוף והתקשות של לציפורן, בדרך כלל לאחר 24 שעות, תוצאות במוות גלמי עלה בעקבות הזרקה (איור 1 א, מרכז וימין). קצב ההתפתחות גלמי יכול להשתנות בהתאם לתנאי insectary וצפיפות בעלי חיים 24,25; ולכן, עדיף להעריך פיגמנטציה חזותית. במהלך תהליך ההזרקה, מחט הנימים מוכנס לתוך לציפורן הגב בזווית של כ -30 מעלות הקדמיות לכיוון אחורי (איור 2 א). לאחר המחט מוחדרת ואת dsRNA + 0.01% (w / v) FGD הוא חילק, חלוקת לצבוע ניכר ברחבי hemolymph (figuמחדש 2B). הערכת הופעתה מבוגרת גלמים הזריקה 0.01% (w / v) FGD חשף בשיעור ממוצע של הופעתה 70%, בהשוואה ל -96.7% הופעתה של בקרות שאינן מוזרק (איור 3 א). מן הראוי לציין כי הופעתה חלקית ממקרה גלמי נצפתה עבור מספר רב של יתושים שאינם שורדים (איור 3 ב). חיות מוזרקות להפגין ללא עיכובים בזמן הופעתה (איור 4 א) או השפעה מוטה משני המגדר (האיור 4B). הערכה נוספת של בוגר ששרד ביצע עד היום 10 הופעתה פוסט חושף שום השפעה ניכרת על הישרדות מבוגר שלאחר הופעתה (איור 4C). אימות של איכות KD הוערכה על ידי פסאודו הגידול melanotic (אשכול פיגמנט כהה רקמה) פנוטיפ הקשורים SRPN2 מציאה 21,22 כביקורת חיובית עבור מציאה ואת<html> בהעדר פנוטיפים הקשורים הזרקת dsLacZ כביקורת שלילית. יתושים למבוגרים שצצו דורגו ביום 8 לאחר הזרקה (יום 6-7 שלאחר ההופעה). Melanotic-גידולים פסאודו (איור 5 א ו 5 ב) נצפו באמצעות לציפורן של 93.5% של dsSRPN2 לעומת 0% מכלל היתושים הבוגרים dsLacZ (איור 6 א). אשכולות של רקמת melanized בקדרות זוהו על דיסקציה של טלאים פיגמנט (5C איור). פסיאודו גידולים נראו על לציפורן המבוגרת מוקדם ככל 3 יום-הופעתה פוסט ונכחו גם קבוצת משנה של hemolymph dsSRPN2 ורקמות בטן (מידע לא מוצג). בשעה 5 לאחר ההזרקה (בשלב הבוגר מוקדם), ירד משמעותית SRPN2 רמות dsSRPN2, אבל לא dsLacZ או מבודד חלבון hemolymph מוזרק הלא נצפתה (איור 6). ftp_upload / 53,738 / 53738fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: היערכות התפתחותית להזרקת dsRNA גלמי הזרקת גלמים מוקדם של תוצאות dsRNA בהישרדות והתקדמות אופטימליות לתוך לשלב בוגר.. רמות נמוכות של פיגמנטציה לציפורן (A, עזבו, ו- B) ניתן להבחין בתוך ההתגלמות הבאה 0-24 השעות הראשונות. שיזוף של הזריקה הקודמת לציפורן גלמים (A, מרכז וימין) תוצאות בינוניות עד הישרדות עניה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig2.jpg" /> איור 2:. עמדת הזרקה והפצה של שכותרתו לצבוע dsRNA (א) הזרקת מחט נימים של dsRNA שכותרתו צבע לתוך לציפורן הגב בזווית של כ -30 מעלות, ב קדמי אל אחורי כיוון. (ב) הצבע מופץ בעליל hemolymph הגלמים. נפח הזרקה dsRNA של 138 NL, שכותרתו עם 0.01% FGD (w / v). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig3.jpg" /> איור 3:. הופעתה הבוגרת לאחר ההזרקה (א) 70% של גלמים הזריקו 0.01% FGD (w / v) יצא בהצלחה (n = 60), בהשוואה ל -96.7% בקבוצת הביקורת הלא מוזרק (n = 60). שלושה ביולוגי משכפל בוצע. (ב) הופעתה חלקית ממקרה גלמי נצפתה עבור מספר רב של יתושים שאינם שורדים. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig4.jpg" /> איור 4: צמיחת שיעור, הערכת מין והישרדות מבוגרים (א) זמני הופעתה להשוואה נצפו לאחר ההזרקה גלמי עם 0.01% FGD (24 hr = 80% ו 48 שעות = 20%), לעומת גלמים שאינם מוזרק (24. hr = 83% ו -48 שעות = 17%). (B </strאונג&gt;) הופעתה זכר מבוגר הנקבה השווה כ נצפתה גלמים מוזרקים 0.01% FGD (נקבה = 48% וגבריים = 52%) וגלמים הלא מוזרק (נקבה = 52% וגבריים = 48%). (ג) ניתוח ההישרדות מגלה כי הזרקה עם 0.01% FGD אינה משפיע בוגר ששרד, הערך עד יום 10 הופעתה פוסט. תוצאות מייצגי נתונים משלושה ניסויים עצמאיים עם 0.01% FGD המוזרקים (n = 60) ולא מוזרק (n = 60) גלמים (מספר שווה של זכרים ונקבות). ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig5.jpg" /> איור 5: פנוטיפ בקרה חיובית גידולים פסאודו משקף מציאה מוצלחת-גידולים פסאודו נצפו על הבטן (א) ו- (ב) לציפורן החזי של dsSRPN2 -injected, אבל לא dsLacZ יתושים בוגרים -injected ב 8 יום לאחר ההזרקה..(ג) גדלה גבוהה (400X) הדמיה (א) של לציפורן דיסקציה של טלאי פיגמנט (ב) מגלה אשכולות של תאי melanized בקדרות. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53738/53738fig6.jpg" /> איור 6: כימות של היווצרות פסאודו הגידול וירידה רמות החלבון SRPN2 (א) זריקות בשלב גלמי לגרום להיווצרות פסאודו-גידול 93.5% מהמבוגרים dsSRPN2 (n = 21) לעומת 0% בקבוצת הביקורת dsLacZ (n = 19). . התוצאות שהתקבלו ביום 8 לאחר ההזרקה. (ב) כתם המערבי (משמאל) מראה ירידה SRPN2 רמות dsSRPN2, אבל לא dsLacZ או מבודד חלבון hemolymph הלא מוזרק (יום 5 לאחר ההזרקה). תוצאות מבוססות על שלושה ניסויים בלתי תלויים. Anti-SRPN2 21 ואנטי SRPN3 26 דילולים נוגדן השתמשו היו 1: 1,000 ו 1: 2,000, בהתאמה. עיזים אנטי-rabbit IgG-HRP (מוצר SC-2004, סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, דאלאס TX) שימש ב 1: 5,000. כל רמות החלבון היו לכמת (מימין) לפי עוצמה הלהקה (ImageJ תוכנה, NIH, Bethesda, MD), מנורמל SRPN3, ולעומת סטטיסטית על ידי מבחן t מזווג. P &lt;0.05: *, P ≥0.05: NS (לא משמעותי). ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM).

Watch this Scientific Journal Video about RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae at JoVE.com

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi טריגר משלוח לתוך<em&gt; Gambiae אנופלס</em&gt; גלמים

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

rnai-trigger-delivery-into-anopheles-gambiae-pupae

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

9.1K Views.  Boston College. RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

Video: RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetics

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

הזרקת dsRNA לתוך יתושים א נקבה aegypti

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Environment

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' lines that express the yeast transcription factor GAL4 in a tissue specific manner, with transgenic 'responder' lines carrying a candidate gene/RNA interference construct whose expression is controlled by Upstream Activation Sequences (UAS) that bind GAL4. In the ensuing progeny, the gene or silencing construct is thus expressed in a prescribed spatiotemporal manner, enabling the resultant phenotypes to be assayed and gene function inferred. The binary system enables flexibility in experimental approaches to screen phenotypes generated by transgene expression in multiple tissue-specific patterns, even if severe fitness costs are induced. We have adapted this system for Anopheles gambiae, the principal malaria vector in Africa.
In this article, we provide some of the common procedures used during GAL4-UAS analysis. We describe the An. gambiae GAL4-UAS lines already generated, as well as the cloning of new responder constructs for upregulation and RNAi knockdown. We specify a step by step guide for sexing of mosquito pupae to establish genetic crosses, that also includes screening progeny to follow inheritance of fluorescent gene markers that tag the driver and responder insertions. We also present a protocol for clearing An. gambiae embryos to study embryonic development. Finally, we introduce potential adaptions of the method to generate driver lines through CRISPR/Cas9 insertion of GAL4 downstream of target genes.

Using the GAL4-UAS System for Functional Genetics in Anopheles gambiae

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile tool for modification of gene expression in a controlled spatiotemporal manner which permits functional genetic analysis in Anopheles gambiae. The procedures described for using this system are a semi-standardized cloning strategy, sexing and screening of pupae for fluorescent protein markers and embryo fixation.

שימוש במערכת GAL4-UAS לגנטיקה תפקודית בגמביה אנופלס

The bipartite GAL4-UAS system is a versatile and powerful tool for functional genetic analysis. The essence of the system is to cross transgenic 'driver' ...

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the genome of Anopheles mosquitoes. Amongst these methods, the &#966;C31 system allows precise and stable site-directed integration of transgenes, or the substitution of integrated transgenic cassettes via recombinase-mediated cassette exchange (RMCE). This method relies on the action of the Streptomyces &#966;C31 bacteriophage integrase to catalyze recombination between two specific attachment sites designated attP (derived from the phage) and attB (derived from the host bacterium). The system uses one or two attP sites that have been integrated previously into the mosquito genome and attB site(s) in the donor template DNA. Here we illustrate how to stably modify the genome of attP-bearing Anopheles docking lines using two plasmids: an attB-tagged donor carrying the integration or exchange template and a helper plasmid encoding the &#966;C31 integrase. We report two representative results of &#966;C31-mediated site-directed modification: the single integration of a transgenic cassette in An. stephensi and RMCE in An. gambiae mosquitoes. &#966;C31-mediated genome manipulation offers the advantage of reproducible transgene expression from validated, fitness neutral genomic sites, allowing comparative qualitative and quantitative analyses of phenotypes. The site-directed nature of the integration also substantially simplifies the validation of the single insertion site and the mating scheme to obtain a stable transgenic line. These and other characteristics make the &#966;C31 system an essential component of the genetic toolkit for the transgenic manipulation of malaria mosquitoes and other insect vectors.

The protocol describes how to achieve site-directed modifications in the genome of Anopheles malaria mosquitoes using the &#966;C31 system. Modifications described include both the integration and the exchange of transgenic cassettes in the genome of attP-bearing docking lines.

אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

שיטת מיקרו-ג'ק-קציה לעוברי אנופלס גמביה

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) administration has been accomplished primarily via injection, which requires significant time and is not suitable for field applications. To overcome these limitations, here we present a more efficient method for robust activation of RNAi by oral delivery of dsRNA to adult Anopheles gambiae. Long dsRNAs were produced in Escherichia coli strain HT115 (DE3), and a concentrated suspension of heat-killed dsRNA-containing bacteria in 10% sucrose was offered on cotton balls ad-libitum to adult mosquitoes. Cotton balls were replaced every 2 days for the duration of the treatment. Use of this method to target doublesex (a gene involved in sex differentiation) or fork head (which encodes a salivary gland transcription factor) resulted in reduced target gene expression and/or protein immunofluorescence signal, as measured by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) or fluorescence confocal microscopy, respectively. Defects in salivary gland morphology were also observed. This highly flexible, user-friendly, low-cost, time-efficient method of dsRNA delivery could be broadly applicable to target genes important for insect vector physiology and beyond.

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

The oral administration of dsRNA produced by bacteria, a delivery method for RNA interference (RNAi) that is routinely used in Caenorhabditis elegans, was successfully applied here to adult mosquitoes. Our method allows for robust reverse genetics studies and transmission-blocking vector studies without the use of injection.

מתן יעיל של הפרעת RNA דרך הפה (RNAi) ליתושים אנופלס גמביה בוגרים

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

Mosquito Embryo Microinjection: A Technique to Deliver Exogenous DNA into Embryo Yolk of Anopheles Gambiae to Generate Germline Mutations

Source: Carballar-Lejaraz&#250;, R. et al, <a href="https://www.jove.com/v/62591">Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos.</a> J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we demonstrate the delivery of gene drive construct into the embryo of Anopheles gambiae mosquito through embryo microinjection technique. This procedure allows for integration of&#160; delivered DNA construct, through homologous recombination, into the germline cells to generate transformed mosquito population.

מיקרו-הזרקה של עובר יתוש: טכניקה להעברת DNA אקסוגני לחלמון עובר של אנופלס גמביה ליצירת מוטציות בקו הנבט

Source: Carballar-Lejaraz&#250;, R. et al, Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos. J. Vis. Exp. (2021).
In this video, we demonstrate the ...

RNAi טריגר משלוח לתוך

Summary

Explore More Videos

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,