Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.

1. מינים יתושים וגידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על A. G3 gambiae וא &#39; זני aegypti ליברפול IB12 (המשמשים במחקרי הנציג להלן) או זנים אחרים של עניין על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר לעיל 23,24. </li></ol> 2. dsRNA וsiRNA עיצוב והפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים עיצוב לבניית תבניות dsRNA ארוכות ספציפיות לגן של עניין. השתמש בכלי E-RNAi 25. לייצר dsRNA לפי השיטה של בחירה או כפי שתואר לעיל 19. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביקורת שלילית, לסנתז dsRNA 19 מתאים לרצף של חלבון ירוק ניאון, β-galactosidase (β-gal) (GFP), או כמה גנים אחרים לא באו לידי ביטוי ביתושים. אם כך רצוי, dsRNA 19 מנוצלים כדי ליצור את תוצאות הנציג מסוכמות להלן יכולים לשמש כביקורת חיובית. חנות dsRNA מומס במי RNase ללא ב -80 °; C עד צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, siRNA גן ספציפי עיצוב על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר לעיל 10. לטרוף את הרצף של siRNA מציאה לעצב siRNA שליטה השלילי שאינו מתאים לכל גן יתושים. לרכוש siRNAs המותאמת אישית, אשר זמינות באמצעות מספר ספקים בעלי מוניטין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כך רצוי, siRNAs 20,21 המנוצל כדי להשיג את תוצאות הנציג מסוכמות להלן יכול לשמש כביקורת חיובית. חנות siRNA מומס במי RNAse חינם ב -80 ° C עד צורך. </li></ol></li></ol> 3. הכנת Chitosan / מפריעים RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתרן גופרתי שהוכן מראש, RT 100 מ&quot;מ (100 מ&quot;מ Na 2 SO 4 בH 2 O deionized) ו -0.1 M נתרן אצטט (0.1 מ &#39;NAC 2 H 3 O 2 -0.1 M חומצה אצטית, pH 4.5 בH 2 O deionized) מאגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר chitosan (≥75%deacetylated) ב 0.1 חיץ אצטט M נתרן לעשות 0.02% (w / v) פתרון עובד ולשמור על הפתרון בRT לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר dsRNA או siRNA ב -50 μl deionized H 2 O ולהוסיף אותו למאגר נתרן גופרתי 100 מ&quot;מ לעשות פתרון 100 μl של 32 מיקרוגרם של dsRNA / siRNA לשל נתרן גופרתי 50 מ&quot;מ 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון chitosan לפתרון dsRNA / siRNA 100 μl ולאחר מכן לחמם את התערובת באמבט מים ב 55 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. הגדר את שליטה על ידי הוספה של נתרן גופרתי 50 מ&quot;מ לפתרון chitosan 100 μl 100 μl ולפי אותו הנוהל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרונות באופן מיידי למשך 30 שניות על ידי vortexing במהירות גבוהה ב RT כדי להקל על ההיווצרות של חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת על 13,000 XG במשך 10 דקות ב RT, לאחר שהזמן גלולה צריכה להיות גלויה. מעביר את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר חדש. אוויר יבש גלולה ל≈10 דקות ב RT לפני השימוש בו כדי להכין אוכל יתושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Measure הריכוז של dsRNA / siRNA בsupernatant באמצעות supernatant מהשליטה (ראה 3.5) כריק כדי לחשב את הסכום הכולל של dsRNA / siRNA שנותר בsupernatant. השתמש בהבדל בין כמויות התחלה של dsRNA / siRNA וסכומים שנותרו בsupernatants כדי לחשב את אחוז dsRNA / siRNA הממולכד בחלקיקים. יעילות טעינה זה היא בדרך כלל מעל 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך, אם יש צורך יותר חלקיקים. השתמש בחלקיקים היבשים באופן מיידי. ההשפעה של קירור של חלקיקים לפני השימוש לא נבדקה. </li></ol> 4. הכנת מזון המכיל Chitosan יתוש / מפריע RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר של פתרון agarose 2% (w / v) במים ללא יונים, להמס את agarose, ולשמור על פתרון agarose נמס באמבט 55 מעלות צלסיוס מים לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב פתיתי מזון לדגים (47% חלבון גולמי, דקות. שומן גולמי 10%, מקסימום. סיבים גולמיים 3%) ושמרים יבשים ביחס של 2: 1 (w / w). טוחנים את התערובת לחלקיקים קטנים עם מכתש ועלי (סביר דרך מס &#39;50 מסננת בדיקה סטנדרטית ארה&quot;ב). השתמש במזון הקרקע, שאמורה להיות חום בצבע, מייד או לאחסן אותו במכל אטום על 4 מעלות למשך מספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 1.5 מיליליטר, לערבב 6 מ&quot;ג מזון קרקע עם חלקיקים המיובשים מסעיף 3.7 עם קיסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של פתרון agarose ג&#39;ל 2% מראש מומס לתערובת מזון-ננו-החלקיקים; מערבב מייד וביסודיות על ידי שימוש בקצה קיסם או pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בג&#39;ל המכיל מזון וחלקיקים כדי להאכיל את זחלי היתושים באופן מיידי. לחלופין, פעם ג&#39;ל הוא התגבש לגמרי בRT, לאחסן את הג&#39;ל על 4 ° C ולהשתמש ביום שלמחרת, או ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 5. האכלת זחלי יתוש עם מזון המכיל Chitosan / מפריע RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א האכלה זחלי יתושים gambiae: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר siגלולה ngle ג&#39;ל מצינור 1.5 מיליליטר באמצעות קיסם ולחתוך אותו לפרוסות שווים 6 באמצעות סכין גילוח נקי או איסוף שן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 20 זחלי instar שלישיים לצלחת פטרי המכילה 500 מיליליטר של מים deionized 100 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את זחלי יתושים על ידי הוספת פרוסה אחת של גלולה ג&#39;ל (קצוצה דק לחתיכות קטנות יותר) לכל צלחת פטרי פעם ביום למשך ארבעה ימים. הקפדתי למלא האכלת זחלים על גלולה, שאמור להיות מופחת באופן משמעותי בגודל או נעדרת לחלוטין על ידי ביום שלמחרת. לאחר הזמן, יתושים יתפתחו זחלי instar רביעי מאוחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט כל שינוי פנוטיפי גלוי במהלך הניסוי. בדוק את רמות התמליל ושינויי פנוטיפי אחרים כאמור בסעיף 6 בתום התקופה של ארבעה ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א האכלה זחלי יתושים aegypti: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גלולה ג&#39;ל ל6 פרוסות שווים באמצעות סכין גילוח נקי או קיסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 50 שעות 24 מסונכרנות גיל לאחר fi ביצת בקיעהזחלי instar הראשונים לצלחת פטרי ב≈40 מיליליטר מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את זחלי פרוסה אחת לכל צלחת פטרי במשך 4 שעות / יום, ולאחר מכן להעביר זחלים חזרה לתזונה הרגילה זחל של 2: פתיתי מזון 1 קרקע דגים ושמרים יבשים לשארית היום. חזור על הליך יומי לאורך ארבעת instars הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את רמות התמליל ושינויי פנוטיפי אחרים כאמור בסעיף 6 בנקודות הזמן התפתחותי הרצויות. </li></ol></li></ol> 6. אישור של ג&#39;ין מציאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות תמליל יחסית על ידי qRT-PCR בא aegypti וא &#39; זחלי gambiae. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ולנתח מבחני qRT-PCR עם שלושה משכפל ביולוגי על לפחות 10 שליטה במאגר לעומת זחלים ניסיוניים כפי שתואר 11,19,20, או על פי נוהל מעבדה סטנדרטי. תוצאות נציגים כלולות להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של חלק סוג רקמה מסוים / גוף (כלומר., מוח או אנטנה), perform qRT-PCR, כמתואר ב6.1.1 לנתיחה הבאה כדי לשחזר את הרקמות של עניין (למשל, לראות Mysore et al. 21). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור למציאה על ידי הכלאה באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז antisense שכותרת digoxygenin ולחוש על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר 26 riboprobes שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הכלאה באתר לפרוטוקול Haugen et al. 27 לאישור של מציאה כפי שתואר לעיל 11,20 ודנו בסעיף תוצאות הנציג להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור למציאה ידי אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נוגדנים כנגד מוצר החלבון של הגן הממוקד זמינים, לבצע אימונוהיסטוכימיה כפי שתואר בעבר 28, המאפשר זיהוי של אנשים עם הרמות הגבוהים ביותר של מציאה לניתוח פנוטיפ 20 כפי שהודגם בrepresentative סעיף תוצאות בהמשך. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Knipling, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+insects+of+public+health+importance.">Genetic control of insects of public health importance.</a> Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female-specific+flightless+phenotype+for+mosquito+control.">Female-specific flightless phenotype for mosquito control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).</li><li>Wise de Valdez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elimination+of+dengue+vector+mosquitoes.">Genetic elimination of dengue vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).</li><li>Harris, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+suppression+of+a+field+mosquito+population+by+sustained+release+of+engineered+male+mosquitoes.">Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+dsRNA+for+RNAi+in+insects:+an+overview+and+future+directions.">Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions.</a> Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).</li><li>Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limitation+and+possible+solutions+of+RNAi-based+technology+for+insect+pest+control.">limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control.</a> Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).</li><li>Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+genes+in+Aedes+aegypti+embryos.">Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li><li>Clemons, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+gene+targeting+in+Aedes+aegypti+embryos+reveals+that+frazzled+regulates+vector+mosquito+CNS+development.">siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development.</a> PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).</li><li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin-1a+is+required+for+Aedes+aegypti+embryonic+nerve+cord+development.">Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development.</a> PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).</li><li>Nguyen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+characterization+of+salivary+gland+development+in+Aedes+aegypti.">Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti.</a> EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).</li><li>Sarro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+commissureless2+function+during+dipteran+insect+nerve+cord+development.">Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).</li><li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti:+implications+for+pest+mosquito+control.">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> J Insect Sci. 13, 69 (2013).</li><li>Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rehydration+driven+RNAi:+a+novel+approach+for+effectively+delivering+dsRNA+to+mosquito+larvae.">Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae.</a> Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li><li>Coy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+adult+Aedes+aegypti+mosquitoes+through+oral+delivery+of+double-stranded+RNA.">Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA.</a> J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/double-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+(Anopheles+gambiae).">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).</li><li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Aedes+aegypti+olfactory+system+development+through+chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+of+semaphorin-1a.">Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).</li><li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).</li><li>Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan-mediated+orally+delivered+nucleic+acids:+a+gutful+of+gene+therapy.">Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy.</a> Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).</li><li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes.">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li><li>Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+and+egg+collection+of+Aedes+aegypti.">Culturing and egg collection of Aedes aegypti.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi:+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).</li><li>Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.+In+situ+hybridization+to+whole+mount+Drosophila+embryos.">Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos.</a> A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).</li><li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).</li><li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+protein+expression+during+Aedes+aegypti+development.">Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).</li><li>Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+diel+and+circadian+gene+expression+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae.">Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+Aedes+aegypti+using+TALENs.">Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs.</a> Methods. 69 (1), 38-45 (2014).</li><li>Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+bacterially+expressed+VP28dsRNA+to+protect+Penaeus+monodon+from+white+spot+syndrome+virus.">Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus.</a> Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticle+delivered+dsRNA+toward+genetic+control+of+insect+pests).">Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests).</a> Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).</li><li>Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+with+polyvalent+siRNA-nanoparticle+conjugates.">Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).</li><li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+RNAi+in+humans+from+systemically+administered+siRNA+via+targeted+nanoparticles.">Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles.</a> Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).</li><li>Molinaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine+and+chitosan+carriers+for+the+delivery+of+RNA+interference+effectors.">Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors.</a> Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).</li><li>Singha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+in+small-interfering+RNA+delivery.">Polymers in small-interfering RNA delivery.</a> Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Chitosan / מתודולוגיה ננו-חלקיקי RNA התערבות המתוארות במסמך זה נעשתה שימוש כדי למקד ביעילות גנים במהלך התפתחות זחל בא gambiae (איורים 2, 3) וא &#39; aegypti (איורים 4, 5, 6, לוחות 1, 2). ניתן להכין חלקיקי Chitosan גם עם dsRNA הארוך או siRNA, אשר שניהם שימשו בהצלחה ביתושים כ?...

יתושי וקטור האכלת דם של genera Anopheline וAedine לשדר גורמי המחלות אחראים לכמה מהמכות הגרועות ביותר של המין האנושי. 3.4 מליארד אנשים מוערכים הם בסיכון להידבקות במלריה, שהוא אחראי למוות למעלה מחצי מ&#39;מדי שנה ברחבי העולם. תוצאות מלריה מזיהום על ידי sp Plasmodium. טפילים, אשר מועברים לאנשים דרך העקיצות של יתושים נגועים מסוג אנופלס, כוללים הווקטור העיקרי האפריקאי אנופלס gambiae <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">(http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> , 2014) 1. Aedes aegypti הוא וקטור היתושים העיקרי לוירוס דנגה, מה שגורם לקדחת דנגה, מחלה המלווה בחום ספציפי שהיא המחלה הנפוצה arboviral והמשמעותית ביותר בעולם. וירוס דנגה הוא כיום איום ל&gt; 2.5 מליארד בני אדם באזורים הטרופיים, עם inciden שנתיce של כ -50 מיליון מקרים וכתוצאה מכך ~ 24,000 מקרי מוות בשנה <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">(http://www.cdc.gov/dengue/,</a> 2014) 2. למרות ההשפעה הגלובלית ההרסנית של מחלות שמקורן יתושים על בריאות אדם, אמצעי יעיל למניעה וטיפול במחלות אלה חסרים. הדברת יתושים היא כיום השיטה הטובה ביותר למניעת מחלה. הפוטנציאל לשליטה במחלות שמקורן בפרוקים-רגליים על ידי המניפולציה הגנטית של חרקים וקטור הוכר במשך ארבעה עשורים 3. זנים מהונדסים של א &#39; aegypti שתוכנן להיות בפנוטיפ לעוף נשי ספציפי repressible עשה בתקופה האחרונה את הפוטנציאל לשימוש באסטרטגיות בקרת וקטור מהונדסים מציאות 4-6. התקדמות אלה אתגרה חוקרים לזהות מטרות גנטיות חדשניות לבקרת וקטור ואמצעים נוספים של המניפולציה תפקוד גן ביתושי וקטור. שינוי של d ביטוי גניםפיתוח uring, כפי שהיה במקרה ביתושי נקבה-לעוף 4, עשוי לקדם את ההבהרה של אסטרטגיות בקרת וקטור רומן. עם זאת, במידה רבה בשל אתגרים טכניים, הפונקציות של מעט מאוד גנים מתאפיינות בפיתוח של א &#39; gambiae, א aegypti, או מיני יתושים אחרים. מאז גילויו בג 7 elegans, התערבות RNA (RNAi), שנשמרת בבעלי חיים, צמחים, ומיקרואורגניזמים, כבר בשימוש נרחב למחקרים גנטיים פונקציונליים במגוון רחב של אורגניזמים, כולל חרקים 8,9. מסלול RNAi הוא ביוזמת דייסר, שדבק dsRNA הארוך לתוך siRNAs ארוך נוקלאוטיד 20-25 קצר המתפקדים כRNA להתערב רצף ספציפי. גני שתיקה siRNAs כי הם משלימים ברצף על ידי קידום מחזור תמליל, מחשוף, ושיבוש התרגום 9. מולקולות ארוכות dsRNA (בדרך כלל 300-600 נקודות בסיס) או siRNAs מיקוד המותאם אישית particulaרצף r ניתן להשתמש במעבדת המחקר להשתקה כל גן של עניין. על ידי ניהול כאשר מפריע מועבר RNA, חוקרים יכולים לקבוע את הזמן שבו גן השתקה יוזמת. יתרון זה הוא שימושי כפי שהוא יכול להשתמש בו כדי להתגבר על אתגרים כגון קטלני או עקרות התפתחותית, אשר יכול לעכב את הייצור ותחזוקה של זני נושאות מוטציות תורשתיות, תהליך יקר ועתירת עבודה שאינו זמין עדיין בכל מיני החרקים. למרות התואר של השתקת גנים על ידי RNAi יכול להשתנות מגן לגן, רקמה לרקמה, ובעלי חי בעלי חיים, RNAi הוא בשימוש נרחב לניתוח פונקציונלי של גנים ביתושים וחרקים אחרים 8,9. שלוש אסטרטגיות משלוח RNA להתערב כבר בשימוש ביתושים: microinjection, יישום שריה / אקטואלי, ובליעה. להיסטוריה והשוואה של השימוש בשלוש הטכניקות הללו בחרקים מפורטים, עיין באל יו et 8. Wדואר השתמש בהצלחה microinjection 10 כאמצעי לאספקת siRNAs למקד גני התפתחותיים בא עוברי aegypti, זחלים, גלמים ו11-14. עם זאת, אסטרטגית משלוח עתירת עבודה זו דורשת גם התקנת microinjection ומיומנת יד. יתר על כן, microinjection מלחיץ את האורגניזם, גורם מבלבל, במיוחד כאשר פנוטיפים התנהגותיים יוערכו. לבסוף, משלוח microinjection לא ניתן להרחיב לתחום עבור בקרת וקטור. כחלופה, שריה האורגניזם להתערב פתרון RNA הפכה גם אמצעי פופולרי של גרימת השתקת גנים, כפי שהוא נוח ודורש ציוד או עבודה קטן. שריה יש בעיקר יושמה בשורת תאי חרקים לומד 8, אך במחקר שנערך לאחרונה, מציאה הושגה בא זחלי aegypti שקועים בפתרון של 15 dsRNA, שבעלי החיים הופיעו לבליעה. עם זאת, למחקרים שכלל ניתוח של experimenta מרובהקבוצות l או פנוטיפים, שריה היא די יקרה. לופז-מרטינז et al. 16 תיארו להחזרת נוזלים מונעים RNAi, גישה חדשנית להתערבות משלוח RNA שכרוכה התייבשות בתמיסת מלח והחזרת נוזלים עם טיפה אחת של מים המכילים RNA להתערב. גישה זו אין לחתוך את העלויות כרוכות בטבילת בעלי חיים שלמה, אבל הוא יקר יותר מאשר microinjection ועשויה להיות מוגבלת בבקשתו למינים שיכולים לסבול לחצים האוסמוטי גבוהים. יתר על כן, קשה לדמיין איך טבילה או מתודולוגיה טבילה / התייבשות התייבשות יכולה להיות מותאמת לבקרת וקטור בתחום. מסיבות אלה, ללימודי פוסט-עובריים, לידה בהתערבות RNA עם אוכל לבלוע היא אסטרטגיה חלופית בת קיימא. למרות שאסטרטגיות מבוססות בליעה לא עובדות בכל מיני החרקים, אולי בעיקר melanogaster דרוזופילה, משלוח אוראלי של התערבות RNA מעורבב עם מזון קידם si הגןlencing במגוון רחב של חרקים 8,17 א כולל, מבוגרים aegypti 18. שתארנו RNAi בתיווך ננו-חלקיקי chitosan בא זחלי gambiae 19 ויישם גישה זו של הפחתה של ביטוי גנים בא בהצלחה זחלי aegypti 20,21. כאן, מתודולוגיה להליך RNAi זה, הכולל כולא בהתערבות RNA על ידי chitosan הפולימר, היא מפורטת. Chitosan / חלקיקי RNA להתערב נוצרים על ידי הרכבה עצמית של polycations עם התערבות RNA באמצעות הכוחות אלקטרוסטטיים בין מטענים החיוביים של קבוצות אמינו בchitosan ומטענים שליליים המבוצעים על ידי קבוצות פוספט בעמוד השדרה של התערבות RNA 19. ההליך המתואר תואם עם שתי מולקולות ארוכות dsRNA (להלן כפי dsRNA) או גדילים כפולים siRNA (להלן כפי siRNA). סינתזה, chitosan / חלקיקי RNA להתערב הבאים מעורבבים עם מזון זחל ונמסרו לזחלים באמצעות בליעה דרך הפה. מתודולוגיה זו היא זולה יחסית, דורשת ציוד ועבודה 19 קטנים, ומאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של פנוטיפים מרובים, כוללים ניתוח של התנהגויות 20,21. מתודולוגיה זו, אשר יכולה להיות מותאמת ללימודי השתקת גנים בחרקים אחרים, כוללים וקטורי מחלה אחרים ומזיקים בחקלאות חרקים, העלול לשמש להשתקת גנים במגוון רחב של בעלי חיים אחרים. יתר על כן, chitosan, פולימר זול, שאינו רעיל ומתכלה 22, עלול להיות מנוצל בתחום של בקרת מינים ספציפי יתושים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1429">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Name of Reagent/Equipment</td>
			<td style="width:243px;">Company</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:663px;">Comments/Descriptions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.02 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR20</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR200</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5 ml graduated tube&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>for aliquoting resuspended interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR1000</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 ml graduated tube&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>05-408-046</td>
			<td>for preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Sodium Acetate, pH 4.5</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>S0299</td>
			<td>to prepare sodium acetate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade</td>
			<td>BDH</td>
			<td>VWR BDH3092-500MLP</td>
			<td>to prepare sodium acetate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose Genetic Technology Grade</td>
			<td>MP Biomedicals LLC.</td>
			<td>800668</td>
			<td>to coat prepared interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5415D</td>
			<td>to pellet interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chitosan, from shrimp shells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3646-25G</td>
			<td>to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Yeast</td>
			<td>Universal Food Corp</td>
			<td>NA</td>
			<td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-RNAi tool</td>
			<td>German Cancer Research Center</td>
			<td>NA</td>
			<td>for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goldfish food</td>
			<td>Wardley</td>
			<td>Goldfish FLAKE FOOD</td>
			<td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Heated water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51221048</td>
			<td>to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ice</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ice bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-591-44</td>
			<td>for storage of ice used during the procedure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">liver powder</td>
			<td>MP Biomedicals LLC.</td>
			<td>900396</td>
			<td>to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microwave oven</td>
			<td>A variety of vendors</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>to prepare 2% agarose solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">petridish (100X15 mm)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>875713</td>
			<td>interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S220</td>
			<td>for preparation of buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">siRNA</td>
			<td>Thermo Scientific/Dharmacon</td>
			<td>custom</td>
			<td>for preparation of siRNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)</td>
			<td>BDH/distributed by VWR</td>
			<td>VWR BDH0302-500G</td>
			<td>to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>61066-046</td>
			<td>to measure the water bath temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tooth picks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470146-908</td>
			<td>for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ultralow freezer</td>
			<td>A variety of vendors</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex mixer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>02-216-108</td>
			<td>for preparation of chitosan/interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Weight paper</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC9798735</td>
			<td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae

יתושי וקטור לגרום יותר סבל אנושי מכל אורגניזם אחר - ולהרוג יותר ממיליון אנשים בכל שנה. פרויקטי הגנום היתוש הקלו מחקר בהיבטים חדשים של ביולוגיה יתושים, כוללים מחקרים גנטיים תפקודיים בווקטור העיקרי אפריקה המלריה אנופלס gambiae ודנגי וקדחת צהובה וקטור Aedes aegypti. השתקת interference- RNA (RNAi-) בתיווך הגן נעשתה שימוש כדי למקד את הגנים של עניין בשני מיני יתושים וקטור מחלה אלה. כאן אנו מתארים הליך להכנת chitosan / מפריעים חלקיקי RNA שמשולבים עם אוכל ומעובדים על ידי זחלים. זה תפוקה גבוהה מבחינה טכנית פשוטה, ומתודולוגיה זולה יחסית, אשר תואם עם RNA הארוך גדילים הכפול (dsRNA) או מולקולות קטנות מפריעות RNA (siRNA), היו בשימוש כבר מציאה המוצלחת של מספר גנים השונים בא gambiae וא &#39; aegyptiזחלים. בעקבות האכלות זחל, מציאה, אשר מאומת באמצעות qRT-PCR או הכלאה באתר, יכולים להימשך, לפחות עד השלב מאוחר גלמים. מתודולוגיה זו עשויה להיות ישימה למגוון רחב של יתושים ומיני חרקים אחרים, כוללים מזיקים בחקלאות, כמו גם אורגניזמים שאינם מודל אחרים. בנוסף לשירות שלה במעבדת המחקר, בעתיד, chitosan, פולימר זול, שאינו רעיל ומתכלה, עלול להיות מנוצל בתחום.

<html> א gambiae: חלקיקי Chitosan / dsRNA נוצרים כתוצאה מהאינטראקציה אלקטרוסטטית בין קבוצות אמינו של chitosan וקבוצות פוספט של dsRNA. היעילות של שילוב dsRNA לתוך חלקיקים היא בדרך כלל מעל 90%, כפי שנמדד על ידי דלדול של dsRNA מהפתרון. תמונות במיק...

Watch this Scientific Journal Video about Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae at JoVE.com

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  Kansas State University.  כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים. 

Video: Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

תא חי סידן הדמיה בשילוב עם השתקת siRNA מתווכת ג&#39;ין מזהה Ca 2 + ערוצי דליפה בקרום ER ו מנגנוני ויסות שלהם

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium בתיווך Virus-induced ג&#39;ין השתקת Assay כותנה

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and diseases, such as obesity and fatty liver. Usually, lipids are stored in lipid droplets, which are the multifunctional lipid storage organelles in cells. Lipid droplets vary in size and number in different tissues and under different conditions. It has been reported that lipid droplets are tightly controlled through regulation of its biogenesis and degradation. In Drosophila melanogaster, the oenocyte is an important tissue for lipid metabolism and has been recently identified as a human liver analogue regarding lipid mobilization in response to stress. However, the mechanisms underlying the regulation of lipid droplet metabolism in oenocytes remain elusive. To solve this problem, it is of utmost importance to develop a reliable and sensitive method to directly visualize lipid droplet dynamic changes in oenocytes during development and under stressful conditions. Taking advantage of the lipophilic BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye, described here is a detailed protocol for the dissection and subsequent lipid droplet staining in the oenocytes of Drosophila larvae in response to starvation. This allows for qualitative analysis of lipid droplet dynamics under various conditions by confocal microscopy. Furthermore, this rapid and highly reproducible method can also be used in genetic screens for indentifying novel genetic factors involving lipid droplet metabolism in oenocytes and other tissues.

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Presented here are detailed methods for the dissection and lipid droplet staining of oenocytes in Drosophila larvae using BODIPY 493/503, a lipid droplet-specific fluorescent dye.

לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...