Name: biolistic transformation of a fluorescent tagged gene into the opportunistic fungal pathogen cryptococcus neoformans
Uploaded: 2015-03-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (פרס # 0,920,274) וניסוי הדרום קרוליינה תחנת פרויקט SC-1,700,340. נייר תרומת מס &#39;זה isTechnical 6283 של תחנת ניסיונות אוניברסיטת קלמסון. המחברים מודים לד&quot;ר לוקאש Kozubowski לעצות מועילות שלו בפיתוח של פרוטוקול זה סופי ושריל ד&quot;ר אינגרם-סמית, קייטי גלן, וגרייס Kisirkoi לקריאה הביקורתית שלהם של כתב היד.

הערה: התכנית הכוללת של פרוטוקול זה מתואר באיור 1. 1. ג neoformans הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תגובת שינוי, לגדול 2-3 O מיליליטר / תרבות N של ג neoformans במדיום YPD ב 30 ° C רועד ב 250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה O / תרבות N במשך 5 דקות ב 900 XG ב 10 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל תא גלולה ב 300 μl של דקסטרוז בינוני Peptone השמרים (YPD). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחרוזי זכוכית, בעדינות להפיץ 300 μl של ההשעיה התא שטף על אגר YPD המכיל סורביטול 1 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר צלחות לייבוש בטמפרטורת הסביבה במשך 3-4 שעות. </li></ol> 2. זהב microcarrier הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 0.25 גרם של 0.6 מיקרומטר חרוזים זהב ב 1 מיליליטר של DDH 2 O, צנטריפוגות 1 דקות ב 900 XG כדי גלולה את החרוזים, ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חרוזים הזהב ב 1 מיליליטר של 100% אתנול. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ את החרוזים ל4 צינורות, 250 μl כל אחד, ולהוסיף 750 μl של 100% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> aliquots חרוז זהב החנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 3. DNA הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דיסקי biolistic macrocarrier כתומים על ידי השריית אותם במלקחיים באמצעות אתנול 100%. דיסקי מקום לצלחת פטרי גדול המכילה Drierite לייבוש (לוודא Drierite לא נוגע בדיסקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יבש, לחץ על דיסקי macrocarrier למחזיקי דיסק כסף (ניגבו את העבר עם 100% אתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים זהב וורטקס (מוכנים כמו בשלב 2) וμl 12 aliquot לתוך 1.5 מיליליטר צינור microcentrifuge, צינור אחד לכל שינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לכל צינור כדי: 2 מיקרוגרם של ה- DNA (רצוי 2 μl של 1 מיקרוגרם / μl של DNA), 10 μl 2.5 M CaCl 2, ובסיס חופשי 2 μl M 1 spermidine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת בקרה שלילית כמו בשלב 3.4 אך ללא DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת צינור כל דגירה בטמפרטורת הסביבה ל5 דקות. בעדינות קפיצית כל צינור מדי פעם כדי resuspend חרוזים התיישבו במהלך דגירה זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות ספין ב 225 XG למשך 30 שניות עד גלולה חרוזים הזהב מצופה DNA. מוציא בזהירות את supernatant (על ידי pipetting או שאיפה) וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend לחלוטין ב600 μl של 100% אתנול על ידי pipetting לאט מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין צינורות ב 225 XG למשך 30 שניות עד גלולה חרוזים ללא אריזה. מוציא בזהירות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חרוזים הזהב מצופה DNA ב 8 μl של 100% אתנול על ידי pipetting לאט מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה חרוזים זהב מצופה DNA על מרכז דיסק biolistic בקוטר 1 סנטימטר ולאפשר לו להתייבש. הערה: מעגל זהב מיובש גלוי על מרכז דיסק biolistic מצביע על כך שריכוז מספק של חרוזים זהב הוא הווה. הערה: דיסקי macrocarrier עמוסים חרוזים זהב מצופה DNA מוכן לשימוש עם אקדח הגן עכשיו. </li></ol> 4. Operating Gun ג&#39;ין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את משאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את גז הליום על ידי סיבוב הידית נגד כיוון השעון עד שלחץ של כ -2,200 psi הוא הגיע במד הלחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אקדח הגן על ידי מדליק את אדומה בצד השמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד שהספיקה לוואקום והאוורור מותאמות כך הוואקום יגיע 28 אינץ &#39;כספית בתוך 15 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד המרחק בין דיסק הקרע וmacrocarrier הוא כ 3/8 אינץ &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את כל החדר על ידי ניגוב עם אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את דיסקי הקרע באתנול 100%. לאפשר לו להתייבש על משטח סטרילי (למשל, פטרי צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במפתח מומנט כדי לשחרר את בעל דיסק קרע. הכנס דיסק קרע נקי לבעל. לדפוק את בעל דיסק קרע בחזרה למקומו והדק עם מפתח מומנט על ידי הפיכתו פעם לימין. הערה: תקליטורי קרע יוחלפו הבא כל לירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול המסכי רשת דואר באתנול 100%. לאפשר לו להתייבש על משטח סטרילי (למשל, פטרי צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יבש, למקם את מסך רשת שטף על צלחת הרכבת פלסטיק הלבנה. הנח את צד DNA בעל דיסק macrocarrier לתוך תא הדיסק. לדפוק על מכסה הכסף, ומניח את צלחת ההרכבה בחריץ הגבוה ביותר. הערה: מסך הרשת יוחלף לאחר כל לירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת אגר YPD המכילה 1 M סורביטול על הצלחת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה תא דלת ומנעול למקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדחוף והחזק את המתג האדום באמצע עד לעסוק ואקום ולאפשר הוואקום כדי להגיע 28 אינץ &#39;Hg. ברגע שהוא הגיעה לרמה ואקום הנכונה, להעביר בורר זה למצב למטה. כאשר מוכן, החזק את המתג האדום על הזכות לפטר. כאשר דיסק קרע אבא, שחרר מייד את לחצן האש ולחץ על המתג האדום באמצע למצב האמצע לפרוק התא ל0 psi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות את דיסק קרע הפסולת ולכבות את אקדח הגן. לאחר מכן לכבות את heliuגז מ &#39;על ידי סיבוב הכפתור בכיוון השעון, ולבסוף, לכבות את משאבת הוואקום. </li></ol> 5. תאי ציפוי שינו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר צלחות השינוי לשבת על RT במשך 4 שעות כדי לאפשר לתאים להתאושש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 700 μl פיפטה של ​​YPD לצלחת. השתמש מגרד תא לגרד בעדינות את התאים מהנוזל אגר ופיפטה לתוך צינור microfuge סטרילי 1.5 מיליליטר. חזור על שלב זה כדי להבטיח את כל התאים כבר התאוששו מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים ב 225 XG למשך 30 שניות. להסיר ולסלק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 500 μl של YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה של ​​ההשעיה התא 100 μl על המרכז + צלחות האנטיביוטיקה YPD ולהפיץ באמצעות חרוזים זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר צלחות הפוכות ב RT במשך 3-4 ימים. כמושבות מופיעות, תיקון על YPD החדש + צלחות אנטיביוטיות. </li></ol> 6. בידוד הדנ&quot;א הגנומי לPCR הערה: זו גרסה שונה באמצעות מגיבים מערכת טיהור DNA (ראה טבלה של חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבות 5 מיליליטר של כל אחד מג transformants neoformans בנוזל YPD ב 30 ° C רועד ב 250 סל&quot;ד O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה 3 מיליליטר של תאים ב 900 XG, וגלול ב600 μl של פתרון תמוגה גרעינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את ההשעיה לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש עם 200 μl של חומצת 0.5 מ&quot;מ שטף חרוזי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize במשך 45 שניות בbeadbeater מיני בטמפרטורת הסביבה, צינור מגניב על קרח, ולחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר מדגם להתיישב על קרח למשך 2 דקות ולהעביר supernatant לצינור 1.5 מיליליטר חדש. הוסף 200 μl של פתרון ממטרים חלבון לכל צינור, (100 μl לכל 600 μl של supernatant התאושש) ומערבולת במרץ במשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר דגימות להתיישב על קרח למשך 5 דקות, וצנטריפוגות ב 11,000 XG במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לצינור 1.5 מיליליטר נקי המכיל 300 μl של isopropanol RT. לערבב בעדינות על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">צנטריפוגה דגימות 11,000 XG למשך 2 דקות, להסיר בזהירות את supernatant, ולנקז את הצינורות על מגבות נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 300 μl של RT אתנול 70% לכל צינור, בעדינות להפוך ללשטוף את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות 11,000 XG למשך 2 דקות, ובזהירות להסיר את כל אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את הצינור על מגבות נייר נקיות, ולאפשר לגלולה לייבוש באוויר במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון להחזרת נוזלי DNA ו -1.5 μl של פתרון RNase לכל גלולה ומערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות במשך 5 שניות כדי להסיר את כל הנוזל מהכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננות DNA על ידי דוגרים הדגימות ב 65 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת DNA spectrophotometrically על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר (קריאת 260 של 1.0 היא שווה ערך ל~ 50 מיקרוגרם / DNA פעמיים תקועים מיליליטר), ולהשתמש עד 200 ng בכל תגובת PCR. </li></ol> בידוד RNA 7. להפוך transcriptase-PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ערכת טיהור RNA (ראה טבלה של חומרים), בצע את הוראות היצרן כדי לבודד RNA מתאי שמרים באמצעות minibeadbeater. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הריכוז של RNA על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר (קריאה 260 של 1.0 היא שווה ערך ל~ 40 מיקרוגרם / מיליליטר RNA חד-גדילים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בערכת RT-PCR (ראה טבלה של חומרים), בצע את הוראות היצרן כדי להגדיר את תגובות RT-PCR עם כ 1 מיקרוגרם של RNA. לתוצאות שהתקבלו במחקר זה, השתמש בצבעי היסוד המפורטים בטבלה 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Price, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcusneoformans+requires+a+functional+glycolytic+pathway+for+disease+but+not+persistence+in+the+host.">Cryptococcusneoformans requires a functional glycolytic pathway for disease but not persistence in the host.</a> MBio. 2, e00103-e00111 (2011).</li><li>Bubb, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heteronuclear+NMR+studies+of+metabolites+produced+by+Cryptococcusneoformans+in+culture+media:+identification+of+possible+virulence+factors.">Heteronuclear NMR studies of metabolites produced by Cryptococcusneoformans in culture media: identification of possible virulence factors.</a> Magn Reson Med. 42, 442-453 (1999).</li><li>Himmelreich, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+metabolites+of+importance+in+the+pathogenesis+of+pulmonary+cryptococcoma+using+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy.">Identification of metabolites of importance in the pathogenesis of pulmonary cryptococcoma using nuclear magnetic resonance spectroscopy.</a> Microbes Infect. 5, 285-290 (2003).</li><li>Wright, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+released+by+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+and+var.+gattii+differentially+affect+human+neutrophil+function.">Metabolites released by Cryptococcusneoformans var. neoformans and var. gattii differentially affect human neutrophil function.</a> Microbes Infect. 4, 1427-1438 (2002).</li><li>Hu, G., Cheng, P. Y., Sham, A., Perfect, J. R., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+adaptation+in+Cryptococcusneoformans+during+early+murine+pulmonary+infection.">Metabolic adaptation in Cryptococcusneoformans during early murine pulmonary infection.</a> Mol Microbiol. 69, 1456-1475 (2008).</li><li>Ingram-Smith, C., Martin, S. R., Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetate+kinase:+not+just+a+bacterial+enzyme.">Acetate kinase: not just a bacterial enzyme.</a> Trends Microbiol. 14, 249-253 (2006).</li><li>Davidson, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+by+biolistic+transformation+in+serotype+D+strains+of+Cryptococcus+neoformans.">Gene disruption by biolistic transformation in serotype D strains of Cryptococcus neoformans.</a> Fungal Genet Biol: FG &amp; B. 29, 38-48 (2000).</li><li>Toffaletti, D. L., Rude, T. H., Johnston, S. A., Durack, D. T., Perfect, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+in+Cryptococcusneoformans+by+use+of+biolistic+delivery+of+DNA.">Gene transfer in Cryptococcusneoformans by use of biolistic delivery of DNA.</a> J. Bacteriol. 175, 1405-1411 (1993).</li><li>Edman, J. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+the+URA5+gene+from+Cryptococcusneoformans+var.+neoformans+and+its+use+as+a+selective+marker+for+transformation.">Isolation of the URA5 gene from Cryptococcusneoformans var. neoformans and its use as a selective marker for transformation.</a> Mol Cell Biol. 10, 4538-4544 (1990).</li><li>Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementation+of+a+capsule-deficient+mutation+of+Cryptococcus+neoformans+restores+its+virulence.">Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence.</a> Mol Cell Biol. 14, 4912-4919 (1994).</li><li>Del Poeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+I+is+essential+in+Cryptococcusneoformans:+role+In+pathobiology+and+as+an+antifungal+target.">Topoisomerase I is essential in Cryptococcusneoformans: role In pathobiology and as an antifungal target.</a> Genetics. 152, 167-178 (1999).</li><li>McClelland, C. M., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+transformation+of+Cryptococcusneoformans+and+Cryptococcusgattii+by+Agrobacteriumtumefaciens.">High frequency transformation of Cryptococcusneoformans and Cryptococcusgattii by Agrobacteriumtumefaciens.</a> Fungal Genet Biol:FG &amp; B. 42, 904-913 (2005).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+'DiOlistic'+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor 'DiOlistic' labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Nicola, A. M., Frases, S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+dye+staining+of+Cryptococcusneoformans+extracellular+vesicles+and+capsule.">Lipophilic dye staining of Cryptococcusneoformans extracellular vesicles and capsule.</a> Eukaryot Cell. 8, 1373-1380 (2009).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Utilizing this protocol, biolistic transformation can be accomplished in which linear DNA is integrated into a desired locus in the Cryptococcus neoformans genome by homologous recombination. Certain steps in the protocol can have a dramatic effect on the effectiveness/efficiency of the transformation. For a successful transformation, it is imperative that the DNA utilized in the shoot has a concentration of at least 1 &#181;g. However, the volume of DNA added to the gold beads can be increased in the chance the...

Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide 1. Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection 2,3,4, and genes encoding enzymes from three putative acetate-producing pathways have been shown to be upregulated during infection 5. This suggests that acetate production and transport may be a necessary and required part of the pathogenic process; however, the significance of this is not yet understood. One possible pathway for acetate production is the xylulose 5-phosphate/fructose 6-phosphate phosphoketolase (Xfp) - acetate kinase (Ack), a pathway previously thought to be present only in bacteria but recently identified in both euascomycete as well as basidiomycete fungi, including&#160;C. neoformans&#160;6.
To determine the localization of these enzymes of this pathway in the cell, a construct carrying a neomycin resistance gene downstream of an ACK gene fusion to the fluorescent tag mCherry (ACK:mCherry:Neo) will be introduced into C. neoformans using the well-established method of biolistic transformation 7,8. Although electroporation is an efficient method for transformation of plasmids that will be maintained as episomes into Cryptococcus 9, it is not useful in creating stable homologous transformants 8. Only&#160;biolistic&#160;delivery using a gene gun&#160;provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNAs&#160;that will be integrated into the genome by homologous recombination. For example, Edman et al. showed that of the transformants resulting from electroporation of a plasmid-borne URA5 selectable marker into C. neoformansura5 mutants, just 0.001 to 0.1% of transformants were stable 9. Chang et al. achieved just a 0.25% stable transformation efficiency using electroporation to reconstitute capsule production in an acapsular mutant 10. Unlike electroporation, biolistic transformation has been shown to result in stable transformation efficiency of 2-50% depending on the gene that is being altered 7,8,11. 
This visual experiment will provide a step-by-step demonstration of biolistic transformation of the linear ACK:mCherry:Neo DNA construct into C. neoformans, and will describe how to confirm its proper integration via homologous recombination into the&#160;ack&#160;locus. The protocol demonstrated here is a modification of the method developed in the Perfect laboratory 8.

<table><tbody><tr><td>0.6 &amp;mu;m gold beads</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2262</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Spermadine-free base</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S0266</td><td>https://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>G418 - Sulfate (Neomycin)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>G-418-10</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>H-270-1</td><td>www.goldbio.com</td></tr><tr><td>1350 psi Rupture Discs</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Stopping Screens</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Macrocarriers discs</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>YPD Broth</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Co.</td><td>242820</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Co.</td><td>214530</td><td>www.bd.com</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP439</td><td>http://www.fishersci.com</td></tr><tr><td>PDS-1000/He System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td>http://www.bio-rad.com</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axio</td><td>http://www.zeiss.com/microscopy</td></tr><tr><td>KOD One Step PCR Kit</td><td>EMD Millipore</td><td>71086-4</td><td>http://www.emdmillipore.com</td></tr><tr><td>One Step RT-PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>210212</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>www.promega.com</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>www.qiagen.com</td></tr><tr><td>Mini Beadbeater - 1</td><td>BioSpecs</td><td>3110BX</td><td>http://www.biospec.com</td></tr><tr><td>Microfuge 18 Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>F241.5P</td><td>www.beckmancoulter.com</td></tr><tr><td>Microplate Spectrophotometer</td><td>BioTek</td><td>EPOCH</td><td>www.biotek.com</td></tr></tbody></table>

biolistic transformation of a fluorescent tagged gene into the opportunistic fungal pathogen cryptococcus neoformans

Basidiomycete neoformans קריפטוקוקוס, הפתוגן האופורטוניסטי פולשנית של מערכת העצבים המרכזית, הוא הסיבה השכיחה ביותר לדלקת קרום המוח פטרייתי בעולם וכתוצאה מכך יותר מ 625,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. למרות electroporation פותח להפיכתו של פלסמידים בקריפטוקוקוס, רק משלוח biolistic מספק אמצעי יעיל כדי להפוך את ה- DNA ליניארי שניתן לשלב לתוך הגנום ידי רקומבינציה ההומולוגית. אצטט הוכח להיות מוצר תסיסה גדול בזיהום cryptococcal, אבל המשמעות של זה עדיין לא ידוע. מסלול חיידקים המורכב מהאנזימים xylulose-5-פוספט / פרוקטוז-6-פוספט phosphoketolase (XFP) וקינאז אצטט (Ack) הוא אחד משלושה מסלולים אפשריים לייצור אצטט בג neoformans. הנה, אנחנו מדגימים את שינוי biolistic של מבנה,שגן קידוד Ack שהתמזג לתג פלורסנט mCherry, לג neoformans. לאחר מכן, אנו מאשרים שילוב של היתוך ACK -mCherry למוקד ACK.

שינוי biolistic מוצלח של ג ניתן להשיג neoformans על ידי ביצוע תכנית זו פרוטוקול (איור 1). עם שינוי biolistic, לירות מוצלחת של חרוזים זהב מצופים מצויינים על ידי טבעת זהב גלויה על הצלחת לאחר DNA היא ירייה (איור 2 א). מושבות אמורות להופיע בתוך 4-5 ימים שבם השאירו ב...

Watch this Scientific Journal Video about Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

שינוי Biolistic הוא שיטה המשמשת ליצירת אינטגרציה יציבה של DNA לתוך הגנום של neoformans הפתוגן קריפטוקוקוס האופורטוניסטי באמצעות רקומבינציה ההומולוגית. נדגים שינוי biolistic של מבנה, שבו יש קינאז אצטט גן המקודד התמזג mCherry תג הניאון לneoformans ג.

שינוי Biolistic של פלורסנט Tagged Gene לOpportunistic פטרייתיים פתוגן<em&gt; Neoformans קריפטוקוקוס</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

biolistic-transformation-fluorescent-tagged-gene-into-opportunistic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

9.9K Views.  Clemson University.  שינוי Biolistic הוא שיטה המשמשת ליצירת אינטגרציה יציבה של DNA לתוך הגנום של neoformans הפתוגן קריפטוקוקוס האופורטוניסטי באמצעות רקומבינציה ההומולוגית. נדגים שינוי biolistic של מבנה, שבו יש קינאז אצטט גן המקודד התמזג mCherry תג הניאון לneoformans ג.

Video: Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. Thus, molecular and genetic tools are needed to facilitate the study of their pathogenesis mechanisms. PCR-mediated gene modification is a straightforward and quick approach to generate epitope-tagged proteins to facilitate their detection. In particular, fluorescent protein (FP) fusions are powerful tools that allow visualization and quantitation of both yeast cells and proteins by fluorescence microscopy and immunoblotting, respectively. Plasmids containing FP encoding sequences, along with nutritional marker genes that facilitate the transformation of Candida species, have been generated for the purpose of FP construction and expression in Candida. Herein, we present a strategy for constructing a FP fusion in a Candida species. Plasmids containing the nourseothricin resistance transformation marker gene (NAT1) along with sequences for either green, yellow, or cherry FPs (GFP, YFP, mCherry) are used along with primers that include gene-specific sequences in a polymerase chain reaction (PCR) to generate a FP cassette. This gene-specific cassette has the ability to integrate into the 3'-end of the corresponding gene locus via homologous recombination. Successful in-frame fusion of the FP sequence into the gene locus of interest is verified genetically, followed by analysis of fusion protein expression by microscopy and/or immuno-detection methods. In addition, for the case of highly expressed proteins, successful fusions can be screened for primarily by fluorescence imaging techniques.

Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species

PCR-mediated gene modification can be used to generate fluorescent protein fusions in Candida species, which facilitates visualization and quantitation of yeast cells and proteins. Herein, we present a strategy for constructing a fluorescent protein fusion (Eno1-FP) in Candida parapsilosis.

הדור של Fusions חלבון פלורסנט<em&gt; קנדידה</em&gt; מינים

Candida species, prevalent colonizers of the intestinal and genitourinary tracts, are the cause of the majority of invasive fungal infections in humans. ...

Genetics

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Developmental Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

שינוי גנטי של Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Biology

שילוב גנים יציב בכלורלה וולגריס באמצעות Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Engineering of Green Microalgae, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit the capacity for gene transfer to a diverse array of species. Numerous microalgae species lack well-established methods for reliably integrating genes of interest into their nuclear genome. To harness the potential benefits of microalgal biotechnology, simple and efficient genome manipulation tools are crucial. Herein, an optimized AMT protocol is presented for the industrial microalgae species Chlorella vulgaris, utilizing the reporter green fluorescent protein (mGFP5) and the antibiotic resistance marker for Hygromycin B. Mutants are selected through plating on Tris-Acetate-Phosphate (TAP) media containing Hygromycin B and cefotaxime. Expression of mGFP5 is quantified via fluorescence after over ten generations of subculturing, indicating the stable transformation of the T-DNA cassette. This protocol allows for the reliable generation of multiple transgenic C. vulgaris colonies in under two weeks, employing the commercially available pCAMBIA1302 plant expression vector.

Author Spotlight: פרוטוקול טרנספורמציה ממוטב עבור Chlorella vulgaris באמצעות Agrobacterium tumefaciens 

This protocol outlines the utilization of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) for integrating gene(s) of interest into the nuclear genome of the green microalgae Chlorella vulgaris, leading to the production of stable transformants.

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (AMT) serves as a widely employed tool for manipulating plant genomes. However, A. tumefaciens exhibit ...

Bioengineering

Effect of Fluorescent Proteins on Fusion Partners Using Polyglutamine Toxicity Assays in Yeast

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a fluorescent reporter. The constantly evolving list of genetically encoded fluorescent proteins (FPs) presents users with several alternatives when it comes to fluorescent fusion design. Each FP has specific optical and biophysical properties that can affect the biochemical, cellular, and functional properties of the resulting fluorescent fusions. For instance, several FPs tend to form nonspecific oligomers that are susceptible to impede on the function of the fusion partner. Unfortunately, only a few methods exist to test the impact of FPs on the behavior of the fluorescent reporter. Here, we describe a simple method that enables the rapid assessment of the impact of FPs using polyglutamine (polyQ) toxicity assays in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-expanded huntingtin proteins are associated with the onset of Huntington&#39;s disease (HD), where the expanded huntingtin aggregates into toxic oligomers and inclusion bodies. The aggregation and toxicity of polyQ expansions in yeast are highly dependent on the sequences flanking the polyQ region, including the presence of fluorescent tags, thus providing an ideal experimental platform to study the impact of FPs on the behavior of their fusion partner.

This article describes protocols to assess the effect of fluorescent proteins on the aggregation and toxicity of misfolded polyglutamine expansion for the rapid evaluation of a newly uncharacterized fluorescent protein in the context of fluorescent reporters.

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

For the investigation of protein localization and trafficking using live cell imaging, researchers often rely on fusing their protein of interest to a ...

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over the past two decades, we have developed a yeast membrane protein expression platform that has been used to study many important fungal membrane proteins. The expression host Saccharomyces cerevisiae AD&#916;&#916; is deleted in seven major endogenous ABC transporters and it contains the transcription factor Pdr1-3 with a gain-of-function mutation that enables the constitutive overexpression of heterologous membrane protein genes stably integrated as single copies at the genomic PDR5 locus. The creation of versatile plasmid vectors and the optimization of one-step cloning strategies enables the rapid and accurate cloning, mutagenesis, and expression of heterologous ABC transporters. Here, we describe the development and use of a novel protease-cleavable mGFPHis double tag (i.e., the monomeric yeast enhanced green fluorescent protein yEGFP3 fused to a six-histidine affinity purification tag) that was designed to avoid possible interference of the tag with the protein of interest and to increase the binding efficiency of the His tag to nickel-affinity resins. The fusion of mGFPHis to the membrane protein ORF (open reading frame) enables easy quantification of the protein by inspection of polyacrylamide gels and detection of degradation products retaining the mGFPHis tag. We demonstrate how this feature facilitates detergent screening for membrane protein solubilization. A protocol for the efficient, fast, and reliable isolation of the small-scale plasma membrane preparations of the C-terminally tagged Candida albicans multidrug efflux transporter Cdr1 overexpressed in S. cerevisiae AD&#916;&#916;, is presented. This small-scale plasma membrane isolation protocol generates high-quality plasma membranes within a single working day. The plasma membrane preparations can be used to determine the enzyme activities of Cdr1 and Cdr1 mutant variants.

Small-Scale Plasma Membrane Preparation for the Analysis of Candida albicans Cdr1-mGFPHis

This article presents a small-scale plasma membrane isolation protocol for the characterization of Candida albicans ABC (ATP-binding cassette) protein Cdr1, overexpressed in Saccharomyces cerevisiae. A protease-cleavable C-terminal mGFPHis double tag with a 16-residue linker between Cdr1 and the tag was designed to facilitate the purification and detergent-screening of Cdr1.

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

The successful biochemical and biophysical characterization of ABC transporters depends heavily on the choice of the heterologous expression system. Over ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is a newly isolated filamentous cyanobacterium. This paper describes how new filamentous cyanobacteria can be isolated from marine rockpools. It also describes how DNA can be extracted from filaments and how the genomes can be sequenced. Although transformation is established for many single-celled species, it is less frequently reported for filamentous cyanobacteria. A simplified method for the natural transformation of P. lacuna is described here. P. lacuna is the only member of the order Oscillatoriales for which natural transformation is established. This paper also shows how natural transformation is used to express superfolder green fluorescent protein (sfGFP). An endogenous cpcB promoter induced approximately 5 times stronger expression than cpc560, A2813, or psbA2 promoters from Synechocystis sp. PCC6803. Further, a method for the cryopreservation of P. lacuna and Synechocystis sp. CPP 6803 was established, and methods for assessing motility in a liquid medium and on agar and plastic surfaces are described.

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna is a filamentous cyanobacterium that was isolated from marine rockpools. This article describes the isolation of filaments from natural sources, DNA extraction, genome sequencing, natural transformation, expression of sfGFP, cryoconservation, and motility methods.

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

שינוי Biolistic של פלורסנט Tagged Gene לOpportunistic פטרייתיים פתוגן

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הדור של Fusions חלבון פלורסנט

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

שינוי גנטי של Picoeukaryote

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

Agrobacterium tumefaciens-מתווך גנטי של מיקרו-אצות ירוקות, Chlorella vulgaris

ההשפעה של חלבונים פלורסנט על שותפים היתוך באמצעות מבחני רעילות Polyglutamine שמרים

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה