SynthSys המרכז לביולוגיה אינטגרטיבית מערכות במימון BBSRC ואת הפרס EPSRC D019621. האיחוד האירופי FP6 רשת מענק מצוינות &quot;Genomics ימית&quot; כדי FYB מימנה פיתוח שיטות שינוי גנטי.

1. הכנת חומר אצות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים בתרבית Ostreococcus הם מי ים מלאכותיים (ASW). מלחי ים (בדרך כלל כ -40 גרם לליטר) הם מומסים במים deionised למליחות של 30 ppt, כפי שנמדד באמצעות מד מליחות. אמצעי העשרה 11,12, יסודות קורט מתכות וויטמינים נוספים, כמתואר בטבלה 1-3. התקשורת היא אז פילטר עיקור באמצעות כמה 0.22 מיקרומטר הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך תחזוקה, תאים של מתח Ostreococcus OTTH95 הם תת תרבות בסביבה נקייה מחיידקים, בדילול של 1/100 ב ASW טרי כל 7 ימים ו גדל תחת אור קבוע גידול צמחים בחממה מצויד אור הירח הכחול הסינון. עוצמת האור צריך להיות קרוב ל 20 μmol m -2 s -1 והטמפרטורה נשמרת על 20 ° C. התאים אינם דורשים תסיסה מתמדת, אבל הם מזועזעים אחת ל -2 עד 3 ימים כדי למנוע צבירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשינוי זה, 50 מ&quot;ל של תאים נדרשים על התא דהnsity של 20-30 x 10 6 מ&quot;ל -1, שאמור להיות מושג לאחר 5-7 ימים culturing המשנה. צפיפות התאים axeny משוער ניתן לקבוע באמצעות אחת cytometry זרימה או haemocytometer לפחות הגדלה של X40. </li></ol> 2. Electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA לשינוי. לשינוי זה, 5 מיקרוגרם של ה-DNA, טהור פלסמיד linearised נדרש בריכוז של 1 מיקרוגרם / μl במים deionised סטרילית. כדי להשיג את ה-DNA, החוקרים ממליצים להשתמש midi Qiagen ערכת הכנה, אם כי שיטות אחרות יכול לעבוד באותה מידה. לעכל את המוצר עם האנזים החותך ב עמוד השדרה של וקטור פעם, אבל לא transgene או הגן הבחירה. יתר על כן לטהר ולרכז את ה-DNA ליניארי שהתקבל על ידי משקעים אתנול, ו resuspend המוצר בהיקף המתאים מים באיכות גבוהה deionised סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צינורות microcentrifuge המכילים DNA 5 מיקרוגרם לשינוי זה. Controאני עם ה-DNA לא נחוץ כל שורה בתא להשתנות. זכור את הצינורות על קרח, יחד עם קובט electroporation 2 מ&quot;מ לשינוי זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין 2.2 מ&quot;ל של חיץ resuspension לכל שינוי. ממיסים סורביטול לפתרון M 1 ב DDH 2 O, מוסיף 0.1% חומצה pluronic F68 ו-מסנן לעקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חומצה pluronic F68, לריכוז סופי של 0.1% אל התאים, ועל גלולה אותם במשך 10 דקות בכל 8000x גרם ב 10 ° C בצינור 50 מ&quot;ל עם תחתית בצורת חרוט. מיד resuspend התאים מ&quot;ל 1 של חיץ resuspension ידי pipetting למעלה ולמטה, ולהעביר את הצינור microfuge. ספין למטה במשך 10 דקות ב 8000 XG ב 10 ° C, עובד מהר, חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קצה גזירה, resuspend כל גלולה האחרון μl 40 מאגר resuspension. הוסף 40 μl של תאים resuspended אל צינור ה-DNA של כל linearised על קרח, לערבב בעדינות ולהעביר את קובט electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את קובט על electropנאום המכונה. לשנות את ההגדרות כדי kV 6 ס&quot;מ -1, 600 Ω, ו 25 μF. Electroporate התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים electoporated ב cuvettes את בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולהשתמש זמן להכין את תרבות צלוחיות רקמות. לתייג אותם להוסיף 30 מ&quot;ל של ASW טרי זה. קח 1 מ&quot;ל מתוך בקבוק אחד ובעדינות להוסיף אותו קובט המקביל. דגירה של 2 דקות בעדינות להסיר את ASW, עכשיו המכיל כדורית של תאים בעדינות ולאט לאט פיפטה ישירות ASW בבקבוק התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים בדרך כלל להישאר כדורית. יש להיזהר לא ללחוץ או להפריע את התאים מצטברים ברגע זה. אפשר התאים להתאושש בחממה למשך 1-2 שעות, resuspend מכן על ידי רועדת על צלוחיות. בשלב זה, התאים צריכים resuspend בחופשיות גושים לא צריך להיות גלוי. השאירו את התרבויות לשחזר לילה בחממה. </li></ol> 3. הכללה של תאים בצלחות במצע חצי מוצק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><lאני&gt; למחרת, החיטוי פתרון של 2.1% נקודת התכה נמוכה agarose ב DDH 2 O בבקבוק המכיל מוט ערבוב. שמור מותכת על 65-90 מעלות צלזיוס בכוס גדולה יותר המכילה מים על stirrer חימום מגנטי. לשינוי זה להכין 8 צלחות פטרי (בקוטר 55 מ&quot;מ) ו -8 צינורות x 15 מ&quot;ל כל אחת מכילה 9 מ&quot;ל של ASW, בתוספת מבחר הנדרש. אם אתה משתמש Nourseothricin או G418, השתמש 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים את התאים השתנו מן החממה. עבודה flowhood סטרילית, הוסף 1 מ&quot;ל של רותחים LMP agarose כדי מ&quot;ל 9 באחד הצינורות. סגור את הצינור, ומערבבים על ידי היפוך. לאחר מכן הוסף 0.5 מ&quot;ל של תאים שהפכו זה עתה, לערבב במהירות ולשפוך לתוך הצלחת. חזור על תהליך זה עם 7 צינורות הנותרים, ואז להמשיך בקבוק השינוי הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו הצלחות לפתוח בשכונה זרימת במשך שעה, על agarose להגדיר. ואז לסגור את הצלחות ולהעבירם רבועים מנות גדולות פטרי, אשר תקיים 4 צלחות כל אחת. לאטום את השנינות צלחות מרובעH parafilm. לציין כי הצלחות לא יקבע לחלוטין, וכתוצאה מכך, ג&#39;ל הוא שברירי מאוד. יש להיזהר לא לשבור את הג&#39;ל במהלך הטיפול בו הצלחות. מניחים את כל צלחות מרובעות בחממה. </li></ol> 4. מבחר המושבות טרנספורמציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות אמור להופיע לאחר 10 עד 21 ימים על הצלחות שינוי, אך לא על צלחות שהפכו מדומים. לקחת מושבות להשתמש פיפטה 200 μl עם חתוכים טיפים. שעליך לעשות הוא לבחור מושבות בחינם ולמצוץ את המושבה הירוקה. יש להיזהר שלא לכלול תאים מן המושבות השכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים 2 מ&quot;ל של מדיום נוזל המכיל את הבחירה, בצלחת בארות 24. בעת שימוש Nourseothricin, השתמש 1.75 מ&quot;ג / מ&quot;ל. מערבבים ידי pipetting מעלה ומטה. בחר 24-50 מושבות לכל שינוי. לאטום את הצלחות עם parafilm והעברה חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שבוע, להעביר 100 μl של כל טוב 2 מ&quot;ל טרי ASW עם מבחר בצלחת בארות 24 ולגדול על additionaL-7 ימים. שורות תאים ששרדו יכול לשמש למחקרים נוספים. שילוב יציבה למספר הגנום הכניסה יש לנתח באמצעות PCR ו כתם הדרום. הדנ&quot;א הגנומי ניתן להשיג מטרות אלה באמצעות כל שיטה לאורך בקנה מידה סטנדרטית להפקת DNA הצמח. </li></ol> 5. נציג תוצאות פיצול תאים 1/100 הגיעו צפיפות של 25 מיליון תאים למיליליטר לאחר גידול של 7 ימים. Electroporation של תאים עם ההגדרות המתאימות הביא כמה זמן קבועים בין 10 ל 14 אלפיות השנייה. כאשר תאים מועברים בינוני צלוחיות תרבות, כדורית של תאים צריך טופס. כאשר מזועזע קלות אחרי שעה, התאים צריכים בקלות resuspend. הכללה של 1 מ&quot;ל תאים הופכים אגר LMP 0.2% אמורה לגרום ג&#39;ל חצי מוצק עקבי אבל רק. מושבות אמור להופיע לאחר 10 עד 21 ימים. כאשר למהפך 5 מיקרוגרם של ה-DNA linearised באמצעות פרוטוקול לעיל, 50-100 מושבות לכל שינויהצלחת היו אמורים בדרך כלל, לעומת אף על לוחות בקרה שליליות. ~ 80% מושבות הרים נבחרו באופן חיובי על ידי עמידות לאנטיביוטיקה במדיום נוזלי נעשה שימוש במחקרים הבאים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ריכוז סופי </td><td> המניות פתרון </td><td> נפח של 1 ליטר </td></tr><tr><td> NANO 3 </td><td> 8.83 x 10 -4 M </td><td> 75 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td> 3.63 x 10 -5 M </td><td> 2.68 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> β-glycerophosphate </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 2.16 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> H 2 3 SEO </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1.29 מ&quot;ג / ל &#39;ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> טריס בסיס (pH 7.2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121.1 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> K עקבות פתרון מתכת </td><td></td><td> טבלה 2 </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> f / 2 פתרון ויטמין </td><td></td><td> לוח 3 </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1. המרכיבים בינוני לצמיחה של א &#39; tauri 11, 12. איפור בנפח כולל של 1 ליטר של מי ים מלאכותיים כדי מליחות של 30 ppt, ולהוסיף את המרכיבים הנ&quot;ל מפתרונות מניות כמצוין. סנן-לעקר בינוני ושימוש בתוך שבוע. מניות של כל תרכובות מלבד פתרון ויטמין ניתן ונקווה להוסיף 6 מ&quot;ל של פתרון זה עבור כל ליטר של המדיום. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ריכוז סופי </td><td> המניות פתרון </td><td> סכום של 1 ליטר </td></tr><tr><td> Na 2 </sUB&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41.6 גרם </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6 שעות 2 O </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td></td><td> 3.15 גר &#39; </td></tr><tr><td> Na 2 מו 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6.3 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22.0 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6 שעות 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10.0 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180.0 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9.8 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה <sub&gt; 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> טבלה 2. עקוב אחר פתרון מתכת 11,12. לעשות עד לסך של 1 ליטר, ב ד&quot;ה 2 O, וחום לפרק. הפתרון aliquot ומקפיאים לאחסון. הריכוזים האחרונים הצביעו מתייחסים בינוני של דבר, לא הפתרון מתכת עקבות. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ריכוז סופי </td><td> המניות פתרון </td><td> סכום של 1 ליטר </td></tr><tr><td> ויטמין B 12 </td><td> 1 x 10 מ -10 </td><td> 1 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 1 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> ביוטין </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0.1 גר &#39;/ ל&#39; ד&quot;ה 2 O </td><td> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> תיאמין • HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 מ&quot;ג </td></tr></tbody></table> לוח 3. f / 2ויטמין הפתרון 11. לעשות עד לסך של 1 ליטר ב DH 2 O, פילטר לעקר, aliquot ומקפיאים. הריכוזים האחרונים הצביעו מתייחסים בינוני של דבר, לא הפתרון ויטמין. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> באיור 1. סקירה גרפית של תהליך השינוי. ייצוג סכמטי של הליך גנטית כדי להפוך Ostreococcus tauri ידי electroporation. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> איור 2. תאים גדילה והתרבות. הם תת תרבות בסביבה נקייה מחיידקים, בדילול של 1/100 ב ASW טרי כל 7 ימים, גדל תחת אור קבוע גידול צמחים בחממה מצויד אור ירח כחול הסינון. עוצמת האור צריך להיות קרוב ל 20 μmol m -2 s -1 והטמפרטורה נשמרת על 20 מעלות צלזיוס תאים אינם דורשים תסיסה מתמדת, אבל הם שלhaken אחת ל -2 עד 3 ימים כדי למנוע צבירה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> איור 3. במושבה היווצרות על 0.2% LMP agarose. העברת 4 צלחות פטרי צלחת גדולה בכיכר, ואת החותם עם parafilm (למעלה משמאל). כאשר הקימו מושבות, פשוט לבחור בחינם (באופן אידיאלי בצורת conically) מושבות (מימין למעלה) ולמצוץ אותם בצלחת עם טפטפת P200. לא אמורה להיות מושבות בשלט שלילית (מימין למטה).

<ol>
	<li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features.">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li><li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+ultrastructure+of+O.+tauri:+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell.">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749 (2007).</li><li>O'Neill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+persist+without+transcription+in+a+eukaryote.">Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote.</a> Nature. 469, 554-558 (2011).</li><li>van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+function+is+required+for+biological+timing+throughout+the+twenty-four+hour+cycle.">Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle.</a> Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).</li><li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms.">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li><li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clocks+in+the+green+lineage:+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus.">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li><li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells.">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li><li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light/dark+cycles.">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192 (2010).</li><li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri.">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li><li>Corellou, F., Bouget, F. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+polypeptides+from+the+nuclear+genome+of+Ostreococcus+sp.">Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp.</a> US application patent. , (2010).</li><li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt,+and+Detonula+confervacea+(cleve)+Gran.">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li><li>Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media+for+the+culture+of+oceanic+ultraphytoplankton.">Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton.</a> J. Phycol. 23, 633-638 (1987).</li><li>Djouani-Tari, e. l. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus:+Application+to+circadian+clock+functional+analysis.">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471 (2011).</li><li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus.">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957 (2010).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

נייד axeny המדינה והתרבות היא בעלת חשיבות מכרעת לתהליך השינוי. למרות שתאי נשמרים בדרך כלל מחזורים של 12 שעות אור, 12 שעות חושך, יעילות השינוי בתאים הגדלים בתנאים הללו נמצאו מספיק. במהלך pelleting / resuspension צעדים חוזרים ונשנים, התאים תמיד צריך resuspend בקלות. אם תאים צבירה, או חומר דמוי ריר נוכח, עדיף להתחיל את התהליך מההתחלה שוב. בדרך כלל, ~ 50 מושבות ניתן לצפות על כל צלחת שינוי, לעומת אף על צלחת הביקורת השלילית. במקרה של יעילות הטרנספורמציה נמוכה, תנאי culturing צריכים להיות מגוונים על מנת להבטיח התאים נמצאים במצב אופטימלי. המשתנים המשפיעים על יעילות השינוי כוללים טמפרטורת הסביבה במעבדה (צריך להיות קרוב ל 20 מעלות צלזיוס) ומהירות הטיפול (נוהל מ pelleting תאים [2.3] להחלמה [2.7] צריך לקחת ~ 1 שעה). כמו כן, חשוב כי כל כמה פתרונותRe עשה טרי לפני כל שינוי. עבור הכללה צלחות, ריכוז LMP agarose הוא קריטי. תאים Ostreococcus לא יגדל ב ריכוזים גבוהים agarose, ויהיה לפזר בריכוזים נמוכים. שלושה וקטורים שינוי עבור Ostreococcus פורסמו בעבר 6, ו וקטורים נוספים צפויים להיות שנוצר ופורסם זמן קצר. וקטור קיים פוט לוק 6 מאפשר שימוש promotor הבחירה בשילוב עם תג גחלילית בטרמינל C-בלוציפראז המאפשר בחירת הקו מהונדס מהיר בתוספת דפוסי הביטוי צייתן, בעוד וקטור Potox 6 נושא מושרה חזק 13 promotor שנלקח Ostreococcus זיקה גבוהה פוספט Transporter (HAPT) הגן ביטוי יתר של הגן של עניין. וקטור Potox לוק נובע Potox, נושא בלוציפראז סמן נוסף שניתן להשתמש בו לבחירה ישירה של קווי overexpression <sעד&gt; 14. סמנים בחירה מוצלחת על וקטורים אלו Nourseothricin ו G148. עם זאת, תאים Ostreococcus עמידות מאוד בפני אנטיביוטיקה רבים, ריכוזי חומרים הדרושים מבחר מהונדס לתאי Ostreococcus הוא גבוה יותר מאשר עבור מערכות המודל המקובל (2 מ&quot;ג / מ&quot;ל). אמנם התהליך נראה בלתי יעיל, מספר גדול של תאים ו-DNA פלסמיד צורך בהליך זה אינו מהווה מכשול משמעותי. הגבלה גדולה יותר היא שכל קו שנוצר כי הוא עמיד בפני סמן לבחירה צריך להיות מנותח בנפרד כדי לבדוק את המבנה כולו משולב ב-DNA. ראינו דוגמאות שבהן ביטוי מוצלח של סמן לבחירה לא תואמות את הכניסה של הגן בפועל של עניין, כלומר אינטגרציה חלקי יכול להתרחש. ככל הנראה, הכניסה אקראי לתוך הגנום גם אומר שאין שליטה על הכניסה לאתר באמצעות שיטה זו, ושיטות בased על רקומבינציה הומולוגיים כרגע בשלבי פיתוח. עם זאת, השיטה המתוארת כאן היא, למיטב ידיעתנו, כיום השיטה מאופיינת רק כדי לייצר תאים Ostreococcus מהונדסים גנטית. כמו Ostreococcus tauri רק לאחרונה נעשה שימוש כאורגניזם מודל ניסיוני, רוב שיטות עבודה עם תאים אלה עשוי להתפתח להיות מעודן על ידי קהילת המחקר הגוברת מעורב. פרוטוקול זה נועד לעזור לאנשים להתחיל לעבוד עם Ostreococcus, אבל בשום פנים ואופן לא מתיימר לתאר את כל מה שיש לדעת על שינוי גנטי של microalga זה. אמון המחברים כי הקוראים יוכלו להתאים את פרוטוקול לצרכים שלהם כמו הבדלים קטנים חממות (רמות האור או איכות) ופרמטרים נוספים יהיו קיימים וסביר צריך להיות מותאם במעבדה כל אדם לקבל את התרבויות בריאים הדרושים לכך פרוטוקול. לאחר שליטה בטכניקות שתוארו כאן,וקטורים ניתן לבנות ליצור זורח, פלורסנט, או קווים אחרים היתוך מתוייגים תחת שליטה של ​​מגוון רחב של promotors. זו פלטפורמה מרגש ניסיוני הספר יהיה שימושי ללמוד כמה בעיות ביוכימיות מסובכות נפתרות ב eukaryote מורכבות מופחתת, בו גישות תרופתי הם הקלו מאוד 3.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> בינוני מרכיבים </td></tr><tr><td> כימי </td><td colspan="2" > מספר קטלוגי </td><td> ספק </td></tr><tr><td> מיידית האוקיינוס ​​ימית מלח </td><td colspan="3"> מ <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> או <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NANO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> NH 4 Cl </td><td colspan="2"> A9434-500 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> 2-גליצרול פוספט הרכב: מימה מלח </td><td colspan="2"> G9422-100 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> H 2 3 SEO </td><td colspan="2"> 84920-250 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> אולטרה טהורים טריס </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500 גרם </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6 שעות 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Na 2 מו 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31439-100 גרם-R </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6 שעות 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203734-5G </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ויטמין B 12 (cyanocobalamin) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ביוטין </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> תיאמין • HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Ampicillin </td><td colspan="2"> A9518-25 גרם </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Neomycin </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> Kanamycin </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td colspan="4"> חומרים מתכלים ל culturing </td></tr><tr><td colspan="2"> פריט </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ספק </td></tr><tr><td colspan="2"> תרביות רקמה קנקן T25 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> תרביות רקמה קנקן T75 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedלא </td></tr><tr><td colspan="2"> תרביות רקמה קנקן T175 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> הדף TPP בקבוק מסננים, 1 ליטר, להשלים </td><td> 99950T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> TPP מסננים בקבוק העליון, 500 מ&quot;ל, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> הדף TPP בקבוק מסננים, 250 מ&quot;ל, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> הדף TPP בקבוק מסננים, 150 מ&quot;ל, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience הלנה </td></tr><tr><td colspan="2"> מליחות מטר ימית Aquarium </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3" > כימיקלים לשינוי </td></tr><tr><td> כימי </td><td> קטלוגמספר </td><td> ספק </td></tr><tr><td> D-סורביטול </td><td> S6021-1 ק&quot;ג </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> F-68 Pluronic פתרון </td><td> P5556-100 מ&quot;ל </td><td> סיגמא </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> ורנר </td></tr><tr><td> נקודת התכה נמוכה agarose </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> מתכלים לשינוי </td></tr><tr><td> פריט </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ספק </td></tr><tr><td> תרביות רקמה קנקן T25 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> תרביות רקמה קנקן T75 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> תרבות Flask רקמות T175 השעיה Cultures פרקו עם יציקת ערוץ </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> גריינר צינורות צנטריפוגות 50 מ&quot;ל </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> הגן Pulser / MicroPulser cuvettes, 0.2 הפער ס&quot;מ, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> ביו רד </td></tr><tr><td> פטרי צלחת עגולה PS 3 פתחי אוורור H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR הבינלאומי </td></tr><tr><td> פטרי צלחת מרובעת עם קלקר פתחי 4 סטרילית ידי 120mm קרינה ברורה </td><td> FB51788 </td><td> פישר סיינטיפיק </td></tr><tr><td> אור ירח כחול בהיר מסנן </td><td> 183 </td><td> לי תאורה </td></tr></tbody></table>

genomic transformation of the picoeukaryote ostreococcus tauri

בעיות נפוצות פוגע ההתקדמות המהירה במדעי הצמח כולל רקמות הסלולר, והמורכבות האורגניזם כולו, בעיקר רמה גבוהה של יתירות גנומית להשפיע על הגנטיקה פשוטים צמחים גבוהים יותר. אורגניזם מודל הרומן Ostreococcus tauri הוא הקטן ביותר החופשי חי eukaryote הידוע עד כה, ו בעל גודל הגנום הקטינה באופן משמעותי את המורכבות ואת 1,2 הסלולר, באה לידי ביטוי על ידי נוכחות של רק אחד רוב האברונים (mitochondrion, הכלורופלסט, מחסנית Golgi) לכל התא, גנום המכיל רק ~~~HEAD=NNS 8000 גנים. יתר על כן, השילוב של unicellularity והתרבות קל מספק פלטפורמה מקובל גישות וביולוגיה כימית. לאחרונה, Ostreococcus כבר מצליחים ללמוד המנגנונים הבסיסיים העומדים בבסיס מדידת זמן היממה 3-6. תוצאות של אורגניזם מודל זה השפיעו לא רק מדע הצמח, אלא גם בביולוגיה של יונקים 7. דוגמה זו מדגישה עד כמה ניסויים מהירהeukaryote פשוט משושלת ירוק יכול להאיץ מחקר באורגניזמים מורכבים יותר על ידי יצירת השערות לבדוק בדיקה בשיטות אפשרי מבחינה טכנית רק רקע זה של מורכבות מופחתת. ידיעת הגנום ואת האפשרות לשנות את הגנים הם כלים חיוניים כל מין המודל. גנומי 1, Transcriptomic 8, ומידע proteomic 9 על מין זה הוא זמין בחינם, בעוד השיטות שפורסמו בעבר 6,10 גנטית להפוך Ostreococcus ידועים במעבדות ספורות בעולם. במאמר זה, את שיטות ניסיוניות גנטית להפוך את יצור דגם הרומן עם ביטוי יתר לבנות באמצעות electroporation מתוארים בפירוט רב, כמו גם את שיטת הכללת תאים טרנספורמציה של אחוז agarose נמוכה על מנת לאפשר בחירה של קווים ששינו שמקורם אחד הפך התא. בעקבות יישום מוצלח של Ostreococcus למחקר היממה, ההתעניינות הגוברת Ostreococcus ניתן לצפות תחומי מחקר מגוונים בתוך ומחוץ מדעי הצמח, כולל בתחומים ביוטכנולוגיים. חוקרים מגוון רחב של מדעים ביולוגיים ורפואיים שעובדים על הביוכימיים המשתמרים לשקול מחקר ב רודף Ostreococcus, ללא המורכבות גנומית האורגניזם המינים מודל גדולים יותר.

Watch this Scientific Journal Video about Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri at JoVE.com

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

מאמר זה מתאר את השינוי הגנטי של unicellular אצה ימית<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; על ידי electroporation. זה האורגניזם האיקריוטים הוא פלטפורמה מודל יעיל צמחים גבוהים יותר, possesing המורכבות גנומית הסלולר הקטינה באופן משמעותי ולהיות מקובל בקלות לתרבות הן התא וביולוגיה כימית.

שינוי גנטי של Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

15.6K Views.  University of Edinburgh. מאמר זה מתאר את השינוי הגנטי של unicellular אצה ימית Ostreococcus tauri על ידי electroporation. זה האורגניזם האיקריוטים הוא פלטפורמה מודל יעיל צמחים גבוהים יותר, possesing המורכבות גנומית הסלולר הקטינה באופן משמעותי ולהיות מקובל בקלות לתרבות הן התא וביולוגיה כימית.

Video: Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

בידוד של הדנ&quot;א הגנומי של זנבות עכבר

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1. Due to its capacity to undergo efficient mitotic homologous recombination, Physcomitrella patens has emerged as an important model system in recent years2. This capacity allows high frequencies of gene targeting3-9, which is not seen in other model plants such as Arabidopsis. To take full advantage of this system, we need an effective and easy method to deliver DNA into moss cells. The most common ways to transform this moss are particle bombardment10 and PEG-mediated DNA uptake11. Although particle bombardment can produce a high transformation efficiency12, gene guns are not readily available to many laboratories and the protocol is difficult to standardize. On the other hand, PEG mediated transformation does not require specialized equipments, and can be performed in any laboratory with a sterile hood. Here, we show a simple and highly efficient method for transformation of moss protoplasts. This method can generate more than 120 transient transformants per microgram of DNA, which is an improvement from the most efficient protocol previously reported13. Because of its simplicity, efficiency, and reproducibility, this method can be applied to projects requiring large number of transformants as well as for routine transformation.

Efficient Polyethylene Glycol PEG Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella protonemal protoplast and Arabidopsis mesophyll protoplast transformation1.

פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens</em

A simple and efficient method to transform Physcomitrella pantens protoplasts is described. This method is adapted from protocols for Physocmitrella ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

הגנום MRI - משאב ציבורי עבור לימוד דפוסי בתוך רצף הדנ&quot;א הגנומי

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

לכידה סלקטיבית של 5-hydroxymethylcytosine מהדנ&quot;א הגנומי

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

מערך השוואתי הגנום הכלאה (Array CGH) לאיתור של הגנום גרסאות מספר עותק

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...