Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.

1. מינים יתושים וגידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על A. G3 gambiae וא &#39; זני aegypti ליברפול IB12 (המשמשים במחקרי הנציג להלן) או זנים אחרים של עניין על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר לעיל 23,24. </li></ol> 2. dsRNA וsiRNA עיצוב והפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריימרים עיצוב לבניית תבניות dsRNA ארוכות ספציפיות לגן של עניין. השתמש בכלי E-RNAi 25. לייצר dsRNA לפי השיטה של בחירה או כפי שתואר לעיל 19. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לביקורת שלילית, לסנתז dsRNA 19 מתאים לרצף של חלבון ירוק ניאון, β-galactosidase (β-gal) (GFP), או כמה גנים אחרים לא באו לידי ביטוי ביתושים. אם כך רצוי, dsRNA 19 מנוצלים כדי ליצור את תוצאות הנציג מסוכמות להלן יכולים לשמש כביקורת חיובית. חנות dsRNA מומס במי RNase ללא ב -80 °; C עד צורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, siRNA גן ספציפי עיצוב על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר לעיל 10. לטרוף את הרצף של siRNA מציאה לעצב siRNA שליטה השלילי שאינו מתאים לכל גן יתושים. לרכוש siRNAs המותאמת אישית, אשר זמינות באמצעות מספר ספקים בעלי מוניטין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם כך רצוי, siRNAs 20,21 המנוצל כדי להשיג את תוצאות הנציג מסוכמות להלן יכול לשמש כביקורת חיובית. חנות siRNA מומס במי RNAse חינם ב -80 ° C עד צורך. </li></ol></li></ol> 3. הכנת Chitosan / מפריעים RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתרן גופרתי שהוכן מראש, RT 100 מ&quot;מ (100 מ&quot;מ Na 2 SO 4 בH 2 O deionized) ו -0.1 M נתרן אצטט (0.1 מ &#39;NAC 2 H 3 O 2 -0.1 M חומצה אצטית, pH 4.5 בH 2 O deionized) מאגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר chitosan (≥75%deacetylated) ב 0.1 חיץ אצטט M נתרן לעשות 0.02% (w / v) פתרון עובד ולשמור על הפתרון בRT לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר dsRNA או siRNA ב -50 μl deionized H 2 O ולהוסיף אותו למאגר נתרן גופרתי 100 מ&quot;מ לעשות פתרון 100 μl של 32 מיקרוגרם של dsRNA / siRNA לשל נתרן גופרתי 50 מ&quot;מ 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון chitosan לפתרון dsRNA / siRNA 100 μl ולאחר מכן לחמם את התערובת באמבט מים ב 55 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות. הגדר את שליטה על ידי הוספה של נתרן גופרתי 50 מ&quot;מ לפתרון chitosan 100 μl 100 μl ולפי אותו הנוהל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרונות באופן מיידי למשך 30 שניות על ידי vortexing במהירות גבוהה ב RT כדי להקל על ההיווצרות של חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את התערובת על 13,000 XG במשך 10 דקות ב RT, לאחר שהזמן גלולה צריכה להיות גלויה. מעביר את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר חדש. אוויר יבש גלולה ל≈10 דקות ב RT לפני השימוש בו כדי להכין אוכל יתושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Measure הריכוז של dsRNA / siRNA בsupernatant באמצעות supernatant מהשליטה (ראה 3.5) כריק כדי לחשב את הסכום הכולל של dsRNA / siRNA שנותר בsupernatant. השתמש בהבדל בין כמויות התחלה של dsRNA / siRNA וסכומים שנותרו בsupernatants כדי לחשב את אחוז dsRNA / siRNA הממולכד בחלקיקים. יעילות טעינה זה היא בדרך כלל מעל 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על אותו ההליך, אם יש צורך יותר חלקיקים. השתמש בחלקיקים היבשים באופן מיידי. ההשפעה של קירור של חלקיקים לפני השימוש לא נבדקה. </li></ol> 4. הכנת מזון המכיל Chitosan יתוש / מפריע RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מיליליטר של פתרון agarose 2% (w / v) במים ללא יונים, להמס את agarose, ולשמור על פתרון agarose נמס באמבט 55 מעלות צלסיוס מים לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב פתיתי מזון לדגים (47% חלבון גולמי, דקות. שומן גולמי 10%, מקסימום. סיבים גולמיים 3%) ושמרים יבשים ביחס של 2: 1 (w / w). טוחנים את התערובת לחלקיקים קטנים עם מכתש ועלי (סביר דרך מס &#39;50 מסננת בדיקה סטנדרטית ארה&quot;ב). השתמש במזון הקרקע, שאמורה להיות חום בצבע, מייד או לאחסן אותו במכל אטום על 4 מעלות למשך מספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 1.5 מיליליטר, לערבב 6 מ&quot;ג מזון קרקע עם חלקיקים המיובשים מסעיף 3.7 עם קיסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של פתרון agarose ג&#39;ל 2% מראש מומס לתערובת מזון-ננו-החלקיקים; מערבב מייד וביסודיות על ידי שימוש בקצה קיסם או pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בג&#39;ל המכיל מזון וחלקיקים כדי להאכיל את זחלי היתושים באופן מיידי. לחלופין, פעם ג&#39;ל הוא התגבש לגמרי בRT, לאחסן את הג&#39;ל על 4 ° C ולהשתמש ביום שלמחרת, או ב -80 ° C לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 5. האכלת זחלי יתוש עם מזון המכיל Chitosan / מפריע RNA חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א האכלה זחלי יתושים gambiae: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר siגלולה ngle ג&#39;ל מצינור 1.5 מיליליטר באמצעות קיסם ולחתוך אותו לפרוסות שווים 6 באמצעות סכין גילוח נקי או איסוף שן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 20 זחלי instar שלישיים לצלחת פטרי המכילה 500 מיליליטר של מים deionized 100 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את זחלי יתושים על ידי הוספת פרוסה אחת של גלולה ג&#39;ל (קצוצה דק לחתיכות קטנות יותר) לכל צלחת פטרי פעם ביום למשך ארבעה ימים. הקפדתי למלא האכלת זחלים על גלולה, שאמור להיות מופחת באופן משמעותי בגודל או נעדרת לחלוטין על ידי ביום שלמחרת. לאחר הזמן, יתושים יתפתחו זחלי instar רביעי מאוחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט כל שינוי פנוטיפי גלוי במהלך הניסוי. בדוק את רמות התמליל ושינויי פנוטיפי אחרים כאמור בסעיף 6 בתום התקופה של ארבעה ימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א האכלה זחלי יתושים aegypti: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את גלולה ג&#39;ל ל6 פרוסות שווים באמצעות סכין גילוח נקי או קיסם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 50 שעות 24 מסונכרנות גיל לאחר fi ביצת בקיעהזחלי instar הראשונים לצלחת פטרי ב≈40 מיליליטר מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להאכיל את זחלי פרוסה אחת לכל צלחת פטרי במשך 4 שעות / יום, ולאחר מכן להעביר זחלים חזרה לתזונה הרגילה זחל של 2: פתיתי מזון 1 קרקע דגים ושמרים יבשים לשארית היום. חזור על הליך יומי לאורך ארבעת instars הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את רמות התמליל ושינויי פנוטיפי אחרים כאמור בסעיף 6 בנקודות הזמן התפתחותי הרצויות. </li></ol></li></ol> 6. אישור של ג&#39;ין מציאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות תמליל יחסית על ידי qRT-PCR בא aegypti וא &#39; זחלי gambiae. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ולנתח מבחני qRT-PCR עם שלושה משכפל ביולוגי על לפחות 10 שליטה במאגר לעומת זחלים ניסיוניים כפי שתואר 11,19,20, או על פי נוהל מעבדה סטנדרטי. תוצאות נציגים כלולות להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח של חלק סוג רקמה מסוים / גוף (כלומר., מוח או אנטנה), perform qRT-PCR, כמתואר ב6.1.1 לנתיחה הבאה כדי לשחזר את הרקמות של עניין (למשל, לראות Mysore et al. 21). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור למציאה על ידי הכלאה באתר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנתז antisense שכותרת digoxygenin ולחוש על פי נוהג מעבדה סטנדרטי או כפי שתואר 26 riboprobes שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הכלאה באתר לפרוטוקול Haugen et al. 27 לאישור של מציאה כפי שתואר לעיל 11,20 ודנו בסעיף תוצאות הנציג להלן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור למציאה ידי אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נוגדנים כנגד מוצר החלבון של הגן הממוקד זמינים, לבצע אימונוהיסטוכימיה כפי שתואר בעבר 28, המאפשר זיהוי של אנשים עם הרמות הגבוהים ביותר של מציאה לניתוח פנוטיפ 20 כפי שהודגם בrepresentative סעיף תוצאות בהמשך. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Knipling, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+insects+of+public+health+importance.">Genetic control of insects of public health importance.</a> Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female-specific+flightless+phenotype+for+mosquito+control.">Female-specific flightless phenotype for mosquito control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).</li><li>Wise de Valdez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elimination+of+dengue+vector+mosquitoes.">Genetic elimination of dengue vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).</li><li>Harris, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+suppression+of+a+field+mosquito+population+by+sustained+release+of+engineered+male+mosquitoes.">Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+dsRNA+for+RNAi+in+insects:+an+overview+and+future+directions.">Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions.</a> Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).</li><li>Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limitation+and+possible+solutions+of+RNAi-based+technology+for+insect+pest+control.">limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control.</a> Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).</li><li>Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+genes+in+Aedes+aegypti+embryos.">Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li><li>Clemons, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+gene+targeting+in+Aedes+aegypti+embryos+reveals+that+frazzled+regulates+vector+mosquito+CNS+development.">siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development.</a> PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).</li><li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin-1a+is+required+for+Aedes+aegypti+embryonic+nerve+cord+development.">Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development.</a> PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).</li><li>Nguyen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+characterization+of+salivary+gland+development+in+Aedes+aegypti.">Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti.</a> EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).</li><li>Sarro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+commissureless2+function+during+dipteran+insect+nerve+cord+development.">Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).</li><li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti:+implications+for+pest+mosquito+control.">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> J Insect Sci. 13, 69 (2013).</li><li>Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rehydration+driven+RNAi:+a+novel+approach+for+effectively+delivering+dsRNA+to+mosquito+larvae.">Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae.</a> Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li><li>Coy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+adult+Aedes+aegypti+mosquitoes+through+oral+delivery+of+double-stranded+RNA.">Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA.</a> J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/double-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+(Anopheles+gambiae).">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).</li><li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Aedes+aegypti+olfactory+system+development+through+chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+of+semaphorin-1a.">Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).</li><li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).</li><li>Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan-mediated+orally+delivered+nucleic+acids:+a+gutful+of+gene+therapy.">Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy.</a> Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).</li><li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes.">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li><li>Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+and+egg+collection+of+Aedes+aegypti.">Culturing and egg collection of Aedes aegypti.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi:+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).</li><li>Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.+In+situ+hybridization+to+whole+mount+Drosophila+embryos.">Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos.</a> A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).</li><li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).</li><li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+protein+expression+during+Aedes+aegypti+development.">Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).</li><li>Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+diel+and+circadian+gene+expression+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae.">Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+Aedes+aegypti+using+TALENs.">Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs.</a> Methods. 69 (1), 38-45 (2014).</li><li>Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+bacterially+expressed+VP28dsRNA+to+protect+Penaeus+monodon+from+white+spot+syndrome+virus.">Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus.</a> Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticle+delivered+dsRNA+toward+genetic+control+of+insect+pests).">Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests).</a> Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).</li><li>Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+with+polyvalent+siRNA-nanoparticle+conjugates.">Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).</li><li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+RNAi+in+humans+from+systemically+administered+siRNA+via+targeted+nanoparticles.">Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles.</a> Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).</li><li>Molinaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine+and+chitosan+carriers+for+the+delivery+of+RNA+interference+effectors.">Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors.</a> Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).</li><li>Singha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+in+small-interfering+RNA+delivery.">Polymers in small-interfering RNA delivery.</a> Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Chitosan / מתודולוגיה ננו-חלקיקי RNA התערבות המתוארות במסמך זה נעשתה שימוש כדי למקד ביעילות גנים במהלך התפתחות זחל בא gambiae (איורים 2, 3) וא &#39; aegypti (איורים 4, 5, 6, לוחות 1, 2). ניתן להכין חלקיקי Chitosan גם עם dsRNA הארוך או siRNA, אשר שניהם שימשו בהצלחה ביתושים כפי שמעידה תוצאות הנציג המתוארות במסמך זה. סינתזה של dsRNA היא זולה יותר מאשר רכישת siRNA, אבל הוא יותר עבודה אינטנסיבית. אם chitosan / siRNA משמש, ניתן לאשר פנוטיפים עם siRNAs מרובה, המאפשרים להבטחת טובה יותר כי הפנוטיפ חשף הוא לא בשל מיקוד מחוץ לאתר. כמו כן, הייצור המסחרי של siRNAs בהמוניהם עשוי טובים יותר להקל על הרחבת chitosan / מפריע השתקת RNA למינים ספציפי שליטת יתושים לשדה. זה יהיה כמובן דורש התגברות על obstacles כגון עלות משלוח. אמנם יש לנו זכינו להצלחה טובה עם פרוטוקול זה, מתודולוגיות חייבת להיות מותאמות לכל גן. מסיבה זו, אנו ממליצים שנבדוק את siRNAs מרובה, או אולי siRNA אחד וdsRNA ארוך, בתחילתו של פרויקט חדש. ברגע שפנוטיפים מזוהים ואישרו עם לפחות שני siRNAs השונה מתאים לגן של עניין, זה עשוי להיות שימושי לשלב siRNAs אלה כדי להגדיל את חדירות פנוטיפ (איור 4). העיתוי וגם את משך הזמן של chitosan / להתערב זמן האכלת RNA יכולים להיות מותאם לכל מחקר. א gambiae לשגשג כאשר ניזונים רק עם chitosan / מפריע מזון RNA כמתואר במסמך זה. עם זאת, בניסויים שבוצענו עד לאותו מועד, א &#39; aegypti לא הסתדר היטב בלי תזונה משלימה, בעיה יש לנו להתגבר בהעברתם לתזונה של מזון רגיל לאחר 4 שעות של chitosan / מפריעה האכלת RNA. ניסוי עם chitosan / מפריעמשלוח RNA במצע מזון שונה, שעדיין לא ניסה, עשוי לעקוף את הבעיה הזו. מצאנו כי האכלות יומיות 4 שעות במהלך מספר ימים יביאו לאיזון טוב בין מציאה ותזונה הולמת, אבל שינוי של משך ההאכלה יכול להיות רדוף נוסף לפי צורך. כמו כן, instar הזחל בי chitosan / האכלת ננו-חלקיקי RNA להתערב היא יזם / המשך יכול להיות מותאם לכל ניסוי בהתאם לתקופת ההתפתחות הקריטית שבו תפקוד גן נבחן, יתרון עיקרי של פרוטוקול זה. אימות של מציאה היא כמובן קריטי, אך ייתכן גם דורשת פתרון בעיות. מסיבה זו, זה עשוי להיות שימושי כדי לבדוק בו זמנית אם פנוטיפים של ריבית המופקים כיעילות מציאה מוערכת. בניסויים אימות qRT-PCR, זה קריטי, כי פריימרים ותנאי PCR מותאמים. יתר על כן, חשוב שבעלי החיים הם מבחינה התפתחותיתמסונכרן בתחילת הניסוי, כביטוי לכמה תמלילים יכול להיות מאוד דינמי במהלך פיתוח ובשל קצב היממה 29. יתר על כן, בעוד שטכניקה זו בצורה ברורה מייצרת מציאה מעבר למעי, שרק מתחילים להעריך את הרקמות שלטכניקה זו היא יעילה, ועשויה להשתנות בין מינים. לכן זה יהיה שימושי למדידת מציאה ברקמות מסוימות, אשר יכול להיות מושגת על ידי לנתח רקמות של ריבית מבעלי החיים שלמים לqRT-PCR מבחני או באמצעות הכלאה באתר (איורים 4-6) 20,21 ואימונוהיסטוכימיה (איור 4) 20 מבחני (ראה Haugen et al. 27 וClemons et al. 28, בהתאמה, לפתרון בעיות בפרוטוקולים הללו). מאז מציאה משתנה מאדם לאדם, כדאי לבצע מבחני כפול תיוג להעריך פנוטיפים בשילוב עם רמות מציאה (Figuמחדש 4) 20, אשר מאוד מקל אפיון פנוטיפ. למחקרים התנהגותיים, רמות מציאה בבעלי חיים בודדים יכולות להיות מתואמות עם הופעות ההתנהגות שלהם (טבלה 2) 20,21. המעקב בתיווך chitosan מפריע משלוח RNA לא זחלי aegypti, ביטוי גנים מופחת מזוהה ב 24 שעות של פיתוח גלמים (איורים 4, 6) 20,21. למרות שהרמות של ביטוי גנים טרם הוערכו באופן מפורט מעבר לנקודה של התפתחות זו, רמות נמוכות של ביטוי גנים זוהו בשני א 48 ו -72 שעות גלמי aegypti (KM, לא פורסם). זה יהיה שימושי להמשיך ניתוח מפורט יותר של רמות מציאה בשלבים רבים של א &#39; פיתוח גלמי aegypti וגם להעריך א גלמי gambiae. זה יהיה גם מעניין כדי לקבוע אם מציאה נמשכת במבוגרים ולחקור ננו-חלקיקים בתיווך בterfering אסטרטגיות משלוח RNA ליתושים בוגרים. מיקוד גישות ספציפי לאתר גן nuclease הוכנסו לאחרונה לא aegypti וא &#39; gambiae ומתיר את הדור של מוטציות ממוקדות, תורשתיות ביתושים ואורגניזמים מודל שאינו גנטיים אחרים 30,31. למרות שימוש בגישות אלו מאפשרים אובדן אחיד יותר של פנוטיפ פונקצית הניתוחים, יתרון על פני גישות RNAi, בדיקות סקר לאיתור מוטציות של עניין הוא עדיין די זמן רב ועבודה אינטנסיבית. יתר על כן, למרות שאובדן RNAi של מחקרי פונקציה דורש תחזוקה של זני סוג בר בלבד, זני יתושים מוטציה חייבים להיות שגדלו בנפרד. התחזוקה של מוטציות קטלניות סטרילי או מבוגר רצסיבי היא כיום מאתגרת לנוכח החוסר הנוכחי של balancers המסומן ביתושים. וכך, בעוד ספציפי לאתר גן nuclease מיקוד גישות צובר פופולרי במהירות, chitosan / מפריע RNA מיקוד עשוי להיות אופטימליבחירה למעבדות אינן מצוידים לשמור על זני יתושים ובמקרים שבי אובדן תפקוד גנים במהלך ההתפתחות היא בקנה אחד עם הישרדות של הזן. בהתבסס על הממצאים שלנו, אנו צופים כי chitosan / RNA להתערב ניתן להשתמש באופן נרחב למציאה של גנים רבים ושונים במהלך התפתחותו של א &#39; gambiae, א aegypti, כמו גם חרקים אחרים, ואורגניזמים מודל שאינו גנטיים פוטנציאלי אחרים. השתקת גנים מוצלחת עם chitosan / RNA להתערב דווח במינים של פרוקים-רגליים אחרות, כוללים monodon Penaeus (שרימפס) 32. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי חלקיקים להקל על הספיגה של dsRNA ובכך לשפר את יעילות מציאה בהשוואה להזנה ישירה של dsRNA בcornborer אסיה 33, אשר מדגיש את הפוטנציאל לשימוש בטכנולוגיה זו כדי למקד את המזיקים בחקלאות. השימוש האפשרי של siRNA-חלקיקים כתרופות בבני האדם מושך o הרבהעניין f בקהילה הרפואית. Giljohann et al. 34 תאר את הסינתזה ואפיון של conjugates הרב הערכי RNA-זהב ננו-חלקיקים, שיש להם שישה-לקפל יותר זמן מחצית חיים בהשוואה לשחרור dsRNA וקלות להיכנס לתאים. דייויס et al. 35 תאר את המשפט הראשון האדם קליני הכולל ניהול מערכתי של siRNAs באמצעות מערכת מסירת ננו-חלקיקים לחולים עם גידולים מוצקים, ואת האפשרות של שימוש chitosan / תרופות siRNA לאחרונה נסקרה 36. לפיכך, chitosan / להתערב גן RNA טכנולוגיית מיקוד הוא טכניקת מעבדה יקרה עם פוטנציאל ליישומים רחבים יותר. מחקר עתידי לחקור יישומים נוספים לטכניקה זו. יתר על כן, שינוי כימי של chitosan ופולימרים אחרים, אזור פעיל של מחקר, עשוי להגביר את היעילות של משלוח RNA להתערב או לאפשר משלוח ממוקד לרקמות ספציפיות 37.

יתושי וקטור האכלת דם של genera Anopheline וAedine לשדר גורמי המחלות אחראים לכמה מהמכות הגרועות ביותר של המין האנושי. 3.4 מליארד אנשים מוערכים הם בסיכון להידבקות במלריה, שהוא אחראי למוות למעלה מחצי מ&#39;מדי שנה ברחבי העולם. תוצאות מלריה מזיהום על ידי sp Plasmodium. טפילים, אשר מועברים לאנשים דרך העקיצות של יתושים נגועים מסוג אנופלס, כוללים הווקטור העיקרי האפריקאי אנופלס gambiae <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">(http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> , 2014) 1. Aedes aegypti הוא וקטור היתושים העיקרי לוירוס דנגה, מה שגורם לקדחת דנגה, מחלה המלווה בחום ספציפי שהיא המחלה הנפוצה arboviral והמשמעותית ביותר בעולם. וירוס דנגה הוא כיום איום ל&gt; 2.5 מליארד בני אדם באזורים הטרופיים, עם inciden שנתיce של כ -50 מיליון מקרים וכתוצאה מכך ~ 24,000 מקרי מוות בשנה <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">(http://www.cdc.gov/dengue/,</a> 2014) 2. למרות ההשפעה הגלובלית ההרסנית של מחלות שמקורן יתושים על בריאות אדם, אמצעי יעיל למניעה וטיפול במחלות אלה חסרים. הדברת יתושים היא כיום השיטה הטובה ביותר למניעת מחלה. הפוטנציאל לשליטה במחלות שמקורן בפרוקים-רגליים על ידי המניפולציה הגנטית של חרקים וקטור הוכר במשך ארבעה עשורים 3. זנים מהונדסים של א &#39; aegypti שתוכנן להיות בפנוטיפ לעוף נשי ספציפי repressible עשה בתקופה האחרונה את הפוטנציאל לשימוש באסטרטגיות בקרת וקטור מהונדסים מציאות 4-6. התקדמות אלה אתגרה חוקרים לזהות מטרות גנטיות חדשניות לבקרת וקטור ואמצעים נוספים של המניפולציה תפקוד גן ביתושי וקטור. שינוי של d ביטוי גניםפיתוח uring, כפי שהיה במקרה ביתושי נקבה-לעוף 4, עשוי לקדם את ההבהרה של אסטרטגיות בקרת וקטור רומן. עם זאת, במידה רבה בשל אתגרים טכניים, הפונקציות של מעט מאוד גנים מתאפיינות בפיתוח של א &#39; gambiae, א aegypti, או מיני יתושים אחרים. מאז גילויו בג 7 elegans, התערבות RNA (RNAi), שנשמרת בבעלי חיים, צמחים, ומיקרואורגניזמים, כבר בשימוש נרחב למחקרים גנטיים פונקציונליים במגוון רחב של אורגניזמים, כולל חרקים 8,9. מסלול RNAi הוא ביוזמת דייסר, שדבק dsRNA הארוך לתוך siRNAs ארוך נוקלאוטיד 20-25 קצר המתפקדים כRNA להתערב רצף ספציפי. גני שתיקה siRNAs כי הם משלימים ברצף על ידי קידום מחזור תמליל, מחשוף, ושיבוש התרגום 9. מולקולות ארוכות dsRNA (בדרך כלל 300-600 נקודות בסיס) או siRNAs מיקוד המותאם אישית particulaרצף r ניתן להשתמש במעבדת המחקר להשתקה כל גן של עניין. על ידי ניהול כאשר מפריע מועבר RNA, חוקרים יכולים לקבוע את הזמן שבו גן השתקה יוזמת. יתרון זה הוא שימושי כפי שהוא יכול להשתמש בו כדי להתגבר על אתגרים כגון קטלני או עקרות התפתחותית, אשר יכול לעכב את הייצור ותחזוקה של זני נושאות מוטציות תורשתיות, תהליך יקר ועתירת עבודה שאינו זמין עדיין בכל מיני החרקים. למרות התואר של השתקת גנים על ידי RNAi יכול להשתנות מגן לגן, רקמה לרקמה, ובעלי חי בעלי חיים, RNAi הוא בשימוש נרחב לניתוח פונקציונלי של גנים ביתושים וחרקים אחרים 8,9. שלוש אסטרטגיות משלוח RNA להתערב כבר בשימוש ביתושים: microinjection, יישום שריה / אקטואלי, ובליעה. להיסטוריה והשוואה של השימוש בשלוש הטכניקות הללו בחרקים מפורטים, עיין באל יו et 8. Wדואר השתמש בהצלחה microinjection 10 כאמצעי לאספקת siRNAs למקד גני התפתחותיים בא עוברי aegypti, זחלים, גלמים ו11-14. עם זאת, אסטרטגית משלוח עתירת עבודה זו דורשת גם התקנת microinjection ומיומנת יד. יתר על כן, microinjection מלחיץ את האורגניזם, גורם מבלבל, במיוחד כאשר פנוטיפים התנהגותיים יוערכו. לבסוף, משלוח microinjection לא ניתן להרחיב לתחום עבור בקרת וקטור. כחלופה, שריה האורגניזם להתערב פתרון RNA הפכה גם אמצעי פופולרי של גרימת השתקת גנים, כפי שהוא נוח ודורש ציוד או עבודה קטן. שריה יש בעיקר יושמה בשורת תאי חרקים לומד 8, אך במחקר שנערך לאחרונה, מציאה הושגה בא זחלי aegypti שקועים בפתרון של 15 dsRNA, שבעלי החיים הופיעו לבליעה. עם זאת, למחקרים שכלל ניתוח של experimenta מרובהקבוצות l או פנוטיפים, שריה היא די יקרה. לופז-מרטינז et al. 16 תיארו להחזרת נוזלים מונעים RNAi, גישה חדשנית להתערבות משלוח RNA שכרוכה התייבשות בתמיסת מלח והחזרת נוזלים עם טיפה אחת של מים המכילים RNA להתערב. גישה זו אין לחתוך את העלויות כרוכות בטבילת בעלי חיים שלמה, אבל הוא יקר יותר מאשר microinjection ועשויה להיות מוגבלת בבקשתו למינים שיכולים לסבול לחצים האוסמוטי גבוהים. יתר על כן, קשה לדמיין איך טבילה או מתודולוגיה טבילה / התייבשות התייבשות יכולה להיות מותאמת לבקרת וקטור בתחום. מסיבות אלה, ללימודי פוסט-עובריים, לידה בהתערבות RNA עם אוכל לבלוע היא אסטרטגיה חלופית בת קיימא. למרות שאסטרטגיות מבוססות בליעה לא עובדות בכל מיני החרקים, אולי בעיקר melanogaster דרוזופילה, משלוח אוראלי של התערבות RNA מעורבב עם מזון קידם si הגןlencing במגוון רחב של חרקים 8,17 א כולל, מבוגרים aegypti 18. שתארנו RNAi בתיווך ננו-חלקיקי chitosan בא זחלי gambiae 19 ויישם גישה זו של הפחתה של ביטוי גנים בא בהצלחה זחלי aegypti 20,21. כאן, מתודולוגיה להליך RNAi זה, הכולל כולא בהתערבות RNA על ידי chitosan הפולימר, היא מפורטת. Chitosan / חלקיקי RNA להתערב נוצרים על ידי הרכבה עצמית של polycations עם התערבות RNA באמצעות הכוחות אלקטרוסטטיים בין מטענים החיוביים של קבוצות אמינו בchitosan ומטענים שליליים המבוצעים על ידי קבוצות פוספט בעמוד השדרה של התערבות RNA 19. ההליך המתואר תואם עם שתי מולקולות ארוכות dsRNA (להלן כפי dsRNA) או גדילים כפולים siRNA (להלן כפי siRNA). סינתזה, chitosan / חלקיקי RNA להתערב הבאים מעורבבים עם מזון זחל ונמסרו לזחלים באמצעות בליעה דרך הפה. מתודולוגיה זו היא זולה יחסית, דורשת ציוד ועבודה 19 קטנים, ומאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של פנוטיפים מרובים, כוללים ניתוח של התנהגויות 20,21. מתודולוגיה זו, אשר יכולה להיות מותאמת ללימודי השתקת גנים בחרקים אחרים, כוללים וקטורי מחלה אחרים ומזיקים בחקלאות חרקים, העלול לשמש להשתקת גנים במגוון רחב של בעלי חיים אחרים. יתר על כן, chitosan, פולימר זול, שאינו רעיל ומתכלה 22, עלול להיות מנוצל בתחום של בקרת מינים ספציפי יתושים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1429">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Name of Reagent/Equipment</td>
			<td style="width:243px;">Company</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:663px;">Comments/Descriptions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.02 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR20</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR200</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5 ml graduated tube&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>for aliquoting resuspended interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR1000</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 ml graduated tube&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>05-408-046</td>
			<td>for preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Sodium Acetate, pH 4.5</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>S0299</td>
			<td>to prepare sodium acetate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade</td>
			<td>BDH</td>
			<td>VWR BDH3092-500MLP</td>
			<td>to prepare sodium acetate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose Genetic Technology Grade</td>
			<td>MP Biomedicals LLC.</td>
			<td>800668</td>
			<td>to coat prepared interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5415D</td>
			<td>to pellet interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chitosan, from shrimp shells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3646-25G</td>
			<td>to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Yeast</td>
			<td>Universal Food Corp</td>
			<td>NA</td>
			<td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-RNAi tool</td>
			<td>German Cancer Research Center</td>
			<td>NA</td>
			<td>for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goldfish food</td>
			<td>Wardley</td>
			<td>Goldfish FLAKE FOOD</td>
			<td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Heated water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51221048</td>
			<td>to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ice</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ice bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-591-44</td>
			<td>for storage of ice used during the procedure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">liver powder</td>
			<td>MP Biomedicals LLC.</td>
			<td>900396</td>
			<td>to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microwave oven</td>
			<td>A variety of vendors</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>to prepare 2% agarose solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">petridish (100X15 mm)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>875713</td>
			<td>interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S220</td>
			<td>for preparation of buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">siRNA</td>
			<td>Thermo Scientific/Dharmacon</td>
			<td>custom</td>
			<td>for preparation of siRNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)</td>
			<td>BDH/distributed by VWR</td>
			<td>VWR BDH0302-500G</td>
			<td>to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>61066-046</td>
			<td>to measure the water bath temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tooth picks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470146-908</td>
			<td>for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ultralow freezer</td>
			<td>A variety of vendors</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex mixer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>02-216-108</td>
			<td>for preparation of chitosan/interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Weight paper</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC9798735</td>
			<td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae

יתושי וקטור לגרום יותר סבל אנושי מכל אורגניזם אחר - ולהרוג יותר ממיליון אנשים בכל שנה. פרויקטי הגנום היתוש הקלו מחקר בהיבטים חדשים של ביולוגיה יתושים, כוללים מחקרים גנטיים תפקודיים בווקטור העיקרי אפריקה המלריה אנופלס gambiae ודנגי וקדחת צהובה וקטור Aedes aegypti. השתקת interference- RNA (RNAi-) בתיווך הגן נעשתה שימוש כדי למקד את הגנים של עניין בשני מיני יתושים וקטור מחלה אלה. כאן אנו מתארים הליך להכנת chitosan / מפריעים חלקיקי RNA שמשולבים עם אוכל ומעובדים על ידי זחלים. זה תפוקה גבוהה מבחינה טכנית פשוטה, ומתודולוגיה זולה יחסית, אשר תואם עם RNA הארוך גדילים הכפול (dsRNA) או מולקולות קטנות מפריעות RNA (siRNA), היו בשימוש כבר מציאה המוצלחת של מספר גנים השונים בא gambiae וא &#39; aegyptiזחלים. בעקבות האכלות זחל, מציאה, אשר מאומת באמצעות qRT-PCR או הכלאה באתר, יכולים להימשך, לפחות עד השלב מאוחר גלמים. מתודולוגיה זו עשויה להיות ישימה למגוון רחב של יתושים ומיני חרקים אחרים, כוללים מזיקים בחקלאות, כמו גם אורגניזמים שאינם מודל אחרים. בנוסף לשירות שלה במעבדת המחקר, בעתיד, chitosan, פולימר זול, שאינו רעיל ומתכלה, עלול להיות מנוצל בתחום.

<html> א gambiae: חלקיקי Chitosan / dsRNA נוצרים כתוצאה מהאינטראקציה אלקטרוסטטית בין קבוצות אמינו של chitosan וקבוצות פוספט של dsRNA. היעילות של שילוב dsRNA לתוך חלקיקים היא בדרך כלל מעל 90%, כפי שנמדד על ידי דלדול של dsRNA מהפתרון. תמונות במיקרוסקופ כוח אטומית עולות כי ממוצעי גודל חלקיקי chitosan-dsRNA nm 140 בקוטר, הנע 100-200 ננומטר (איור 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig1.jpg" /> איור 1. היווצרות Nanoparticle ידי chitosan וRNA להתערב. תמונת מיקרוסקופ כוח האטומי של חלקיקי chitosan / dsRNA (א) או פתרון chitosan ללא התוספת של dsRNA (B). הגודל של התמונות היה 1.0 × 1.0 מיקרומטר מיקרומטר. בר סולם = 250 nm.&quot;Target =&quot; e.com/files/ftp_upload/52523/52523fig1large.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. האכלה של חלקיקים אלה אשר בשילוב עם אוכל זחל סטנדרטי ושולבו agarose תומכת בפיתוח זחל נורמלי. חשוב לציין, מציאה ספציפית של תמלילי AgCHS1-נגזר האאקטודרם כמו גם AgCHS2 midgut הספציפית (איור 2) היא אפשרית 19, הוכחה כי dsRNA נלקח דרך בליעה של חלקיקים יוזמת RNAi מעבר midgut. יעילות מציאה ≈40-60% נצפתה (למשל., איור 2) ולהשתנות בין תמלילים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig2.jpg" /> רמות איור 2. תמלול של synthase כיטין 2 (AgCHS2) לאחר בליעת dsRNA ב&lt;em&gt; א זחלי gambiae. רמות יחסית mRNA של AgCHS2 בזחלים תיזונה חלקיקים עם ds AgCHS2 או ds השליטה GFP. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD משלושה משכפל ביולוגי עצמאי. אותיות שונות בברים מצביעות על הבדלים משמעותיים המבוססות על בדיקות לזווג t (P = 0.003). מציאה של AgCHS1 צמצמה באופן משמעותי את תוכן כיטין הכולל של זחלי instar הרביעי והגדילה את הרגישות לחומרי ההדברה מעכב סינתזת כיטין, diflubenzuron 19, מציאה של AgCHS2 גדלה באופן משמעותי את ההשפעה של calcofluor הלבן וdithiothreitol ששבש את מטריצת peritrophic (PM) בinstar הרביעית זחלים (איור 3) וכתוצאה מכך התמותה מוגברת 17. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig3.jpg" /> <strong&gt; השפעת איור 3. של chitosan / ds AgCHS2 לבלוע חלקיקים על א חדירות gambiae מטריצת peritrophic (PM). טיפול לבן או DTT Calcofluor משבש PM של א &#39; זחלי gambiae שexuberated עוד יותר על ידי מציאה AgCHS2 דרך ההכנסה של chitosan / dsRNA חלקיקי 19. יתוש () עם ראש הממשלה ללא פגע. יתוש (B) עם ראש הממשלה שיבש, dextran הכחול דולף לתוך ceacae הקיבה. א aegypti: Chitosan / חלקיקי siRNA שמשו למקד semaphorin-1a גן הדרכת האקסון (sema1a) במהלך A. התפתחות זחל aegypti 20. מציאה של sema1a אושרה באמצעות הכלאה באתר, אשר זוהה רמות מופחתות של sema1a ב≈60% מתחת מוח הזחלessed ולא הצליח לזהות ביטוי sema1a ב≈40% מהמוח של חיה מציאה (איור 4C לעומת B; ראש החץ צהוב מצביע על אונת המחושים). מבחני qRT-PCR בוצעו על כל בעלי חיים אספו עולים כי טכניקה זו הביאה לירידה של 32 ± 10% בתמלילי sema1a בהשוואה לבעלי חיים האכילו השליטה ננו-חלקיקים (איור 4 א; P &lt;0.01 מבוסס על מבחן t מזווג, N = 5, כאשר N הוא מספר החזרות ביולוגיות). מציאה במוח נמשכה לפחות עד 24 שעות של פיתוח גלמים, כפי שמעיד על ידי אובדן של ביטוי אנטי-Sema1a נוגדן (איור 4E1 לעומת D1), ששימש לזיהוי בעלי חיים עם מציאה משמעותית במהלך פנוטיפ חוש הריח זחל וגולם ניתוחים. פגמי הזחל וגולם מחושים אונה (לכמת בטבלה 1) התגלו בזחלים וגלמי sema1a מציאה (איור 4E2, E3 לעומת <strong&gt; D2, D3). אובדן ביטוי Sema1a הביא glomeruli שהם מעוותים (איור 4E2 לעומת D2, דמיינו עם mAbnc82; שכבות של שני האותות מוצגות באיור 4D3, E3). פנוטיפים דומים היו שנוצרו עם siRNAs שתי sema1a נפרד מציאה, שסייע להבטיח שהליקויים שנצפו לא היו התוצאה של מחוץ לאתר מיקוד או על ידי siRNA. הרמות הגבוהות ביותר של מציאה נוצרו כאשר siRNAs אוחדו, אסטרטגיה שיכול לשמש כדי להגביר את יעילות מציאה (ראה Mysore et al. 20 לפרטים נוספים). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig4.jpg" /> איור 4. Chitosan / siRNA מושרה מציאה של sema1a במערכת חוש הריח מתפתחת של א &#39; aegypti. QRT-PCR () וכלאה באתר (B, C) ​​מבחני אישרו מציאה של sema1a בזחלים האכיל תערובת של sema1a מיקוד siRNA 890 וsiRNA 1,198 chitosan / חלקיקי RNA להתערב לעומת חלקיקי שליטה. אובדן ביטוי Sema1a הביא glomeruli שהם מעוותים (E1-3 לעומת D1-3). ראה טקסט לקבלת פרטים. הגב הוא בכל הלוחות. בר סולם = 25 מיקרומטר. נתון זה הופיע במקור בMysore et al 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52523/52523fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> זחלים </td><td colspan="2"></td><td> גלמים </td><td colspan="2"></td></tr><tr><td> siRNA </td><td> n </td><td> &lt;strong&gt; wildtype </td><td> פגמי AL </td><td> n </td><td> Wildtype </td><td> פגמי AL </td></tr><tr><td> בקרה </td><td> 69 </td><td> 69 (100%) </td><td> 0 (0%) </td><td> 68 </td><td> 68 (100%) </td><td> 0 (0%) </td></tr><tr><td> sema1a KD </td><td> 77 </td><td> 42 (54.5%) </td><td> 35 (44%) * </td><td> 75 </td><td> 51 (68%) </td><td> 24 (32%) * </td></tr></tbody></table> טבלת 1. כימות פגמי אונת מחושים הבאים מציאה sema1a. סיכום הידור של תוצאות שהתקבלו לשליטה siRNA לעומת sema1a מציאה (KD) siRNA 890 + siRNA בעלי החיים הניזונים ננו-חלקיקים 1,198 chitosan בסך הכל שמונה ניסויים לשכפל מבוצעים בשני הזחלים ( משמאל) וגלמים (מימין) מוצגים. סך הכלמספר האנשים שהוערכו (n) ומספרים / אחוזים של בעלי חיים בו מוצגות מורפולוגיה סוג בר לעומת פגמים (AL) באונה מחושים (פגמי נוירון קולטני ריח מיקוד, neuropil הפגומה והיווצרות glomeruli) מצוין. מציאה אומתה immunohistochemically עם אנטי Sema1a מכתים נוגדן בתת-קבוצה של בעלי חיים (15 זחלים וגלמים 10) שמוצגים פגמים החמורים ביותר (מסומן ב- *). כל בעלי החיים מציאה הוערכו באופן זה נמצאו כי רמות נמוכות של Sema1a, בעוד שרמות Sema1a בבעלי חיים הניזונים שליטה לא שינו באופן ניכר. טבלה זו הופיעה במקור בMysore et al 20. בחקירה שנייה 21, chitosan / חלקיקי siRNA שמשו למקד את גורם שעתוק הנחרץ (Sim) במהלך פיתוח של מערכת חוש הריח. מבחני qRT-PCR עם המוח במאגר גזור מכל בעלי החיים הצביעו על כך שהיה לי מוח מציאה ה- SIM בממוצע reducti 47%בתמלילי sim בהשוואה לשליטה בעלי חיים הניזונים ננו-חלקיקים (P = 0.005 מבוסס על מבחן t מזווג). מבחני דומים עם אנטנות חשפו בממוצע הפחתת 77% ברמות ה- SIM לגבי בקרה-האכילו בעלי חיים (P = 0.002 מבוססים על מבחן t מזווג). למרות כמה השתנות ברמות של מציאה בין רקמות ובעלי חיים, תעתיקי sim לא התגלו באמצעות הכלאה באתר ב≈50% מהמוח של בעלי החיים / אנטנות מציאה בעקבות טיפול באחת משני siRNAs שונה מציאה (איור 5B2, B3, C2, B1 C3 מול, C1, הטבלה 2). במבחני התנהגות שמרים שבמהלכו אנשים שנמשכים לשמרים הוענקו ציון של 1, ואילו בעלי חיים שלא משכו ניתנו ציון של 0, ממוצע ציונים לsim 430 או 718 sim חיות מציאה היו significantly נמוך מזה של בעלי חיים הניזונים שליטה בשני ניסויים לשכפל (איור 5 א &#39;; P &lt;0.001 מבוססים על מבחן t מזווג). פגומה מעקב ריח התנהגות (איור 5 א) בקורלציה עם רמות מופחתות של sim באנטנות (איור 5B2, B3 לעומת B1) ומוח (איור 5C2, C3 מול C1, נקודות צהובות מסמנות את המערכת של אונת המחושים; ראו טבלה 2 לכימות של תוצאות). פגמים מרובים זוהו באנטנות ואונות מחושים של בעלי חיים מציאה ה- SIM (ראה Mysore et al. 21 לפרטים נוספים). לדוגמא, זחלים וגלמי מציאה sim חסרי ביטוי של orco, לחייב שיתוף קולט לכל קולטנים odorant בתאי עצב קולטני ריח (איור 6). רמות תמליל orco מופחתות התגלו אצל אנשים נמאס עם sim 430 ( </em&gt; איור 6A3, B3) או sim 718 (איור 6A4, chitosan מציאה B4) (KD) / חלקיקי siRNA (השוו לבעלי חיים מסוג בר באיור 6A1, B1 ולשלוט chitosan / בעלי חיים siRNA-האכיל ננו-חלקיקים באיור 6A2, B2). הפסד של פנוטיפ ביטוי orco נצפה בזחלי L4 (איור 6A1-A4) נמשכו לפחות עד 24 שעות לאחר היווצרות גלמים (איור 6B1-B4). <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig5.jpg" /> איור 5. sim תכנית זחלי מציאה התנהגות ריח attractant פגומה. בכלאה באתר גילה רמות מופחתות של RNA sim באנטנות (B2, B3) ומוח (C2, C3) של sim 430 ו- SIM 718 בעלי חיים מציאה (השווה לשלוט הניזונים בB1, C1), שלא הגיבו לattractant השמרים odorant (). ראה טקסט לקבלת פרטים. הקצוות הפרוקסימלי של אנטנות מכוונים כלפי מעלה בB1-B3. גב מכוון כלפי מעלה בC1-C3. בר סולם = 25 מיקרומטר. נתון זה הופיע במקור בMysore et al 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52523/52523fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52523/52523fig6.jpg" /> הפסד 6. איור ביטוי orco בא הפיתוח אנטנת aegypti הבא מציאה של sim. הרמות נמוכות של תמליל orco התגלו אצל אנשים Feד עם sim 430 (A3, B3) או sim 718 (A4, B4) chitosan מציאה (KD) / חלקיקי siRNA (השוו לבעלי חיים מסוג בר בA1, B1 ולשלוט chitosan / בעלי חיים siRNA-האכיל ננו-חלקיקים בA2, B2). ראה טקסט לקבלת פרטים. בר סולם = 25 מיקרומטר. נתון זה חובר מתמונות שפורסמו בMysore et al 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52523/52523fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="4"> נמשך </td><td colspan="4"> לא נמשך </td></tr><tr><td> siRNA </td><td> n </td><td> # בעלי חיים </td><td> רגיל </strאונג&gt; </td><td> מתון </td><td> Null </td><td> # בעלי חיים </td><td> רגיל </td><td> מתון </td><td> Null </td></tr><tr><td> בקרה </td><td> 195 </td><td> 196 (100%) </td><td> 196 (100%) </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> sim 430 KD </td><td> 176 </td><td> 63 (35%) </td><td> 48 (76%) </td><td> 15 (24%) </td><td> 0 </td><td> 113 (64%) </td><td> 20 (18%) </td><td> 12 (11%) </td><td> 81 (71%) </td></tr><tr><td> sim 718 KD </td><td> 177 </td><td> 66 (37%) </td><td> 44 (66%) </td><td> 22 (34%) </td><td> 0 </td><td> 111 (63%) </td><td> 20 (18%) </td><td> 9 (8%) </td><td> 82 (74%) </td></tr></tbody></table> רמת 2. טבלהים של sim לתאם עם ביצועי זחל בassay התנהגות שמרים. סיכום הידור של תוצאות שהושגו בattractant odorant ארבעה שמרים לשכפל ניסויים מוצג. המספר הכולל של בעלי חיים (n) מציין את מספר הזחלים הבודדים שנבדקו במבחני התנהגות אלה. מספר הזחלים הבודדים (# בעלי חיים) שנמשכו (משמאל; בעלי חיים שנגעו בשמרי גלולה והוענקו ציון של 1) או לא נמשך (מימין; בעלי חיים שלא נגעו בשמרי גלולה וקיבל ציון של 0) מתחת לכל מצב (בקרה, sim 430 KD, או sim 718 chitosan KD / siRNA-האכיל ננו-חלקיקים) מוצגים, והאחוזים של בעלי חיים כולל כלולים הבאים מספרי הגלם. מציאה של sim הוערכה באמצעות הכלאה באתר במוחם של בעלי חיים ואנטנות נמשכות (משמאל) או לא נמשכת (מימין) לשמרים.מספר גלם / אחוז של אנשים עם רגיל (בדומה לwildtype רמות תמליל sim), ריק (אין תמליל sim לצפייה), או מתון (מופחת, אך לא מסוג בר) רמות sim מצוינות. אובדן sim קורלציה היטב עם חוסר המשיכה לשמרים. טבלה זו הופיעה במקור בMysore et al 21.

Watch this Scientific Journal Video about Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae at JoVE.com

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים.

Chitosan / השתקת הגנים RNA Nanoparticle המתווכת להתערב במחלת וקטור כילה נגד זחלים

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

chitosaninterfering-rna-nanoparticle-mediated-gene-silencing-disease

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  Kansas State University.  כאן אנו מתארים הליך לעיכוב תפקוד גן ביתושי וקטור מחלה באמצעות chitosan / מפריע חלקיקי RNA המעובדים על ידי זחלים. 

Video: Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virus-Induced להשתקת גנים (VIGS) ב ניקוטיאנה benthamiana עגבניות

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

הבידוד של הריבוזום פוליפפטידים המתהווה כרוכים<em&gt; במבחנה</em&gt; כדי לזהות אתרים השהה של תרגום לאורך ה-mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity and functionality of the gut community will provide insight into the effects of gut microbiota on mosquito life traits. Metagenomic RNA-Seq has become an important tool to analyze transcriptomes from various microbes present in a microbial community. Messenger RNA usually comprises only 1-3% of total RNA, while rRNA constitutes approximately 90%. It is challenging to enrich messenger RNA from a metagenomic microbial RNA sample because most prokaryotic mRNA species lack stable poly(A) tails. This prevents oligo d(T) mediated mRNA isolation. Here, we describe a protocol that employs sample derived rRNA capture probes to remove rRNA from a metagenomic total RNA sample. To begin, both mosquito and microbial small and large subunit rRNA fragments are amplified from a metagenomic community DNA sample. Then, the community specific biotinylated antisense ribosomal RNA probes are synthesized in vitro using T7 RNA polymerase. The biotinylated rRNA probes are hybridized to the total RNA. The hybrids are captured by streptavidin-coated beads and removed from the total RNA. This subtraction-based protocol efficiently removes both mosquito and microbial rRNA from the total RNA sample. The mRNA enriched sample is further processed for RNA amplification and RNA-Seq.

A ribosomal RNA (rRNA) depletion protocol was developed to enrich messenger RNA (mRNA) for RNA-seq of the mosquito gut metatranscriptome. Sample specific rRNA probes, which were used to remove rRNA via subtraction, were created from the mosquito and its gut microbes. Performance of the protocol can result in the removal of approximately 90-99% of rRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,<em&gt; אדס המפוספס</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

הקלטות פיסיולוגיות וRNA רצף של האיברים התעוררו אצל של יתוש הקדחת הצהובה<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological functions have been extensively studied. Indeed, the advent of next-generation deep sequencing and chromatin immunoprecipitation (ChIP) via specific histone modification antibodies has revolutionized our view of epigenetic regulation across the genome. Conversely, tissues typically consist of diverse cell types, and their complex mixture poses analytic challenges to investigating the epigenome in a particular cell type. To address the cell type-specific chromatin state in a genome-wide manner, we recently developed tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq), which is based on the selective purification of chromatin by tagged core histone proteins from cell types of interest, followed by ChIP-Seq. The goal of this protocol is the introduction of best practices of tChIP-Seq. This technique provides a versatile tool for tissue-specific epigenome investigation in diverse histone modifications and model organisms.

We describe a step-by-step protocol for tandem chromatin immunoprecipitation sequencing (tChIP-Seq) that enables the analysis of cell-type-specific genome-wide histone modification.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...