This project was funded by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada and the Alberta Innovates - Health Solutions CRIO Team program. MBK is a recipient of studentships from Alberta Innovates - Health Solutions and the Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ is funded by a graduate student support grant from the Alberta endMS Regional Research and Training Center of the Multiple Sclerosis Society of Canada. The authors wish to acknowledge Dr. Jan van Minnen and the Regeneration Unit in Neurobiology core facility for training and use of equipment.

<ol>
	<li>Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+in+the+spinal+cord+of+the+cat+following+intraspinal+injections+of+lysolecithin.">Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin.</a> J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).</li><li>Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+of+mouse+spinal+cord+axons+demyelinated+by+local+injection+of+lysolecithin.">Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin.</a> J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).</li><li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+Schwann-cells+into+the+spinal-cord+of+rat+following+local+injections+of+lysolecithin.">Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).</li><li>Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+occurs+as+extensively+but+more+slowly+in+old+rats+compared+to+young+rats+following+gliotoxin-induced+CNS+demyelination.">Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination.</a> Glia. 28 (1), 77-83 (1999).</li><li>Patrikios, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+is+extensive+in+a+subset+of+multiple+sclerosis+patients.">Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).</li><li>Keough, M. B., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+therapy+for+multiple+sclerosis).">Remyelination therapy for multiple sclerosis).</a> Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).</li><li>Hall, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+injections+of+lysophosphatidyl+choline+into+white+matter+of+the+adult+mouse+spinal+cord.">The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord.</a> J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).</li><li>Miron, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+microglia+and+macrophages+drive+oligodendrocyte+differentiation+during+CNS+remyelination.">M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination.</a> Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).</li><li>Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+impairs+oligodendrocyte+remyelination+following+lysolecithin-induced+demyelination.">Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination.</a> Glia. 35 (3), 202-212 (2001).</li><li>Lau, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+proteoglycans+in+demyelinated+lesions+impair+remyelination.">Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination.</a> Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).</li><li>Fancy, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+Wnt+pathway+inhibits+timely+myelination+and+remyelination+in+the+mammalian+CNS.">Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS.</a> Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li><li>Skihar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+oligodendrogenesis+and+myelin+repair+using+the+multiple+sclerosis+medication+glatiramer+acetate.">Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).</li><li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor-responsive+neural+precursors+give+rise+to+myelinating+oligodendrocytes+after+transplantation+into+the+spinal+cords+of+contused+rats+and+dysmyelinated+mice.">Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice.</a> Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).</li><li>Chong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+inhibitor+Nogo-A+establishes+spatial+segregation+and+extent+of+oligodendrocyte+myelination.">Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).</li><li>Sturrock, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+mouse+corpus+callosum.">Myelination of the mouse corpus callosum.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 6 (6), 415-420 (1980).</li><li>Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+dynamics+in+the+healthy+adult+CNS:+evidence+for+myelin+remodeling.">Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling.</a> Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).</li><li>Woodruff, R. H., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+and+remyelination+of+the+caudal+cerebellar+peduncle+of+adult+rats+following+stereotaxic+injections+of+lysolecithin,+ethidium+bromide,+and+complement/anti-galactocerebroside:+a+comparative+study.">Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study.</a> Glia. 25 (3), 216-228 (1999).</li><li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropillar+assays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis.">Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).</li><li>Powers, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+reporter+reveals+prolonged+refinement+of+spontaneously+regenerated+myelin.">Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).</li><li>Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+remyelination+restores+secure+conduction.">Central remyelination restores secure conduction.</a> Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).</li><li>Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+deficits+induced+by+experimental+spinal+cord+demyelination+are+abolished+by+spontaneous+remyelination.">Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination.</a> Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).</li><li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery.">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מספר המודלים של בעלי החיים פותחו ללמוד MS, רוב recognizably המודל הניסיוני Encephalomyelitis אוטואימוניות (EAE). בEAE, מכרסמים הם חוסנו נגד שבר של פפטיד המיאלין ועוברים התפתחות נגע דלקתית המתבטאת בשיתוק עולה. בעוד מודל זה היה שימושי עבור בדיקות פרה-קליניות של תרופות טרשת נפוצה המערכת החיסונית, זה לא אידיאלי ללימוד חידוש יצירת המיאלין משלוש סיבות עיקריות: ראשית, המיקום של נגעים דלקתיים הוא אקראי במידה מסוימת, ואיתור נגעים בעת עיבוד רקמות ללמחצה או ultrathin חלקים יכולים להיות מאתגרים. השני הוא שחידוש יצירת המיאלין מתרחש על פני כמובן זמן מסוים, והגיל של נגע EAE אחת המדויק לא ניתן לדעת בלי הדמיה מגנטית לא פולשנית מתמשכת תהודה. השלישי הוא שחידוש יצירת המיאלין הוא תופעה מתרחשת באופן טבעי במכרסמים, וראיה לחידוש יצירת המיאלין הבאה טיפול תרופתי בEAE לא יכולה להיות תוצאה העיקרית של התרופה, אבל בסטיד תופעה משנית של הפחתת דלקת. שיטה נפוצה נוספת של ייצור demyelination מושגת על ידי החדרת cuprizone chelator הנחושת בתזונה. כתוצאה מכך demyelination הנרחב, בעיקר בכפיס המוח. יש מגבלות בלימוד כפיס המוח כאתר של חידוש יצירת המיאלין מהסיבות הבאות: ראשית, קטרי האקסון (ובכך עובי המיאלין) הם קטנים יותר מאשר אזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, ונדנים כך remyelinated דק יכולים להיות שאין להבחין בין אלה שאף פעם לא היו demyelinated. שנית, משום שכפיס מוח העכבר מכיל אקסונים unmyelinated&gt; 70% 16, זה יכול להיות לא ברור אם קטע remyelinated הוא תיקון אמיתי של המיאלין נפגע או דה נובו סינתזת המיאלין במבוגרים, אשר מתרחש בדרך כלל 17. זה האמונה שלנו שהמודל הטוב ביותר ללימוד חידוש יצירת המיאלין הוא ההזרקה הישירה של רעלים, או lysolecithin, ethidברומיד ium, או אחר, לpeduncles הזנב המוחית 18 או חומר לבן בחוט השדרה. המיקום לשעבר מושגת רק על ידי הזרקת stereotactic 3-ממד מדויק, ומוגבל למכרסמים גדולים יותר (חולדות) בשל גודלו הקטן של peduncles המוח הקטן. זה אינו כולל את המשאב הנרחב של עכברים הטרנסגניים בלימוד דה וחידוש יצירת המיאלין. חוט השדרה, לעומת זאת, מכיל קטעים רבים גדולים חומר לבנים כי הם בקלות בניתוח נגיש. רווחים בין החוליות במגזר החזה מקורי מאפשרים חשיפה של חוט השדרה ללא הצורך בlaminectomy, אשר הוא צעד הכרחי בפרוצדורות כירורגיות בבית חזה הזנב. יתרון של מיקוד ספציפי בחומר לבן הגחון הוא שהאקסונים הם אחיד יותר גדולים מהחומר לבן גב, מה שהופך את הכימות של חידוש יצירת המיאלין פחות מעורפל משימה דומה לאתגרים הקשורים בכפיס המוח. בנוסף, החומר לבן הגחון מפצה t הרבה יותר גדולarget אזור להזריק; כמה מאה מיקרונים רוחבי באזור הגב יעמידו את הנימים מחוץ לטור, ואילו באותו הסטייה ventrally עדיין לייצר נגע demyelinating בולט. פרוטוקולים כמה להזריק lysolecithin לשני הגב וגחון עמודות של אותה החיה 19. זה יכול להגדיל הן את הסבירות למיקום נימים נכונה ומספר הנגעים לכימות בפחות בעלי חיים. בעוד שהנתונים הנוכחיים המוצגים הנו מבעלי חיים ישנים 8-10 שבוע בזמן של פעולה, גם היה לנו הצלחה באותו אופן על עכברים ישנים 8-10 חודשים, שבו חידוש יצירת המיאלין מתואר כניכר איטי 4. כימות של חידוש יצירת המיאלין היא לא התחייבות של מה בכך. דוגמה מרכזית טוענת כי מגזרי remyelinated הם קצרים יותר באורך ודק יותר בממוצע מאשר עמיתיהם הבריאים, ולכן חישובי g-יחס (בקוטר האקסון מחולק בהאקסון + קוטר מיאלין) של חתך רוחב-למחצה oסעיפי Ultrathin r הפכו הליך סטנדרטי. עם זאת, ידוע כי מגזרי remyelinated לעבות לאורך זמן 2 ומחקר שנערך לאחרונה באמצעות כתב מהונדס של oligodendrocytes remyelinating עולה כי internodes רב הפך סופו של הדבר שאין להבחין בין שליטה 20. כימות מספר oligodendrocytes הבוגרת בתוך הנגע היא דרך עקיפה למדידת תיקון, כoligodendrocytes מסוגלת לעשות מספר רחב של internodes, וחלק משמעותי במודל בהתאם-חידוש יצירת המיאלין משומש יכול להתרחש מתאי שוואן 3. כמובן, כמו חידוש יצירת המיאלין נקשר לשיקום הולכה הקופצנית 21, המדד האולטימטיבי של תיקון יהיה התאוששות תפקודית של גירעונות נוירולוגיות. בעוד חידוש יצירת המיאלין נקשר להתאוששות של תפקוד בכמה מינים 22,23, זה לא הפך הליך סטנדרטי במחקרי lysolecithin עכבריים. זה כנראה עקב חוסר observ הגלויגירעונות מסוגלים מנגעים או הגבי או הגחון, בהשוואה לדגמי demyelination חזקים יותר כגון EAE ואפילו cuprizone. אנו מאמינים כי ליקויים תפקודיים הנובעים מlysolecithin הזרקה, והתאוששות שלאחר מכן עם חידוש יצירת המיאלין, יהיו רק נצפים באמצעות בדיקות רגישות של תפקוד הסנסורית בסדר. חיפוש PubMed של &quot;חידוש יצירת המיאלין&quot; לצד אחד מהמודלים של בעלי החיים המפורטים לעיל, אם כי גישה מתודולוגית גסה, תערוכות להיטי חיפוש פחות לlysolecithin (109) בהשוואה לEAE (188) וcuprizone (197). אם הטענה שלנו שlysolecithin demyelination הוא הגישה מעולה ללימוד חידוש יצירת המיאלין, למה זה דן לפחות? אולי חשש לשימוש בשיטה זו נובע מאמונה של קושי טכני בביצוע הפעולה כירורגית. למעשה, הליך זה הוא מהיר, יעיל וחסכוני, ואין קשה יותר מנתיחת רקמה שגרתית, הדורש חומרים שהם כל commerזמין בייחוד-. תקוותנו הוא כי פרוטוקול זה מוכיח שימושי עבור אלה שרוצים להוסיף מודל זה חזק לרפרטואר שלהם ללימוד תחום המרתק והרחבת של תיקון המיאלין.

טרשת נפוצה (MS) היא מחלה כרונית demyelinating של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המאופיינת בחדירת תאים חיסונית ושלטים המכילים איבדו המיאלין, oligodendrocytes, אקסונים ותאי עצב. רוב החולים מהלך מחלה מורכב מהתקפים דלקתיים מלווים במגוון רחב של תסמינים נוירולוגיים, ואחריו תקופות של הפוגה. למעלה ממחצית חולים אלו סופו של דבר לעבור לשלב מתקדם משניים ללא הישנות לכאורה אך ירידת נוירולוגית מתמשכת. הוא האמין כי ההידרדרות מתקדמת וזאת בשל נזק ואובדן axonal, תרם בחלקו על ידי demyelination הכרוני. אסטרטגיות כדי לשחזר מיאלין שאבד הם וכך נחשבים גישת טיפול מבטיחה לעכב את התקדמות מחלה ואולי להפוך סימפטומים נוירולוגיים. חידוש יצירת המיאלין היא תגובת תיקון אנדוגני במערכת העצבים המרכזית לפיה נדני המיאלין חדשים שנוצרו מתאי מבשר oligodendrocyte גויסו(OPCs) שלהתמיין oligodendrocytes יוצרי מיאלין. חידוש יצירת המיאלין הוכח במודלים של בעלי חיים כדי להיות די חזק 1-3, לעומת זאת, היעילות שלה יורדת עם גיל 4. ואכן, חידוש יצירת המיאלין מתרחשת בבני אדם למרות שהוא לא שלם ברוב המכריע של חולי טרשת נפוצה 5. כל התרופות זמינות כעת עבור MS בעיקר למקד את הרכיב חיסוני החריג של המחלה, ובעוד יעילים בהפחתת התקפים, לא במידה ניכרת לעכב את התקדמות מחלה. הדור הבא של אסטרטגיות טיפוליות לניהול MS ישלב התקדמות בתפקוד מערכת חיסון עם השיפור של חידוש יצירת המיאלין אנדוגני כדי למנוע הישנויות שני והתקדמות 6. שיטה אחת ללמוד דה וחידוש יצירת המיאלין במערכת העצבים המרכזית כרוכה בהזרקה הישירה של חומר הניקוי lysophosphatidylcholine (lysolecithin) ל1,3,7 חומר לבן בחוט השדרה. הליך זה מייצר demyelinat מאופיין היטבing פציעה מורכב בעיקר של מקרופאג / חדירת microglial והפעלה 8,9, astrogliosis תגובתי, ההפרעות של הומאוסטזיס axonal / פציעת axonal, והתפשטות OPC והגירה 10. הנגע צפוי מתפתח על פני תקופה של כמה שבועות, והוא מסוגל באופן מלא remyelinating סופו של דבר. שיטה זו הייתה שימושית במיוחד בלימוד כוריאוגרפיה של אירועים המעורבים בדה וחידוש יצירת המיאלין. יתר על כן, זה כבר אימץ ככלי לבדיקות פרה-קליניות של טיפולי מועמד להאצת תיקון הבאים עלבון demyelinating.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:239px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">spring scissors</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">retractor</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">17003-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">clippers</td>
			<td style="width:199px;">Philips</td>
			<td style="width:163px;">QG3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heating recovery chamber</td>
			<td style="width:199px;">Peco Services</td>
			<td style="width:163px;">V1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">surgical tape</td>
			<td style="width:199px;">3M</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scalpel handle</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scalpel blade</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td>No. 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sponge spear</td>
			<td style="width:199px;">Beaver Visitec</td>
			<td>581089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 Vicryl sutures</td>
			<td style="width:199px;">Ethicon</td>
			<td>J511G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">curved ToughCut spring scissors</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15123-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">32 gauge metal needle</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">needle holders</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">angled forceps</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:199px;">Puritan</td>
			<td style="width:163px;">806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gauze pads</td>
			<td style="width:199px;">Safe Cross First Aid</td>
			<td style="width:163px;">3763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">10 &#956;L syringe</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">7635-01</td>
			<td style="width:239px;">make sure to purchase the microliter, not gastight syringe</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">compression fitting</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">55750-01</td>
			<td style="width:239px;">contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 &#956;L syringe is a tighter fit</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">priming kit</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">PRMKIT</td>
			<td style="width:239px;">contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">pre-pulled glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">WPI</td>
			<td style="width:163px;">TIP10TW1 (pack of 10)</td>
			<td style="width:239px;">contains capillaries with 10 &#956;m inner diameter. 30 &#956;m inner diameter also work (TIP30TW1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stereotactic frame</td>
			<td style="width:199px;">David Kopf instruments</td>
			<td style="width:163px;">Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td style="width:199px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Tissue-Tek intermediate cryomold</td>
			<td style="width:199px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">25608-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bright field microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultramicrotome</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysophosphatidylchoine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">L1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-methylbutane</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-SMI312 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Covance</td>
			<td style="width:163px;">SMI-312R</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-MBP antibody</td>
			<td style="width:199px;">Abcam</td>
			<td style="width:163px;">AB40390</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-PDGFR&#945; antibody</td>
			<td style="width:199px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:163px;">AF1062</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-Olig2 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:163px;">AB9610</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-CC1 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:163px;">OP80</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:199px;">Life technologies</td>
			<td style="width:163px;">A-11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:199px;">Life technologies</td>
			<td style="width:163px;">A-11003</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">705-546-147</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">715-586-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">711-606-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ketamine</td>
			<td>CDMV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">xylazine</td>
			<td>CDMV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iodine</td>
			<td>West Penetone</td>
			<td>2021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vaseline petroleum jelly</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA05971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eriochrome Cyanine R</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iron(III) chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ammonium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acrytol</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3801700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrisolv</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-143-975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">osmum tetroxide</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td>highly toxic</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cacodylic acid</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">propylene oxide</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>20401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMBED kit</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eriochrome cyanine solution</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ingredient</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Amount to add</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eriochrome Cyanine R</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">0.8 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">400 mL 0.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iron(III)chloride</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">20 mL 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">80 mL</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:216px;">*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year.</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelvatol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ingredient</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Amount to add</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>140 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>40 g</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">*mix well, place at&#160; 37 &#176;C overnight, centrifuge at 1960xg 30 min, aliquot into 40 tubes</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental demyelination and remyelination of murine spinal cord by focal injection of lysolecithin

טרשת נפוצה היא מחלה דלקתית demyelinating של מערכת העצבים המרכזית המאופיינת בהיווצרות רובד המכילה oligodendrocytes איבדה, מיאלין, האקסונים, ותאי עצב. חידוש יצירת המיאלין הוא מנגנון תיקון אנדוגני לפי המיאלין החדש מיוצר לאחר התפשטות, גיוס, והתמיינות של תאי מבשר oligodendrocyte לoligodendrocytes יוצרי מיאלין, ויש צורך להגן על האקסונים מנזק נוסף. נכון לעכשיו, כל התרופה לטיפול בטרשת הנפוצה למקד את הרכיב החריג חיסוני של המחלה, אשר להפחית התקפים דלקתיים אבל לא למנוע התקדמות לירידת נוירולוגית בלתי הפיכה. לכן זה הכרחי כי אסטרטגיות קידום חידוש יצירת המיאלין מפותחות אשר עשוי לעכב את התקדמות מחלה ואולי להפוך סימפטומים נוירולוגיים. מודלים של בעלי חיים כמה מdemyelination קיימים, כוללים Encephalomyelitis אוטואימוניות הניסיוני וcurprizone; עם זאת, יש Limitations בשימוש בם ללימוד חידוש יצירת המיאלין. גישה חזקה יותר היא הזרקת המוקד של רעלים במערכת העצבים המרכזית, כוללים lysolecithin חומר הניקוי לתוך החומר לבן חוט השדרה של מכרסמים. בפרוטוקול זה, אנו מראים כי ההליך הכירורגי הכרוך בהזרקת lysolecithin לחומר לבן הגחון של עכברים הוא מהיר, יעיל וחסכוני, ולא דורש חומרים נוספים מאלה זמינים מסחריים. הליך זה הוא חשוב לא רק ללימוד האירועים הרגילים מעורבים בתהליך יצירת מיאלין מחדש, אלא גם ככלי פרה-קליני לסינון תרופות קידום חידוש יצירת המיאלין מועמד.

הזרקת מוקד של lysolecithin לחומר לבן הגחון מייצרת נגע demyelinating דיסקרטי שניתן לזהות על פני מרחק של כ -3 מ&quot;מ (איור 2). מכתים immunohistochemical של ליבת הנגע למיאלין (MBP) ואקסונים (SMI312) מראה האקסונים שהופשטו מהמיאלין ב -7 ימים (איור 3). ב -14 ימים, אקסונים רבים מוקפים בטבעות MBP-חיוביות, המציעה את המופע של חידוש יצירת המיאלין. מכתים לתאים של שושלת oligodendrocyte (PDGFRα, Olig2, גג 1 &#39;), יש עלייה משמעותית בשני המספר הכולל של תאים ב 14 ימים לעומת 7 ימים, כמו גם ההפצה של oligodendrocytes הבוגרת בהשוואה לOPCs (איור 4) . עולה בקנה אחד עם ממצא זה, סעיפי semithin המוכתמים בtoluidine הכחול לחשוף את הנוכחות של נדני המיאלין דקים ב -14 ימים שאותרו רק לעתים נדירות ב7 ימים (איור 5), מצביע על כך שאלו remyelinated internodes. ההליך הוא מאוד לשחזור בין בעלי החיים. וריאציה מתרחשת כאשר נשימה כבדה משנה את המצב הנייח של הנימים-זה בדרך כלל לא בעיה עם הרגעה הולמת. נזק לאקסונים נראה מינימאלי, למעט במרכז מאוד של הנגע, אשר תואר מאז השימוש המוקדם ביותר של המודל 1. אנו מאמינים שזה יהיה פגיעה מכאנית מנימי הזכוכית, כפי שהוא גם נצפים בPBS מוזרק בקרות. עם זאת, שונות נוטה להיות קטן, ואנחנו ואחרים באמצעות הליך דומה זיהינו הבדלים בין תנאי ניסוי עם כמה כמו 4 חיות לכל קבוצה 15. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig1.jpg" /> איור 1. אסיפה של מזרק הזרקה. () האגוז של מזרק ההזרקה היא מושחלת על t<html> הוא קצו השטוח של נימי הזכוכית, ואחריו 2 ferrules כך שההזדווגות שלהם מסתיימת משתלבים. ברגע שהנימים הן צמודה היטב בטבעת חזוק חרוטי, ההרכבה מוברגת יד הדוקה על הסוף של מזרק הזרקה. (ב) חתיכת מרכז דיסק גומי עם מחט רכזת מתכת מחוברת למזרק תחול ולהחליק אותו ל הבסיס. (ג) משיכה lysolecithin פתרון לתוך המזרק תחול. (ד) בעדינות לדכא את המזרק תחול עד הטיפה הראשונה של lysolecithin גלויה בקצה המחט. (E) הכנס את המזרק תחול לתוך החבית של ההזרקה מזרק, מה שהופך את חותם משרד עם דיסק הגומי. בעדינות לוחץ על הפתרון עד שהוא רץ לסוף הנימים. לסגת בזהירות את המזרק תחול תוך שמירה על לחץ על הבוכנה כדי להסיר את מחט רכזת מתכת ללא החדרת בועות אוויר לתוך מזרק הזרקה.להעלות / 52,679 52679fig1large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig2.jpg" /> נציג איור 2. lysolecithin הנגע מוכתם בeriochrome cyanine. סעיפים סידוריים (במרווחים 400 מיקרומטר בנפרד) של נגע lysolecithin אופייני בגיל 14 ימים מוכתמים בeriochrome cyanine לדמיין המיאלין (כחול). הערה demyelination שמוגבל לחומר לבן הגחון ושמשתרע על פני כ הנגע 3 מ&quot;מ במקורי / כיוון הזנב. בר סולם = 1 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig3.jpg" /> האקסונים איור 3. והמיאלין במודל lysolecithin. (א) דמה (PBS) מוזרק בחוט השדרה בשעה 7 ימים תערוכות אקסונים בריאים שמוקפים בטבעות המיאלין. (B) lysolecithin נגע בתערוכות 7 ימים ערומים האקסונים כמו גם המיאלין המושפל. (ג) בגיל 14 ימים, חלקם של האקסונים (דוגמאות מצוינות עם ראשי חץ לבנים) קשורים עם הופעתו של טבעות מיאלין. בר סולם = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig4.jpg" /> איור 4. תאי שושלת oligodendrocyte במודל lysolecithin. (A, C) בשעת 7 ימים, יש ייצוג גדול יותר של PDGFRα + OPCs (ברים לבנים) ביחס לoligodendrocytes + גג 1 &#39;(ברים מג&#39;נטה); המספרים בתוך הברים מייצגים אחוזים. Olig2 נבדק ללאשר צביעת תאי שושלת oligodendrocyte. (B, C) ​​בגיל 14 ימים, יש עלייה משמעותית במספר הכולל של תאי שושלת oligodendrocyte לעומת 7 ימים (p &lt;0.05, t-test שני זנב, n = 4 לכל קבוצה ). יש גם עלייה משמעותית בחלוקת oligodendrocytes לOPCs ב 14 ימים לעומת 7 ימים (p &lt;0.0001, הבדיקה המדויקת של פישר). בר סולם = 10 מיקרומטר. כל שדה הוא נתפס בהגדלה מקורית של 60x. ערכים הם ממוצעים ± SD. * מציין p &lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig5.jpg" /> איור 5. חידוש יצירת המיאלין במודל lysolecithin. Toluidine כחול חתך המוכתם semithin סעיף של החומר לבן הגחון בhea ()מטונף עכבר תערוכות האקסונים על פני טווח רחב של קליבר עם עובי המיאלין בהתאמה. (ב) בשעה 7 ימים, חוסר נדני המיאלין נצפה בסמוך לאזור מושפע (מימין למטה). (ג) בגיל 14 ימים, נדנים דקים myelinated ( דוגמאות מצוינות עם ראשי חץ אדומים) מופיעות ברחבי הנגע, מעיד על מגזרי remyelinated. בר סולם = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin at JoVE.com

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

ניסוי demyelination וחידוש יצירת המיאלין של חוט השדרה Murine על ידי הזרקת מרחק מיקוד של Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

experimental-demyelination-remyelination-murine-spinal-cord-focal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.9K Views.  Hotchkiss Brain Institute at University of Calgary. Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Video: Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; חוט השדרה מושרה לייזר הפגיעה דגם להערכת מנגנוני axonal הניוון בזמן אמת

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the spinal cord, tumor resections, or tissue defects resulting from traumatic accidents can aid in facilitating general tissue repair as well as regenerative growth of nerve fibers into and beyond the affected area. Two experimental treatment strategies are presented: (1) implantation of a novel microconnector device into an acutely and completely transected thoracic rat spinal cord to readapt severed spinal cord tissue stumps, and (2) polyethylene glycol filling of the SCI site in chronically lesioned rats after scar resection. The chronic spinal cord lesion in this model is a complete spinal cord transection which was inflicted 5 weeks before treatment. Both methods have recently achieved very promising outcomes and promoted axonal regrowth, beneficial cellular invasion and functional improvements in rodent models of spinal cord injury.
The mechanical microconnector system (mMS) is a multi-channel system composed of polymethylmethacrylate (PMMA) with an outlet tubing system to apply negative pressure to the mMS lumen thus pulling the spinal cord stumps into the honeycomb-structured holes. After its implantation into the 1 mm tissue gap the tissue is sucked into the device. Furthermore, the inner walls of the mMS are microstructured for better tissue adhesion.
In the case of the chronic spinal cord injury approach, spinal cord tissue - including the scar-filled lesion area - is resected over an area of 4 mm in length. After the microsurgical scar resection the resulting cavity is filled with polyethylene glycol (PEG 600) which was found to provide an excellent substratum for cellular invasion, revascularization, axonal regeneration and even compact remyelination in vivo.

Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

אסטרטגיות ניסיון לגשר על פערים גדולים של רקמה בחוט השדרה נפגע לאחר חריפת נגע כרוני

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

הדמיה פעילות עצבית בתוך קליפת המגע הראשי באמצעות Thy1-העכברים הטרנסגניים GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

מודל חולדה של דמיאלינציה קליפת המוח הנרחבת הנגרמת על ידי הזרקה תוך מוחית של ציטוקינים פרו דלקתיים

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

זיהוי סמני שטח תא של גזע עצבי ראשוני ובתאי מחולל מטבולית על ידי תיוג מטבולי של סילוגליקן

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. Injection directly into spinal cord tissue bypasses these barriers, providing access to cell bodies or synapses where molecules can be incorporated. Combining viral vector technology with this method allows for introduction of target genes into nervous tissue for the purpose of gene therapy or tract tracing. Here a virus engineered for highly efficient retrograde transport (HiRet) is introduced at the synapses of propriospinal interneurons (PNs) to encourage specific transport to neurons in the spinal cord and brainstem nuclei. Targeting PNs takes advantage of the numerous connections they receive from motor pathways such as the rubrospinal and reticulospinal tracts, as well as their interconnection with each other throughout spinal cord segments. Representative tracing using the HiRet vector with constitutively active green fluorescent protein (GFP) shows high fidelity details of cell bodies, axons and dendritic arbors in thoracic PNs and in reticulospinal neurons in the pontine reticular formation. HiRet incorporates well into brainstem pathways and PNs but shows age dependent integration into corticospinal tract neurons. In summary, spinal cord injection using viral vectors is a suitable method for introduction of proteins of interest into neurons of targeted tracts.

This protocol demonstrates injection of a retrogradely transportable viral vector into rat spinal cord tissue. The vector is taken up at the synapse and transported to the cell body of target neurons. This model is suitable for retrograde tracing of important spinal pathways or targeting cells for gene therapy applications.

הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral מדגיש מספר מסלולים מוטוריים בחוט השדרה עכברוש

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

בתוך Vivo ישיר של תאים Glial תושב לתוך Interneurons על ידי הזרקת גרם של וקטורים ויראלי

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...