This project was funded by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada and the Alberta Innovates - Health Solutions CRIO Team program. MBK is a recipient of studentships from Alberta Innovates - Health Solutions and the Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ is funded by a graduate student support grant from the Alberta endMS Regional Research and Training Center of the Multiple Sclerosis Society of Canada. The authors wish to acknowledge Dr. Jan van Minnen and the Regeneration Unit in Neurobiology core facility for training and use of equipment.

NOT: Bu prosedürde kullanılan hayvanlar Hayvan Bakımı Kanada Konseyi (CCAC) kurallarına uygun olarak bakım için. Etik Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından kabul edildi. 1. Enjeksiyon için Şırınga hazırlayın <ol><li> (PH 7.4 PBS) ve mağaza, küçük kısımlar halinde -20 ° C (75 ul) içeren fosfat tamponlu tuzlu su içinde bir% 1 çözelti ile lisolesitin çözündürülür. RT bir şişe çözülme. Not: lisolesitin, çözünmemiş ise, bir tekdüze çözelti oluşturmak için yaklaşık 30 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyici (40 kHz), tüp sonikasyon. </li><li> Hassas ucu zarar vermemek için çok dikkatli önceden çekti cam kapiller Kolu. 10 ul enjekte şırınga somunu sökün ve yüksüklerinin çiftleşme uçları hizalayın ve kılcal konik yüksük (Şekil 1) rahat olmasını sağlamak, 2 yüksükler ardından kılcal düz ucuna üzerine geçirin. Izopropil ile şırınga durulayınil alkol ve pistonu çıkartın. Kuru kez, enjekte şırınga üzerine sıkı iğne düzeneği elini sıkın. </li><li> Astar şırınga metal göbek iğne takın. Pierce iğne ile bir lastik disk ve tabanına aşağı doğru kaydırın. Lizolesitin ile astar şırınga doldurun. Sıvı iğne ucu görünür kadar hafifçe priming şırınga basın. Bu hava kabarcıkları enjekte şırınga içine olmayacak sağlar. </li><li> Enjekte şırınga içine astar şırınga metal göbek iğne takın. Kılcal çözeltisi ile ucu doldurana kadar lastik disk ile bir firma mühür yapma, yavaş yavaş priming şırınga basın. Aynı anda hava kabarcıkları tanıtan olmadan enjekte şırınga varil doldurmak için basarken dikkatli astar şırınga çıkarın. Enjekte şırınga içine pistonu takın ve piston hafifçe basıldığında gibi çözüm kılcal ucundan akar sağlamak. NOT: Herhangi bir hava kabarcıkları kap görünür isenizIllary veya şırınga enjekte şırınga hazırlık başından itibaren tekrar edilmelidir. Enjekte tertibatında sürekli sıvı doğru enjeksiyon hacimlerini sağlamak için çok önemlidir. </li><li> Stereotaktik mikromanipülatör koluna tamamlanmış şırınga enjekte takın. Bu tamamlanmış cihaz doldurulmuş gerek önce 15-20 hayvan enjekte mümkün olacak. </li><li> Astar şırınga kalan lisolesitin atın. Çekiniz ve izopropil alkol birkaç kez basın ve metal göbek iğne ayırın. Tekrar doldurmadan önce buharlaşması hazırlama şırınga kalan izopropil alkol birkaç saat bekleyin. </li></ol> 2. Cerrahi Prosedür için Hayvan hazırlayın NOT: Bu prosedür dişi C57BL / 6 fareleri, yaş 8-10 hafta için bir işlem açıklanmaktadır. <ol><li> Ketamin (200 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) ya da kurumsal hayvan bakım düzenlemelerine göre bir intraperitonal enjeksiyon ile hayvan anestezisi. PlanıEnjekte anestezi kullanıyorsanız hayvan yaklaşık 1 saat anestezi altında olmak. </li><li> Hayvan derinden sıkıca ayak kısma anestezi olduğunu test edin. Düzgün anestezi hayvan tutam yanıt vermez. </li><li> Makası kullanarak, kulağına yakın hayvanın, dorsal tarafında 2-3 cm 2 alan tıraş. Kulakları zarar vermemek için dikkatli olun. </li><li> Bir gazlı bez uygulanan% 70 etanol ile temiz alana silin. Tüm kırpılmış saç alanından kaldırıldı emin olun. Iyot ile bölgeyi dezenfekte edin. </li><li> Prosedür boyunca kurumasını önlemek için gözlere vazelin uygulayın. </li><li> Prosedürü başlatmak için hazır olana kadar ısıtılmış bir kurtarma odasında hayvan tutun. </li></ol> 3. Cerrahi Prosedürü gerçekleştirin NOT: prosedürünün tüm adımlar için yeterli aseptik tekniğini emin olun. Bu eldiven, hairnets, maskeler ve perdeler doğru kullanımını içerir. Tüm araçlar temas bilgilerini gelmeden önce sterilize edilmelidirhayvan ile t. <ol><li> Bir stereotaktik çerçeve ile hayvan taşımak, dorsal yüzü yukarı, omurga eğriliği abartmak katlanmış kağıt havlu ile orta bölümünde yüksek. Cerrahi bant ile silah ve kuyruk sabitleyin ve bir diş kelepçe ile baş sabitleyin. Dengeleyici kulak çubukları, bu işlem için gerekli değildir. </li><li> Kulakların hemen altındaki başlayan ve kaudal yönde kesim, 3 cm&#39;lik orta hat kesi yapmak için bir neşter kullanın. </li><li> 2 büyük yağ yapıları arasındaki bölünmeyi bulun ve bu ayrı çekmek için her el ince forseps kullanabilir. Cerrahi alan açmak için Ekartörleri yayıldı. </li><li> Bir cerrahi mikroskop altında, T2 vertebra belirgin sonucudur sürecini bulun (Not: Bu özellik C57BL / 6 fare zorlanma karakteristik). Daha T2 görselleştirmek için üstlerinde kas yoluyla kapalı yaylı makas ile künt diseksiyon gerçekleştirin. Forseps kullanarak, uygun anatomik konumu onaylamak için T3 ve T4 sert yüzeyler için üzülüyorum. </li><li> Yaylı makas kullanarak, T3 ve T4 arasındaki bağ dokusu (2-3 mm derinliğinde) sığ yan keser. Nedeniyle fare omurga kolonunun üst göğüs kısmı da omur arasındaki doğal aralık için, laminektomi omurilik ortaya çıkarmak için gerekli değildir. Çok derin bir kesik delmek ve kablosuna zarar edeceği dikkatli olun. NOT: kanama küçük bir derecede bu aşaması esnasında yaygındır. Bu durum ortaya çıkarsa, kanama Subsidies (30-60 sn) kadar alana bir sünger mızrak tutun. </li><li> Omuriliği gözünüzde canlandırın. Kablosunu teşhir ederken bu meningeal tabaka henüz kesilmiş değil eğer görünür dura kalın bir tabaka ile kaplı olacaktır. Tanınmış bir kan damarı omurilik yaklaşık orta hat boyunca kaudal / rostral çalışır. NOT: Bu damar orta hatta bir işareti olarak kullanılmamalıdır. Bunun yerine, yeterli aydınlatma dorsal sütun yan gri-beyaz cevher sınırlarını açığa çıkarmalıdır ve bu orta hat tahmin için kullanılmalıdır. </li><li> Dura Eğertemizlenene kadar bozulmadan kalır, bir 32 G, metal iğne ile nazik yanal scrapes yapmak. amaç olarak kalın ve görmek zor değildir kalan temel meninksler, kesim olmasa da dura kaldırmaktır. NOT: beyin omurilik sıvısının Yayın araknoid ihlal gösterir ve bu dokuya mekanik zarar vermeden oluşabilir ise, birikmiş beyin omurilik sıvısı daha kord yüzeyini görselleştirmek için bir sünger mızrak ile çıkarılmalıdır. </li><li> Yerinde şırınga enjekte ettirin ve kılcal ucu zar zor orta hat her iki tarafında hemen yan omuriliği dokunana kadar yavaşça indirin. Yerinde kolu kilitleyin. </li><li> Bir temel pozisyon ölçümü yapmak için Z-yönü stereotaktik kol kademeli ölçümleri kullanın. Bu okuma, 1.3 mm çıkarmak. Doku delmek için hızlı ve sığ aşağı hareket kullanın ve yeni ölçüm ulaşılana kadar sonra dikkatlice kılcal indirin. İsteğe bağlı: istenirse,Dorsal sütununda lezyonlar orta hatta aynı delme hareketi ve 0.3 mm (Daha fazla bilgi için tartışmaya bakınız) bir derinliğe göre üretilebilir. NOT: Bu değerler T3 ve T4 arasında enjekte etmek için özeldir. Omurilik herhangi bir başka yerde enjeksiyon yapmak için tercih, bu değerler mevcut herhangi bir fare beyin atlas elde edilmesi gerekmektedir. </li><li> Ventral spinal kord beyaz cevher içine lisolesitin bastırmak için mikromanipülatör kullanın. 0.5 ul nihai hacim içinde elde edilen, 2 dakika boyunca mikromanipülatör 1 rotasyonu, her 5 saniye olun. Çözeltinin geri akmasını önlemek için 2 ek dakika yerinde kılcal bırakın, ve daha sonra dikkatlice kılcal çıkarın. </li><li> Omuriliğe kaplanacağı kas / yağ dokusunda tek sütür kravat. Cildi kapatmak için olmayan bir kesintiye dikiş kullanın. Kesi daha fazla iyot uygulayın. </li><li> O iyileşene kadar, daha sonra kendi kafesine geri ısıtılmış kurtarma odasında hayvan yerleştirin. Analjezikler uygulayın sonrasıAmeliyat kurumsal hayvan bakım düzenlemelerine göre. Hayvanlar kısa sürede anestezi onlar kurtarma tam olarak ayaktan ve kendini besleme ve içme yeteneğine sahip gibi ek post-operatif bakım genellikle gerekli değildir. </li><li> Kalan hayvanlar için prosedürü tekrarlayın. NOT: yeterlilik ile operasyon, özellikle sütür bağlama İkinci bir kişinin yardımıyla, hayvan başına 10-15 dakika içinde tamamlanabilir. ucu künt hale gelir ve değiştirilmesi gerektiğini önce aynı cam kılcal yaklaşık 15-20 ameliyatları için kullanılabilir. Yerine lizolesitin ve omuriliğe PBS enjeksiyonu ile, tarif edildiği gibi kontrol ameliyatları eşit yapılabilir. Biz ileride kullanmak üzere kılcal temizleme tavsiye etmiyoruz. </li></ol> 4. Doku İşleme ve Analiz <ol><li> İstenen zaman noktalarında ketamin (500 mg / kg) ve ksilazin (25 mg / kg) intraperitoneal doz aşımı ile hayvanlar kurban. Lezyonlar genellikle foll içinde gelişmeyenedeniyle şekilde: 1-3 gün, aktif demiyelinizasyon; 3-7 gün, OPC işe; 7-10 gün, oligodendrosit farklılaşması; 10-21 gün aktif remiyelinizasyon 2,10,11. </li><li> Ilk önce PBS içinde 20 ml buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid ile ve ardından 20 ml RT PBS ile transcardial perfüzyon 12 yerine, histoloji için doku hazırlanması. Yarı veya ultra ince kesit için reçine gömülü doku hazırlanması için, adım 4.9 bkz. </li><li> Her omurların omurganın servikal sonunda başlayan ve alt torakal seviyesine kadar çalışarak kesmek için kavisli kemik makas kullanarak omurilik çıkarın. 4 ° C&#39;de PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde omurilik O / N Düzelt. En az 72 saat için 4 ° C&#39;de PBS içinde% 30 sakaroza kablolarını geçin. </li><li> Omurilik dorsal yüzeyinde bir anormallik olarak enjeksiyon sitesini tanımlamak. (Merkezde enjeksiyon yerinde) ile doku 3 mm parça kesin ve optimal kesim sıcaklığının içeren cryomolds (Ekim) co parçaları hizalayınmpound. Ekim tamamen donmuş kadar 2-metilbütan ve kuru buz içinde soğutulmuş bir karışımı içinde cryomolds alt kısmını süspanse edin. Bölümüne kadar hazır -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Mikroskop lamı üzerine 20 mikron genişliğinde bölüm kriostat spinal kablolarını ve hava kuru O izin / N -20 ° C&#39;de slaytlar saklamadan önce. </li><li> Miyelin 13 bir eriochrome Siyanin histolojik leke kullanılarak lezyon yerini ve boyutunu algılar. Oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın. 30 dakika için Hava kuru slaytlar. 1 dakika her biri için sınıflandırılmış etanol Çözeltilerin rehidrasyondan sonra 1 dakika boyunca (100,% 95,% 90,% 70,% 50,% su) ajan temizleme yeri kayar. <ol><li> Su ile, 1 dakika yıkama ve ardından 15 dakika boyunca eriochrome siyanin çözelti içinde yer kaymaktadır. Su ile, 1 dakika yıkama, ardından 10 saniye boyunca% 0.5 amonyum hidroksit ayırır. Parlak alan mi 1 dakika montaj ortamı, her biri lamel ve görüntü için (yukarıda tarif edildiği gibi ters sırada) dereceli etanol Çözeltilerin kurutmakmikroskop. </li></ol></li><li> Akson ve miyelin görselleştirmek için immunohistokimyasal kullanın. 30 dakika için Hava kuru slaytlar. Oda sıcaklığında 2 dakika her biri için kademeli etanol (su,% 50,% 70,% 90,% 95,% 100) ile kurutmak, daha sonra tekrar su kelimelerinin sırasını tersine çevirebilir. Bu adım, bireysel miyelin halkaları 14 daha fazla çözünürlük ile sonuçlanır. <ol><li> Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca PBS içinde% 10 keçi serumu ve% 0.25 Triton X-100 kullanarak, spesifik olmayan antikor etkileşimi bloke eder. PBS ile 4 ° C sıcaklıkta / O slaytlar üzerinde N inkübe birincil antikor (1000: 2000, tavşan anti-MBP 1 fare anti-SMI312 1) ile seyreltilir. </li><li> Oda sıcaklığında PBS ile 5 dakika için 5 kez yıkayın. PBS içinde ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca slaytlar üzerinde inkübe sekonder antikor (500: 500, Alexa 546, anti-fare 1 Alexa 488 anti-tavşan 1) ile seyreltilir. Oda sıcaklığında PBS ile 5 dakika için 5 kez yıkayın. Dağı bir floresan mikroskop GELVATOL ve görüntü kullanılarak lamelleri ile slaytlar. </li></ol></li><li> Oligodendrosit soy hücreleri görselleştirmek için immunohistokimyasal kullanın. St için prosedürü izleyinep 4.7, dehidratasyon / rehidrasyon adım atlama, ve% 10 at serumu yerine keçi serumu kullanarak. Aşağıdaki primer antikor seyreltileri kullanarak: keçi anti-PDGFRα 1: 100, fare anti-CC1 1: 200, tavşan anti-Olig2 1: 200. Alexa 488 anti-keçi 1: 500, Alexa 594 anti-fare 1: 500, Alexa 647 anti-tavşan 1: 500 Aşağıdaki ikincil antikor dilüsyonları kullanın. </li><li> Ilk önce PBS içinde 20 ml buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid /% 1 glutaraldehid, ardından 20 mi RT PBS ile transcardial perfüzyon 12 yerine, yarı veya ultra-ince kesit için doku hazırlanması. Adım 4.3&#39;de tarif edildiği gibi omuriliğin çıkarın. 4 ° C&#39;de PBS içinde O / N% 4 paraformaldehid /% 1 glutaraldehit düzeltildi. </li><li> Adım 4.4 açıklandığı gibi enjeksiyon sitesini tanımlamak. Enjeksiyon bölgesi içeren doku, 1 mm&#39;lik bir parça kesin. Arzu edildiği takdirde, lezyonun her iki tarafında ek 1 mm&#39;lik blokları ile hazırlanabilir. </li><li> Bir çeker ocak içinde, buz üzerinde, her blok 10 kat hacim% 1 ozmiyum tetroksit /% 1.5 potasyum ferrosiyanür eklemek60 dakika karıştırıldı. NOT: osmiyum tetroksit son derece zehirli bir maddedir ve aşırı dikkatle ele alınmalıdır. Ozmiyum tetroksit ile temas eden her türlü malzemenin nötrleştirme için mısır yağı (ozmiyum tetroksit çözeltisi olarak iki hacim) yerleştirilmelidir. </li><li> Mısır yağı içinde atarak, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0.2 M kakodilat kordon 3 kez yıkayın. Dereceli etanol solüsyonları (suda,% 50,% 70,% 90,% 95, 2 kat,% 100 ile 2 kez, propilen oksit ile 2 kez) ile oda sıcaklığında 10 dakika boyunca birlikte dihidrat. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre reçine embed kordonlar. </li><li> Bir ultramicrotome blokları kesin ve mikroskop slaytlar üzerinde su damlacıkları üzerine bölümleri monte edin. Kuru kadar sıcak bir plaka (yaklaşık 50 ° C) yerleştirin kayar. </li><li> 50 ° C&#39;de 10-15 saniye boyunca slaytlar üzerine mavi,% 1 toluidin /% 2 boraks solüsyonu ve bir kaç damla eklenerek miyelin görselleştirmek. Montaj medya ile su, kuru, ve lamel ile durulayın. Parlak alan mikroskobu Görüntü bölümleri. </li></ol>

<ol>
	<li>Blakemore, W. F., Eames, R. A., Smith, K. J., McDonald, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+in+the+spinal+cord+of+the+cat+following+intraspinal+injections+of+lysolecithin.">Remyelination in the spinal cord of the cat following intraspinal injections of lysolecithin.</a> J. Neurol. Sci. 33 (1-3), 31-43 (1977).</li><li>Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+of+mouse+spinal+cord+axons+demyelinated+by+local+injection+of+lysolecithin.">Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin.</a> J. Neurocytol. 24 (10), 775-781 (1995).</li><li>Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+Schwann-cells+into+the+spinal-cord+of+rat+following+local+injections+of+lysolecithin.">Invasion of Schwann-cells into the spinal-cord of rat following local injections of lysolecithin.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2 (1), 21-39 (1976).</li><li>Shields, S. A., Gilson, J. M., Blakemore, W. F., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+occurs+as+extensively+but+more+slowly+in+old+rats+compared+to+young+rats+following+gliotoxin-induced+CNS+demyelination.">Remyelination occurs as extensively but more slowly in old rats compared to young rats following gliotoxin-induced CNS demyelination.</a> Glia. 28 (1), 77-83 (1999).</li><li>Patrikios, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+is+extensive+in+a+subset+of+multiple+sclerosis+patients.">Remyelination is extensive in a subset of multiple sclerosis patients.</a> Brain. 129 (Pt 12), 3165-3172 (2006).</li><li>Keough, M. B., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+therapy+for+multiple+sclerosis).">Remyelination therapy for multiple sclerosis).</a> Neurotherapeutics. 10 (1), 44-54 (2013).</li><li>Hall, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+injections+of+lysophosphatidyl+choline+into+white+matter+of+the+adult+mouse+spinal+cord.">The effect of injections of lysophosphatidyl choline into white matter of the adult mouse spinal cord.</a> J. Cell Sci. 10 (2), 535-546 (1972).</li><li>Miron, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+microglia+and+macrophages+drive+oligodendrocyte+differentiation+during+CNS+remyelination.">M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination.</a> Nat. Neurosci. 16 (9), 1211-1218 (2013).</li><li>Kotter, M. R., Setzu, A., Sim, F. J., Van Rooijen, N., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+impairs+oligodendrocyte+remyelination+following+lysolecithin-induced+demyelination.">Macrophage depletion impairs oligodendrocyte remyelination following lysolecithin-induced demyelination.</a> Glia. 35 (3), 202-212 (2001).</li><li>Lau, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+sulfate+proteoglycans+in+demyelinated+lesions+impair+remyelination.">Chondroitin sulfate proteoglycans in demyelinated lesions impair remyelination.</a> Ann. Neurol. 72 (3), 419-432 (2012).</li><li>Fancy, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+the+Wnt+pathway+inhibits+timely+myelination+and+remyelination+in+the+mammalian+CNS.">Dysregulation of the Wnt pathway inhibits timely myelination and remyelination in the mammalian CNS.</a> Genes Dev. 23 (13), 1571-1585 (2009).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li><li>Skihar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+oligodendrogenesis+and+myelin+repair+using+the+multiple+sclerosis+medication+glatiramer+acetate.">Promoting oligodendrogenesis and myelin repair using the multiple sclerosis medication glatiramer acetate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17992-17997 (2009).</li><li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-derived+growth+factor-responsive+neural+precursors+give+rise+to+myelinating+oligodendrocytes+after+transplantation+into+the+spinal+cords+of+contused+rats+and+dysmyelinated+mice.">Platelet-derived growth factor-responsive neural precursors give rise to myelinating oligodendrocytes after transplantation into the spinal cords of contused rats and dysmyelinated mice.</a> Glia. 59 (12), 1891-1910 (2011).</li><li>Chong, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurite+outgrowth+inhibitor+Nogo-A+establishes+spatial+segregation+and+extent+of+oligodendrocyte+myelination.">Neurite outgrowth inhibitor Nogo-A establishes spatial segregation and extent of oligodendrocyte myelination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (4), 1299-1304 (2012).</li><li>Sturrock, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+mouse+corpus+callosum.">Myelination of the mouse corpus callosum.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 6 (6), 415-420 (1980).</li><li>Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+dynamics+in+the+healthy+adult+CNS:+evidence+for+myelin+remodeling.">Oligodendrocyte dynamics in the healthy adult CNS: evidence for myelin remodeling.</a> Neuron. 77 (5), 873-885 (2013).</li><li>Woodruff, R. H., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demyelination+and+remyelination+of+the+caudal+cerebellar+peduncle+of+adult+rats+following+stereotaxic+injections+of+lysolecithin,+ethidium+bromide,+and+complement/anti-galactocerebroside:+a+comparative+study.">Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats following stereotaxic injections of lysolecithin, ethidium bromide, and complement/anti-galactocerebroside: a comparative study.</a> Glia. 25 (3), 216-228 (1999).</li><li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropillar+assays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis.">Micropillar assays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nat. Med. 20 (8), 954-960 (2014).</li><li>Powers, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination+reporter+reveals+prolonged+refinement+of+spontaneously+regenerated+myelin.">Remyelination reporter reveals prolonged refinement of spontaneously regenerated myelin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 4075-4080 (2013).</li><li>Smith, K. J., Blakemore, W. F., McDonald, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+remyelination+restores+secure+conduction.">Central remyelination restores secure conduction.</a> Nature. 280 (5721), 395-396 (1979).</li><li>Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+deficits+induced+by+experimental+spinal+cord+demyelination+are+abolished+by+spontaneous+remyelination.">Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination.</a> Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).</li><li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery.">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hayvan modellerinde çok sayıda MS, en tanınabilir deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modeli üzerinde geliştirilmiştir. EAE olarak, kemirgenler, bir miyelin peptid bir parçası aşısı ve artan felç tezahür inflamatuar lezyon gelişimini tabi olan. Yarı veya ultra ince için doku işlerken Öncelikle, inflamatuar lezyonların yeri biraz rastgele ve lezyon yerini: Bu model, bağışıklık MS ilaçların klinik öncesi testler için yararlı olsa da, bu üç ana nedenden dolayı yeniden miyelin oluşumunu incelemek için ideal değildir bölümler zor olabilir. İkinci remiyelinizasyon belirli bir zaman boyunca oluşur ve tek bir EAE lezyonun kesin yaşı sürekli non-invaziv manyetik rezonans görüntüleme olmadan bilinen edilemez olduğunu. Üçüncü remiyelinizasyon ilacın birincil sonucu olmayabilir EAE ilaç tedavisi sonrasında doğal olarak oluşan kemirgenler fenomen ve remiyelinizasyon kanıt olduğunu, amainflamasyonu azaltarak bir ikincil fenomen yerine. Demiyelinasyon üretilmesi için bir başka genel yöntem diyet bakır kenetleyici cuprizone sokulması ile elde edilir. Bu özellikle korpus kallosum olarak, yaygın demiyelinizasyon sonuçlanır. Öncelikle, akson çapları (ve dolayısıyla miyelin kalınlığı) Diğer MSS bölgelere göre daha küçüktür ve bu nedenle ince remyelinated kılıflar demiyelinize asla olduğunu ayırt edilemez olabilir: Aşağıdaki nedenlerden dolayı remiyelinizasyon bir site olarak korpus kallosum okuyan sınırlamalar vardır. Fare korpus kallosum&gt;% 70 miyelinsiz aksonlar 16 içerdiğinden İkincisi, bir remyelinated bölüm 17 normal meydana yetişkin, hasarlı miyelin veya de novo sentezi miyelin gerçek onarım olup olmadığı belirsiz olabilir. Bu yeniden miyelin oluşumunu incelemek için en iyi model toksinlerin direkt enjeksiyon, ya lisolesitin, ethid olduğunu, bizim inanç olduğunukaudal serebral peduncles 18 veya spinal kord beyaz cevher içine iyum bromür, ya da diğerleri. önceki konum sadece hassas 3 boyutlu stereotaktik enjeksiyon ile elde edilir, ve bağlı serebellar pedinküllerin küçük boyutuna göre daha büyük kemirgenlerde (sıçan) ile sınırlıdır. Bu De- ve yeniden miyelin oluşumunu okuyan transgenik farelerin geniş kaynak dışlar. Spinal kord, ancak, kolay erişilebilir cerrahi birçok büyük beyaz cevher yolları içerir. Rostral torakal segmentte omurları arasındaki alanlarda kaudal torakal cerrahi prosedürlerde gerekli bir adımdır bir laminektomi, gerek kalmadan omuriliğin maruz sağlar. Özellikle ventral beyaz maddeyi hedef bir avantajı aksonlar remiyelinizasyon ölçümü yaparak, dorsal beyaz cevher daha eşit daha büyük olduğunu daha az belirsiz görev benzer korpus kallosum ile ilişkili zorluklar. Ayrıca, ventral beyaz madde çok daha büyük bir t yaparenjekte alanı HEDEF; Aynı sapma ventral hala önemli bir demiyelinizan lezyon üretecektir ise yanal sırt bölgesinde birkaç yüz mikron, sütunun dışında kılcal yer olacaktır. Bazı protokoller dorsal ve aynı hayvan 19 ventral sütunlar hem içine enjekte lisolesitin. Bu doğru kılcal yerleştirme olasılığını ve daha az hayvanlarda ölçülebilir lezyonların sayısını hem de artırabilir. Sunulan mevcut veri işlem sırasında 8-10 haftalık hayvanlardan iken, biz de remiyelinizasyon 4 belirgin yavaş olarak açıklanan 8-10 aylık fareler, aynı prosedürü kullanarak başarı vardı. Remiyelinizasyon Niceliklendirilmesi önemsiz bir girişim değildir. Bir santral dogma remyelinated kesimleri sağlıklı muadillerine göre ortalama uzunluğu kısa ve incedir ve kesit yarı o böylece g-oranı hesaplamaları (akson çapı akson + miyelin çapı bölü) olduğunu öne sürenr ince kesitler standart prosedür haline gelmiştir. Ancak, remyelinated segmentler zaman üzerinde 2 kalınlaştırmak ve remiyelinizan oligodendrositlerin bir transgenik muhabiri kullanarak yeni bir çalışma, birçok internod sonunda kontrol 20 ayırt edilemez hale düşündürmektedir bilinmektedir. Lezyon içindeki olgun oligodendrositlerin sayısı belirleme oligodendrositler internod geniş sayıda yapabilen gibi, onarım ölçmek için dolaylı bir yoldur ve remiyelinizasyon-bağlı modeline önemli bir bölümü kullanılmış olabilir Schwann hücrelerinin 3 den oluşur. Remiyelinizasyon saltatory iletim 21 restorasyonu ile bağlantılı olduğu gibi tabii ki, onarım nihai metrik nörolojik defisit fonksiyonel iyileşme olacaktır. Remiyelinizasyon bazı türlerde 22,23 fonksiyonun geri kazanım ile ilişkilendirilmiştir edilmiş olmakla beraber, bu sıçangil lisolesitin çalışmalarda standart bir prosedür olmamıştır. Bu durum, açık Gözlem eksikliğinden dolayı büyük olasılıklaBöyle EAE ve hatta cuprizone olarak daha sağlam demiyelinizasyon modelleri ile karşılaştırıldığında dorsal veya ventral ya lezyonlardan mümkün açıkları. Biz remiyelinizasyon ile enjeksiyon, ve sonraki kurtarma lisolesitin kaynaklanan fonksiyonel açıkları, sadece ince Sensorimotor işleyişi hassas testler kullanılarak gözlemlenebilir olacağına inanıyoruz. Bir kaba metodolojik bir yaklaşım olsa, yukarıda sıralanan hayvan modellerinde iki yanında &quot;remiyelinizasyon&quot; A PubMed arama, EAE (188) ve cuprizone (197) ile karşılaştırıldığında (109) lisolesitin için daha az arama hit gösterir. Demiyelinizasyonu lisolesitin yeniden miyelin oluşumunu incelemek için üstün bir yaklaşım olduğunu, bizim argüman, neden ise en az tartışılan? Belki de bu yöntemi kullanarak bir yakalama cerrahi işlemi gerçekleştirmek teknik zorluk, bir inanç kaynaklanmaktadır. Aslında, bu prosedür tüm, Ticaret malzemeleri gerektiren, hızlı, uygun maliyetli ve hiçbir rutin doku diseksiyonu daha zorolarak mevcut. Bu protokol miyelin onarım heyecanlı ve genişleyen alanı çalışmak için kendi repertuarına bu güçlü modeli eklemek istediğiniz olanlar için yararlıdır kanıtlıyor bizim umudumuz.

Multipl skleroz (MS) bağışıklık hücre infiltrasyonu ve kayıp miyelin, oligodendrositlerin, akson ve nöron içeren plaklar ile karakterize santral sinir sistemi (MSS) kronik demiyelinizan hastalığıdır. Çoğu hasta remisyon dönemleri takip nörolojik semptomlar geniş bir yelpazede eşliğinde inflamatuar nüks oluşan bir hastalık kursu var. Bu hastaların yarısından fazlası sonunda hiçbir belirgin nüks ama sürekli nörolojik düşüş ile ikincil ilerleyici aşamaya geçiş. Bu ilerici bozulma aksonal hasar ve kayıp nedeniyle olduğuna inanılmaktadır, kronik demiyelinizasyon kısmen katkıda bulunmuştur. Kayıp miyelin geri Stratejileri ve böylece hastalığın ilerlemesini geciktirmek ve belki de nörolojik belirtiler tersine çevirmek için umut verici bir tedavi yaklaşımı olarak kabul edilir. Remiyelinizasyon yeni miyelin kılıflar işe oligodendrosit öncü hücreler oluşturulur sayede MSS bir endojen onarım yanıtıMiyelin oluşturucu oligodendrositler ayırt (OPC). Remiyelinizasyon 1-3 Ancak, verimlilik 4 yaş ile birlikte azalan oldukça sağlam olması, hayvan modellerinde gösterilmiştir. MS hastalarında 5 çoğunda eksik olmasına rağmen Gerçekten de, remiyelinizasyon insanlarda görülür. MS için tüm mevcut ilaçlar öncelikle nüksleri azaltmada etkili olurken, belirgin hastalığın ilerlemesini gecikme yok, hastalığın anormal immün bileşenini hedef ve. MS tedavisi için tedavi stratejilerinin gelecek nesil ve tekerrür ilerlemesini 6 hem de önlemek için endojen remiyelinizasyon donanımıyla immünomodülasyonu gelişmeleri entegre edecek. Bir yöntem de- çalışma ve MSS remiyelinizasyon omurilik beyaz cevher 1,3,7 içine deterjan lisofosfatidilkolin (lisolesitin) doğrudan enjeksiyon içerir. Bu prosedür iyi karakterize demyelinat üretiryaralanma esas makrofaj / mikrogliyal infiltrasyonu ve aktivasyonu 8,9, reaktif astrogliyozun, aksonal homeostasis / aksonal yaralanma, ve OPC çoğalması ve göç 10 pertürbasyonuna oluşan ing. lezyon tahmin edilebileceği bir kaç hafta süre içinde geliştikçe ve tam remiyelinizan nihayetinde yeteneğine sahiptir. Bu yöntem de- ve remiyelinizasyon katılan olayların koreografisini eğitim özellikle yararlı olmuştur. Ayrıca, bir demiyelinizan hakaret aşağıdaki onarım hızlandırmak için aday tedavilerinin klinik öncesi testler için bir araç olarak kabul edilmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:239px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">spring scissors</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">retractor</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">17003-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">clippers</td>
			<td style="width:199px;">Philips</td>
			<td style="width:163px;">QG3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heating recovery chamber</td>
			<td style="width:199px;">Peco Services</td>
			<td style="width:163px;">V1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">surgical tape</td>
			<td style="width:199px;">3M</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scalpel handle</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scalpel blade</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td>No. 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sponge spear</td>
			<td style="width:199px;">Beaver Visitec</td>
			<td>581089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 Vicryl sutures</td>
			<td style="width:199px;">Ethicon</td>
			<td>J511G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">curved ToughCut spring scissors</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15123-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">32 gauge metal needle</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">needle holders</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">angled forceps</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:199px;">Puritan</td>
			<td style="width:163px;">806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gauze pads</td>
			<td style="width:199px;">Safe Cross First Aid</td>
			<td style="width:163px;">3763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">10 &#956;L syringe</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">7635-01</td>
			<td style="width:239px;">make sure to purchase the microliter, not gastight syringe</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">compression fitting</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">55750-01</td>
			<td style="width:239px;">contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 &#956;L syringe is a tighter fit</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">priming kit</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">PRMKIT</td>
			<td style="width:239px;">contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">pre-pulled glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">WPI</td>
			<td style="width:163px;">TIP10TW1 (pack of 10)</td>
			<td style="width:239px;">contains capillaries with 10 &#956;m inner diameter. 30 &#956;m inner diameter also work (TIP30TW1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stereotactic frame</td>
			<td style="width:199px;">David Kopf instruments</td>
			<td style="width:163px;">Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td style="width:199px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Tissue-Tek intermediate cryomold</td>
			<td style="width:199px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">25608-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bright field microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultramicrotome</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysophosphatidylchoine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">L1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-methylbutane</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-SMI312 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Covance</td>
			<td style="width:163px;">SMI-312R</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-MBP antibody</td>
			<td style="width:199px;">Abcam</td>
			<td style="width:163px;">AB40390</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-PDGFR&#945; antibody</td>
			<td style="width:199px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:163px;">AF1062</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-Olig2 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:163px;">AB9610</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-CC1 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:163px;">OP80</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:199px;">Life technologies</td>
			<td style="width:163px;">A-11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:199px;">Life technologies</td>
			<td style="width:163px;">A-11003</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">705-546-147</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">715-586-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">711-606-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ketamine</td>
			<td>CDMV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">xylazine</td>
			<td>CDMV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iodine</td>
			<td>West Penetone</td>
			<td>2021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vaseline petroleum jelly</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA05971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eriochrome Cyanine R</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iron(III) chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ammonium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acrytol</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3801700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrisolv</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-143-975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">osmum tetroxide</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td>highly toxic</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cacodylic acid</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">propylene oxide</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>20401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMBED kit</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eriochrome cyanine solution</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ingredient</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Amount to add</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eriochrome Cyanine R</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">0.8 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">400 mL 0.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iron(III)chloride</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">20 mL 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">80 mL</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:216px;">*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year.</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelvatol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ingredient</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Amount to add</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>140 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>40 g</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">*mix well, place at&#160; 37 &#176;C overnight, centrifuge at 1960xg 30 min, aliquot into 40 tubes</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental demyelination and remyelination of murine spinal cord by focal injection of lysolecithin

Multipl skleroz kayıp oligodendrositlerin, miyelin, aksonlar ve nöron içeren plak oluşumu ile karakterize edilen merkezi sinir sisteminin enflamatuvar demiyeline eden bir hastalıktır. Remiyelinizasyon yeni miyelin miyelin oluşturan oligodentrositlere çoğalması, işe alım ve oligodendrosit öncü hücrelerin farklılaşması sonra üretileceği bir endojen onarım mekanizması, ve daha fazla hasara gelen aksonlar korumak için gereklidir. Şu anda, multipl skleroz tedavisi için tüm terapötik inflamatuar relaps azaltır ama geri dönüşümsüz nörolojik düşüş ilerlemesini engellemez hastalığın anormal bağışıklık bileşeni, hedef. Bu remiyelinizasyon-teşvik stratejileri hastalığın ilerlemesini geciktirmek ve belki de nörolojik belirtiler ters olabilir geliştirilmesi bu nedenle zorunludur. Demiyelinizasyonun Çeşitli hayvan modelleri deneysel otoimmün ensefalomyelit ve curprizone dahil, mevcut; Bununla birlikte, Limi vardıryeniden miyelin oluşumunu çalışmak için bunların kullanımı kabili. Bir daha sağlam bir yaklaşım kemirgenler omurilik beyaz madde içine deterjan lizolesitin dahil merkezi sinir sistemi içine toksin enjeksiyonu fokal vardır. Bu protokol, farelerde ventral beyaz madde içine enjekte lisolesitin dahil cerrahi işlem hızlı, maliyet-etkin ve piyasada mevcut olan daha ek malzeme gerektirir göstermektedir. Bu prosedür, aynı zamanda, aday remiyelinizasyon destekleyici terapötik taranması için bir ön-klinik bir araç olarak sadece remiyelinizasyon sürecinde yer alan, normal olayları incelemek için önemlidir.

Ventral beyaz cevher içine lisolesitin Odak enjeksiyonu yaklaşık 3 mm (Şekil 2) bir mesafe üzerinde saptanabilen bir ayrık demiyelinizan lezyon üretir. Lezyon miyelin için çekirdek (MBP) ve akson (SMI312) immünohistokimyasal boyama 7 gün (Şekil 3) de miyelin elimden edilmiş aksonlar gösterir. 14 gün, birçok aksonlar remiyelinizasyon oluşumunu göstermektedir MBP-pozitif halkalar ile çevrilidir. Oligodendrosit soy (PDGFRα, Olig2, CC1) hücreler için boyama, 7 gün, hem de OPC kıyasla olgun oligodendrosit dağılımı ile karşılaştırıldığında 14 gün hücrelerin toplam sayısı açısından önemli bir artış (Şekil 4) . Buna paralel olarak, toluidin mavisi ile lekelenmiş de yarı ince kesitler, bu i remyelinated belirten nadiren 7 gün sonra (Şekil 5) tespit edilir 14. günlerde ince miyelin kılıflarının varlığını ortaya çıkarmaknternodes. Prosedür hayvanlar arasındaki yüksek tekrarlanabilir. Ağır solunum durağan konumunu değiştirir zaman varyasyon meydana kılcal-bu genellikle yeterli sedasyon ile ilgili bir sorun değil. Akson hasar modeli 1 erken kullanımı beri tarif edilmiştir lezyon, çok merkezi hariç, en az olduğu görülmektedir. Biz PBS kontrolleri enjekte da gözlemlenebilir olduğu gibi bu, cam kapiller gelen mekanik yaralanma olduğuna inanıyorum. Bununla birlikte, değişkenlik, küçük olma eğilimindedir, ve ve benzer bir prosedür kullanılarak, diğerleri grup başına 15 4 kadar az hayvan deney koşulları arasındaki farklar tespit ettik. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52679/52679fig1.jpg" /> Enjekte şırınga Şekil 1. Meclis. (A) enjekte şırınga somun t üzerine dişli<html> onların çiftleşme kilidi biter 2 ferüle böyle izledi cam kılcal düz uç. Kılcal sıkıca konik yüksük içinde rahat sonra, montaj sıkı enjekte şırınga ucuna elini vidalanır. (B) astar şırınga bağlı metal göbek iğne ile lastik diskin merkezi Piece ve aşağı doğru kaydırın Baz. (C) emişli şırınga içine çözüm lisolesitin çekin. (D) yavaşça lizolesitin ilk damla iğne ucu görünür kadar. (E) hazırlama şırınga basınız enjekte varil içine astar şırınga yerleştirin kauçuk disk ile bir firma mühür, şırınga. Bu kılcal sonuna kadar bitene kadar yavaşça çözüm basın. Enjekte şırınga içine hava kabarcıkları tanıtan olmadan metal göbek iğneyi çıkarmak için piston üzerindeki baskıyı korurken dikkatlice hazırlama şırınga çekme./ 52.679 / 52679fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;upload&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52679/52679fig2.jpg" /> Eriochrome cyanine ile lekelenmiş lezyon lisolesitin Şekil 2. Örnek. Seri kesitler eriochrome cyanine ile boyanmış 14 gün değerinde bir karakteristik lisolesitin lezyon (400 um aralıklı) miyelin (mavi) görselleştirmek için. Bu demiyelinizasyon ventral beyaz cevher ile sınırlıdır Not ve lezyon rostral / kaudal yönde yaklaşık 3 mm açıklıklı söyledi. Ölçek çubuğu = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52679/52679fig3.jpg" /> Şekil 3. Aksonlar ve miyelin içindelisolesitin modeli. (A) sahte (PBS) 7 gün omuriliği enjekte miyelin halkalarla çevrelenmiş sağlıklı aksonlar göstermektedir. 7 gün lezyon bozulmuş miyelin yanı sıra aksonlar soyulmuş gösterir lisolesitin (B). (C) 14 gün sonra, bir akson (beyaz ok başları ile gösterilen örnekler) oranı miyelin halkaların yeniden ortaya çıkma ile ilişkilidir. Ölçek çubuğu = 10 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52679/52679fig4.jpg" /> Şekil lisolesitin modelinde 4. oligodendrosit kökenli hücreler. (A, C) 7 gün sonra, CC1 + oligodendrositler (kırmızı çubuklar) için daha büyük bir PDGFRα + OPC gösterimi (beyaz çubuklar) göreli vardır; barlar içinde sayıları yüzdelerini temsil ederler. Olig2 için problanmıştıroligodendrosit soy hücrelerinin boyama teyit etmektedir. (B, C) ​​14 gün sonra, var 7 gün (p &lt;0.05, iki-kuyruklu t-testi ile karşılaştırıldığında oligodendrosit soy hücrelerinin toplam sayısında belirgin bir artış olduğunu, grup başına n = 4 ). 7 gün (p &lt;0.0001, Fisher&#39;in kesin testi) göre 14 gün OPC için oligodendrositlerin dağılımında önemli bir artış vardır. Ölçek çubuğu 10 mikron =. Her alan 60X orijinal büyütme yakalanır. Değerler ortalama ± SD bulunmaktadır. * P &lt;0.05 belirtir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52679/52679fig5.jpg" /> Lisolesitin modelinde Şekil 5. remiyelinizasyon. (A) hea ventral beyaz cevher bölümüne yarı ince boyanmış bir kesit toluidin mavisilthy fare (B), 7 gün sonra., ilgili miyelin kalınlığında kalibreli, geniş bir aralıkta aksonlar gösterir miyelin kılıflarının eksikliği (sağ alt) bir etkilenmemiş alanına bitişik görülmektedir. 14 gün sonra (C) ince miyelinli kılıflar ( Kırmızı ok uçları ile gösterilir örnekler) remyelinated kesimleri gösteren lezyon boyunca görünür. Ölçek çubuğu = 10 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin at JoVE.com

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Lisolesitin Odak Enjeksiyon Deneysel Demyelizasyon ve Kemirgen Omurilik remiyelinizasyon

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

experimental-demyelination-remyelination-murine-spinal-cord-focal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.9K Görüntüleme.  Hotchkiss Brain Institute at University of Calgary. Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Video: Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Slice cultures can facilitate the manipulation of embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In this reduced system, potential lethal side effects due to systemic drug applications can be overcome. However, culture conditions must ensure that normal development proceeds within the reduced environment of the slice. We have focused on the development of the spinal cord, particularly that of spinal motor neurons. We systematically varied culture conditions of chicken embryo slices from the point at which most spinal motor neurons had been born. We assayed the number and type of motor neurons that survived during the culture period and the position of those motor neurons compared to that in vivo. We found that serum type and neurotrophic factors were required during the culture period and were able to keep motor neurons alive for at least 24 hr and allow those motor neurons to migrate to appropriate positions in the spinal cord. We present these culture conditions and the methodology of preparing the embryo slice cultures using eviscerated chicken embryos embedded in agarose and sliced using a vibratome.

Slice cultures facilitate the manipulation of embryo development by gene and pharmacological perturbations. However, culture conditions must ensure that normal development can proceed within the reduced environment of the slice. We illustrate a protocol that facilitates normal spinal cord development to proceed for at least 24 hr.

Tavuk embriyo Omurilik Dilim Kültür Protokolü

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the spinal cord, tumor resections, or tissue defects resulting from traumatic accidents can aid in facilitating general tissue repair as well as regenerative growth of nerve fibers into and beyond the affected area. Two experimental treatment strategies are presented: (1) implantation of a novel microconnector device into an acutely and completely transected thoracic rat spinal cord to readapt severed spinal cord tissue stumps, and (2) polyethylene glycol filling of the SCI site in chronically lesioned rats after scar resection. The chronic spinal cord lesion in this model is a complete spinal cord transection which was inflicted 5 weeks before treatment. Both methods have recently achieved very promising outcomes and promoted axonal regrowth, beneficial cellular invasion and functional improvements in rodent models of spinal cord injury.
The mechanical microconnector system (mMS) is a multi-channel system composed of polymethylmethacrylate (PMMA) with an outlet tubing system to apply negative pressure to the mMS lumen thus pulling the spinal cord stumps into the honeycomb-structured holes. After its implantation into the 1 mm tissue gap the tissue is sucked into the device. Furthermore, the inner walls of the mMS are microstructured for better tissue adhesion.
In the case of the chronic spinal cord injury approach, spinal cord tissue - including the scar-filled lesion area - is resected over an area of 4 mm in length. After the microsurgical scar resection the resulting cavity is filled with polyethylene glycol (PEG 600) which was found to provide an excellent substratum for cellular invasion, revascularization, axonal regeneration and even compact remyelination in vivo.

Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

Deneysel Stratejileri Akut ve Kronik Lezyon sonra Yaralı Omurilik Büyük Doku boşlukları doldurmak için

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Sinirsel aktivite Thy1kullanarak birincil somatosensor kortekste Imaging-GCaMP6s transgenik fareler

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

Pro-enflamatuar Sitokinlerin İntraserebral Enjeksiyonu ile İndüklenen Yaygın Serebral Kortikal Demiyelinasyonun Sıçan Modeli

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. Injection directly into spinal cord tissue bypasses these barriers, providing access to cell bodies or synapses where molecules can be incorporated. Combining viral vector technology with this method allows for introduction of target genes into nervous tissue for the purpose of gene therapy or tract tracing. Here a virus engineered for highly efficient retrograde transport (HiRet) is introduced at the synapses of propriospinal interneurons (PNs) to encourage specific transport to neurons in the spinal cord and brainstem nuclei. Targeting PNs takes advantage of the numerous connections they receive from motor pathways such as the rubrospinal and reticulospinal tracts, as well as their interconnection with each other throughout spinal cord segments. Representative tracing using the HiRet vector with constitutively active green fluorescent protein (GFP) shows high fidelity details of cell bodies, axons and dendritic arbors in thoracic PNs and in reticulospinal neurons in the pontine reticular formation. HiRet incorporates well into brainstem pathways and PNs but shows age dependent integration into corticospinal tract neurons. In summary, spinal cord injection using viral vectors is a suitable method for introduction of proteins of interest into neurons of targeted tracts.

This protocol demonstrates injection of a retrogradely transportable viral vector into rat spinal cord tissue. The vector is taken up at the synapse and transported to the cell body of target neurons. This model is suitable for retrograde tracing of important spinal pathways or targeting cells for gene therapy applications.

Birden fazla Motor yolları sıçan Spinal Kord Lentiviral bir vektör direkt enjeksiyon vurgulamaktadır

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

In vivo doğrudan reprogramming Resident glial hücreler Interneurons viral vektörler ıntracerebral enjeksiyon ile

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...