המחברים רוצים להכיר בקרן בייקר ו&#39;הנשים במדע המלגה &quot;קרן הילדים מלכותי תמיכה של Zerina Lokmic. אנדרו ג &#39;Elefanty ואדוארד ג&#39; סטנלי הם NHMRC עמיתי מחקר בכיר. עבודה במעבדותיהם נתמכה על ידי NHMRC ותאי גזע אוסטרליה.

הצהרת אתיקה: אישור אתי לאיסוף רקמות מום ועורלת הלימפה התקבלה מועדות האתיקה מחקר האדם בבית החולים מלכותי לילדים, מלבורן, אוסטרליה. הסכמה חתומה התקבלה מההורים של החולים לפני הניתוח. דגימות רקמה נאספו מחולים שאובחנו עם LMS עובר ניתוחים כחלק מהניהול הקליני שלהם וחולים שעבר ברית מילה בחירה. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של הבריאות הלאומית ומועצה למחקר רפואי, אוסטרליה. 1. הכנת תרחיף תא מהעורלה והלימפה מומים רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגרים ומדיה הכנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת תא האנדותל מלאה באמצעות ערכת Bullet זמינה מסחרי EGM-2 MV ידי התחממות EGM-2 תקשורת ועדינות הפשרת רכיבי הערכה 37 ° C אמבט מים. בכיתה השנייה קבינט בטיחות ביולוגית, סביבה נקיה מחיידקיםלהוסיף כל רכיב לEGM-2 התקשורת. לאחר שכל הרכיבים נוספים לתקשורת, מתייחס לזה כאמצעי תקשורת &quot;תקשורת תא האנדותל מלאה &#39;. השתמש פיפטה 50 מיליליטר סטרילי לערבב את התוכן לפני השימוש. הערה: כל הצעדים הנוגעים לתרבות תא מבוצעים בקבינט Biohazard בכיתה השני. כל הפתרונות מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס בהתאם להוראות יצרנים והם חיממו לטמפרטורת חדר לפני השימוש. התקשורת המלאה אנדותל התא, מאגרי תרבית תאים ופתרונות אנזים הם חיממו על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים תקשורת תא אנדותל להשלים עם 50 VEGF-C ng / ml. Aliquot תקשורת תא האנדותל בתוספת לצינורות 50 מיליליטר וחנות סטרילי על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. התקשורת היא יציבה לפחות 4 שבועות, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סידן ופוספט שנאגרו מלוח חופשי מגנזיום (PBS) על ידי המסת 8.752 גרם NaCl, 1.416 גרם Na 2 HPO 4 .2H 2 O ו.395 גרם KH 2 PO 4 ב1,000 מיליליטר של מים. התאם ל- pH 7.4. סנן לעקר PBS באמצעות 0.22 מיקרומטר לסנן ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לפני השימוש להוסיף פתרון אנטיביוטי / antimycotic (ששמש בשעה 1: 100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פיברונקטין אדם, לפזר 1 מ&quot;ג של פיברונקטין ב 10 מיליליטר של מים סטריליים. חנות מחדש פתרון ב100 aliquots μl ב -20 ° C. ביום שימוש להוסיף 10 מיליליטר של PBS סטרילי של aliquot פיברונקטין 100 μl (לתת ריכוז עבודה סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקשורת האנזים, להכין תמיסה המכילה 0.04% Dispase השני, 0.25% Collagenase השני ו0.01% DNase אני בPBS סטרילי. ראשית, לשקול dispase וcollagenase, מקום בצינור 50 מיליליטר סטרילי, להוסיף הנפח הנדרש של PBS ודגירה למשך 30 דקות עם רעד על 37 מעלות צלזיוס לפזר. ברגע שהתפרק, סנן לעקר (0.22 מיקרומטר מסנן) פתרון dispase / collagenase במכסת מנוע בטיחות ביולוגית. סביבה נקיה מחיידקים להוסיף I. חנות DNase הפתרון האנזימטית על 37 מעלות צלזיוס עדלהשתמש. הערה: אני DNase הוא מגיב כיתה מסחרית תרבית תאים זמינה כאבקת lyophilized סטרילי. </li></ol></li></ol> 2. הכנת תרחיף תא ממומי עורלה והלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל שפופרת 50 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של / 2% פתרון antimycotic אנטיביוטיקה DMEM. צינור זה ישמש לאיסוף רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הסרה כירורגית של מום הלימפה ורקמות עורלה, סביבה נקיה מחיידקים להוסיף דגימת רקמה לצינור וההעברה על קרח למעבדה תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הצינור המכיל את הרקמה ולחשב את משקל רקמה. השתמש במשקל זה כדי לחשב את הנפח של הפתרון האנזימטית הדרוש כדי לעכל את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארון בטיחות ביולוגית Class II, להשתמש במלקחיים סטרילי להעביר את הרקמה ותקשורת לתוך צלחת תרבית רקמת 100 מ&quot;מ. השתמש במספרי סטרילי כדי לרכך את הרקמה ל~ 1 מ&quot;מ 3 חתיכות דק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה טחונות העברה מעורבבת עם i תקשורתn כדי שפופרת 50 מיליליטר המכילה תוספת של 10 מיליליטר של תמיסה סטרילית DMEM / 2% לאנטיביוטיקה antimycotic. מערבבים על ידי היפוך מחדש להשעות את הרקמה. צנטריפוגה המדגם XG ב 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant. בהתבסס על משקל רקמה, להוסיף 1 מיליליטר של collagenase המחומם מראש (37 ° C) II / פתרון עיכול DNase I / II Dispase לרקמה טחון 100 מ&quot;ג. בדרך כלל, להשתמש 10 מיליליטר של תמיסת אנזים לכ 1 גרם של רקמה טחונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמות בחממה 37 ° C דקות 20-90 עם קבועים רועד ב 200 סל&quot;ד. בתום תקופה זו, להבטיח כי כמעט כל הרקמה מתעכלת לרסיסים בסדר. הערה: חשיפה של התאים לcollagenase וdispase בעת הבידוד מהישרדות תא השפעות רקמות העיקריות. מצאנו באופן אמפירי שרוב דגימות עורלה בילוד בצורה אופטימלית דורשות 20-30 דקות של עיכול, ואילו דגימות מום הלימפה fibrotic עשויות לדרוש 60-90 דקות של עיכול. תשואת הבקר LMשל מושפעים מכמות סיסטיק הנוכחי, רקמה סיבית יותר מניב פחות תאים, אולי בשל השפעות מזיקות של חשיפה ממושכת לcollagenase השני וdispase השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות עיכול, להעביר את הצינור לארון הבטיחות הביולוגית ולהעביר את פתרון הרקמה מתעכל דרך מסננת 70 מיקרומטר להציב לתוך שפופרת 50 מיליליטר סטרילי. שימוש בבוכנת מזרק 3 מיליליטר עם בוכנת גומי, לטחון את הרקמה שנותרה עד שרק עקבות קטנות של מטריקס הם נצפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מסננת התא עם נפח שווה ערך בינוני תא האנדותל להיקף מתנער בינוני אנזים להתאושש תאים נדבקו למסננת וכדי להשבית את האנזימים. לדוגמא, עבור 2 מיליליטר של חוצן בינוני אנזים לעכל את הרקמה הטחון, להוסיף 2 מיליליטר של מדיום תא האנדותל כדי להשבית את האנזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה פתרון התא XG ב 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. &gt; R דואר להשעות את התאים ב 10 מיליליטר של PBS. תאי צנטריפוגה XG ב 3005 דקות, להסיר את supernatant לאחר מכן לחזור לשטוף תא פעמיים. &gt; Resuspend התא גלולה ב 20 מיליליטר של מדיום תא האנדותל. ספירת תאים באמצעות כחול אז זרע trypan 2 x 10&gt; 6 תאים ב150 סנטימטר&gt; 2 בקבוק מראש מצופה פיברונקטין בנפח סופי של 20 מיליליטר של מדיום תא האנדותל. תרבות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO&gt; 2 בחממת אוויר humidified.&gt; הערה: צפוי כי 75% -90% מתאי בעלי הגרעין לשרוד עיכול רקמה כפי שהוערכו על ידי הרחקת trypan הכחולה. ספירת התאים הראשונית משקפת תאים כל גרעין בהשעית התא (כלומר קרטינוציטים, לויקוציטים, מקרופאגים, תאי רקמת חיבור ותאי כלי דם). ספירת התאים ב5-7 ימים משקפת תאים שצורפו, שרדו והתרבו במהלך תרבית תאים. ציפוי צלוחיות תרבית רקמה עם פיברונקטין גם משפר את הבקר הבא והישרדות LM הבקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה הלילה, לשטוף תאים משם מאוגד בשלושה שוטף עם P/ 1% פתרון BS אנטיביוטיקה antimycotic ולהוסיף בינוני תא האנדותל טרי. לבצע שלושה שוטף כדי להסיר ביעילות תאים מאוגד ותאי דם אדומים הנמצאים בבקבוק. שינוי תקשורת בכל יום שני. תאים יהיו ~ 80% ומחוברות לאחר 5-7 ימים. </li></ol> 3. נוגדן צביעת תאים למשטח סמני תא האנדותל הלימפה לcytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהתאים הגיעו מפגש 80%, בינוני לשאוב ותאי שטיפה עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים חסיד ידי דוגרים תאים עם 7 מיליליטר של תמיסת ניתוק תא כגון Accutase לבקבוק 150 סנטימטר 2 5-7 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים מנותקים, להשבית את פתרון ניתוק תא על ידי הוספת 3 כרכים של מדיום תא האנדותל ולהעביר את ההשעיה תא צינור סטרילי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים 5 מיליליטר של PBS. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, להסיר את יםupernatant לאחר מכן לחזור לשטוף תא. מחדש להשעות את התאים ב 5 מיליליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר תאי קיימא. מערבבים 10 μl של השעיה תא עם 90 μl של 0.4% trypan כחולים. ההעברה 10 μl של השעיה זו לhemocytometer לספירה. הערה: תשואת התא הסופית תהיה תלויה בגודל מדגם מעובד. התשואה הרגילה התא לטווחים של 150 סנטימטר 2 בקבוק מ7 x 10 5-1.2 x 10 6 תאי קיימא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות נוגדן למכתים תא. הערה: דילולים הבאים טיטרציה למכתימים 1 x 10 6 בצביעת נפח של 100 μl. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר לדלל PE מצומדות VEGFR-3 אדם אנטי (01:50); CD34 PE-Cy7 העכבר מצומדות אנטי האנושי מצומדות (1: 200); CD31 APC-מצומדות עכבר אנטי אנושי (1: 100) וAlexa אדם אנטי עכברוש 488 מצומדות- PODOPLANIN (1: 200) בהיקף כולל של 100 μl 5% FBS סטרילי / פתרון PBS לדגימה רקמה. בעקבות הכנתפתרון נוגדן, לשמור על קרח עד לשימוש. כמו כן להכין תערובת נוגדני שליטת אלוטיפ מדוללת כדי להקל על הגדרה של זרימת cytometry שערים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפחית ספציפי מחייב של הנוגדנים, תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 2 דקות, להסיר supernatant אז להשעות את התאים 100 μl 5% FBS סטרילי / פתרון PBS לדגימה להיות מוכתם. דגירה תאים על קרח למשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות, להסיר supernatant אז מחדש להשעות תאים בקוקטייל הנוגדנים מצומדות. גם להכתים aliquot קטן יותר של תאים (1 x 10 5) בתערובת נוגדני שליטת אלוטיפ 100 μl. דגירה תאים על קרח למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את הנוגדן מאוגד, להוסיף 2 מיליליטר של 2% FBS / פתרון PBS ו צנטריפוגות התאים ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וחזור לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה לשליטה אלוטיפ ומדגם הנוגדן מוכתם להיות מסודר ב300 μl של 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר propidium iodide / 2% FBS פתרון / PBS. מניחים צינורות על קרח עד מיון. </li></ol> 4. מיון תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחומרים הבאים כדי להגדיר את המכשיר; חרוזים יישור כגון חלקיקים זמינים מסחרי ניאון, נוזל נדן מלוח מבוסס פוספט וחרוזים עיכוב ירידה, כגון חרוזי ניאון Accudrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את LECs האנושי המטוהר במכשיר סלולארי מיון הקרינה המופעל רב פרמטר. להגדיר את המכשיר וליישר לפי המלצות יצרן. בנוסף, להפעיל פקדי פיצוי כתם יחידים עם כל סוג כדי ליצור את מטריצת פיצויים ובכך לחסל את הדימום משמעותי בפליטה של ​​fluorochromes כגון PE לערוץ PE-סי. הערה: שיעור גבוה יותר של FACS מיון תאים לשרוד הבידוד אם נחיר 100 מיקרומטר משמש ותאים מסודרים לתוך מדיום תא האנדותל. </li></ol> 5. תא מיין תרבות ההודעה FACSING <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות, תאי צנטריפוגה מיון ב XG 300 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant וresuspend התאים 5-10 מיליליטר של תקשורת (תלוי בבקבוק המשמש לזרע התא). אם פחות מ -50,000 תאים מסודרים, התאים בתרבית פיברונקטין מצופה 25 סנטימטר 2 בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרת תרבות התאים בבקבוק 2 מצופה פיברונקטין 75 סנטימטר על 37 מעלות צלזיוס בחממת 5% humidified אוויר CO 2,. שינוי תקשורת לאחר 2 ימים. הערה: תקשורת נייד משתנה בכל יום שני כי הארכת הזמן בין שינויי תקשורת מופיעה להעדיף הישרדות של התאים הלא-אנדותל. אנו לאמת את הפנוטיפ תא האנדותל הלימפה באמצעות זיהוי immunohistochemical של סמנים: PROX-1, VEGFR-3, Podoplanin, CD34 וCD31 כאשר התאים פיצול ראשון להרחבה נוספת 15. </li></ol>

<ol>
	<li>Baluk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+specialized+junctions+between+endothelial+cells+of+lymphatic+vessels.">Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels.</a> J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).</li><li>Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+button-like+junctions+in+the+endothelium+of+airway+lymphatics+in+development+and+inflammation.">Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation.</a> Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).</li><li>Zawieja, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+physiology+of+lymphatics.">Contractile physiology of lymphatics.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).</li><li>Witte, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+function+relationships+in+the+lymphatic+system+and+implications+for+cancer+biology.">Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology.</a> Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).</li><li>Andrade, M., Jacomo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+lymphatic+system.">Anatomy of the human lymphatic system.</a> Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).</li><li>Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, (2009).</li><li>Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+cancer+metastasis:+bridging+the+gaps.">Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps.</a> Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mulliken &amp; Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. , 1059-1076 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mulliken &amp; Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, 562-594 (2013).</li><li>Bellini, C., Hennekam, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+disorders+of+primary+malfunctioning+of+the+lymphatic+system.">Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).</li><li>Schook, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+lymphedema:+clinical+features+and+management+in+138+pediatric+patients.">Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients.</a> Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).</li><li>Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lymphatic+anomalies.">Genetics of lymphatic anomalies.</a> J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=for+the+Study+of+Vascular+Anomalies+(ISSVA)+classification.">for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification.</a> Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).</li><li>Croteau, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis:+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly.">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+malformation+endothelial+cells,+their+in+vitro+characterization+and+in+vivo+survival+in+a+mouse+xenograft+model.">Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model.</a> Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).</li><li>Smith, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+malformations.">Lymphatic malformations.</a> Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+histologic+features+and+immunohistochemical+staining+in+microcystic+and+macrocystic+lymphatic+malformations.">Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).</li><li>Norgall, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+expression+of+VEGFR-3+in+lymphatic+endothelial+cells+from+lymphangiomas.">Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas.</a> BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).</li><li>Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+malformations.">Vascular malformations.</a> Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).</li><li>Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , (2014).</li><li>Baluk, P., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+microscopic+imaging+of+lymphangiogenesis+and+angiogenesis.">Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis.</a> Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).</li><li>Lokmic, Z., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+microcirculation.+Tissue+engineering.">Engineering the microcirculation. Tissue engineering.</a> Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).</li><li>Lokmic, Z., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+and+stereological+assessment+of+blood+and+lymphatic+vessels.">Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels.</a> Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).</li><li>Hagerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+lymphatic+vessel+development,+growth,+and+function.">Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li><li>Kaipainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+fms-like+tyrosine+kinase+4+gene+becomes+restricted+to+lymphatic+endothelium+during+development.">Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).</li><li>Schacht, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T1alpha/podoplanin+deficiency+disrupts+normal+lymphatic+vasculature+formation+and+causes+lymphedema.">T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema.</a> EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).</li><li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages.">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).</li><li>Florez-Vargas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+D2-40+and+LYVE-1+immunostaiing+in+lymphatic+malformations.">Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations.</a> Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDZ+interaction+site+in+ephrinB2+is+required+for+the+remodeling+of+lymphatic+vasculature.">PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature.</a> Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).</li><li>Connell, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+coding+regions+of+VEGFR3+and+VEGFRC+in+Milroy+disese+and+other+primary+lymphoedemas.">Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas.</a> Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

LECs לשחק תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס נוזל, תגובה חיסונית לאנטיגנים זרים וקליטה והובלה של כמה חומרים מזינים. הומאוסטזיס הבקר יכול להיות מושפע מתהליכי מחלה כגון זיהומים חיידקיים וגרורות סרטניים, אך LECs יכול גם לפתח מוטציות סומטיות שתגרומנה להיווצרותם של כלי הלימפה לא מתפקדים ותחלואה משמעותית עבור חולים מושפעים. כדי להשיג יותר הבנה של אטיולוגיה מום הלימפה דרך השתלת in vivo וניסויים vivo לשעבר, ולגלות אפשרויות טיפול חדשות, שפותחנו לראשונה שיטת בידוד הבקר מבוסס על אסטרטגית בחירת חרוז מגנטי באמצעות אסטרטגית בחירת CD34 נג CD31 ממוצע 15. עם זאת, וכתוצאה מכך לעתים קרובות התרבויות הכילו תאים אחרים מאשר תאי האנדותל שהיו קשים להסיר. בהמשך לכך, השיטה הייתה מעודנת באמצעות FACS למיין LECs המבטא CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGR3 Pמערכת ההפעלה פנוטיפ PODOPLANIN ממוצע. גישה זו הביאה לתרבויות הבקר הומוגני יחסית המכילות &lt;0.5% של תאים שאינם נמוך CD34 CD31 ממוצע VEGR3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע בצק פוסט-מיון. במונחים מעשיים, את היתרון של מיון תאים על ידי FACS הוא כי הפחתת נוכחות LECs אי ל&lt; 0.5%. יש לי LECs התרבותי וLECs LM מורפולוגיה מרוצפת טיפוסית ולהיות מזדקנים סביב מעבר 13. במחקר זה שתארנו פרוטוקול מבוסס cytometry זרימה לבידוד והתרבות של LECs המועשר מרקמות נורמליות ולא נורמליות מבוססות על הביטוי שלהם חבילה של סמנים פני התא (CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGR3 ממוצע PODOPLANIN POS). תאים מוינו מרקמות עיקריות הבא 5-7 ימים של התרחבות במבחנה, צעד שהביא להעשרה משמעותית של הבקר בהשוואה לתדירותם ברקמות בזמן הבידוד. במהלך שלurgery נקבל רקמות שנעו בין כמה מיקרוגרם לעשרות גרם במשקל. רקמה זו יכולה להשתנות במידה רבה בהרכבו ביחס לנפח של כלי הלימפה מום נוכחי, צלקות ונוכחות של ציסטה thrombi מום הלימפה ברקמות. כל המרכיבים הללו ישפיעו כמה תאים יכולים להיות מבודדים מהרקמה החולה. מכאן את המספר הסלולרי מתחיל יכול לנוע בין כמה אלף תאים לכמה מיליוני תאים. כמו כן, זה ישפיע על הרכב של ההשעיה התא ומתחיל מספרים סלולריים כלומר את מספר התאים הממוינים גם שונה ממדגם אחד למשנהו. תדירות LECs בדגימות עורלה לא ממוינות הבא 5-7 ימים בתרבות נעה בין 0.52% ל -4.7%, ואילו LECs LM נע בין 0.8% ל 12.43%. תרבויות הבקר מורכבות&gt; 99% CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGR3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע תאים לאחר cobbleston טיפוסי מחדש ניתוח שלאחר המיון ומתוחזקמורפולוגיה דואר בתרבות עד הזדקנות במעבר ~ 13 ללא יתר על ידי גורמים לא-אנדותל. יש צורך להרחיב את תאי vivo לשעבר הבאה עיכול רקמה ראשוני ומיון בגלל התשואה של שני תאי מום עורלה או הלימפה היא בדרך כלל נמוכה. כך, ההתרחבות המוקדמת של תאי האנדותל הלימפה אני n מבחנה מאפשרת את הדור של ~ 2x10 6 התאים נחוצים לזרע קאמרי עכבר. זה דורש שלב התרחבות במבחנה של 5-7 ימים. בזמן שאנחנו קיבלנו שתרבית תאים עשויה לגרום לשינויים פנוטיפי בתאים הראשוניים, שהראינו כי תאים בתרבית אלה לשמור על היכולת שלהם כדי ליצור מבנים כמו מום-הלימפה במודל xenograft עכבר 15. ישנם מספר צעדים קריטיים בפרוטוקול הקובעים את מידת הצלחה של עת מיון תאים על ידי FACS. השלב הקריטי ביותר הוא זמן חשיפה של התאים לCollagenaseוdispase בבידוד מהרקמות העיקריות כמתואר בשלב 2.7. זה לא השפיע רק על ידי הכמות והסוג של רקמת הווה אלא גם על ידי הקבוצה של אנזימים המשמשים. בנוסף, נוגדנים שכותרתו fluorescently משמשים כדי לאפיין את אוכלוסיות תאים צריכים להיות טיטרציה ורצוי חד שבטי. בדקנו כמה פתרונות ניתוק תאים שונים כגון טריפסין / EDTA, EDTA, TrypLE בחרו ופתרון ניתוק תא. מצאנו כי EDTA היה לשמש לתקופה ממושכת של זמן לנתק את התאים וגושי תא שייר לעתים קרובות נשארו. לעומת זאת, השעיות תא בודדות נוצרו בתוך 3-5 דקות של דגירה בטריפסין / EDTA, פתרון ניתוק התא וTrypLE בחר. לא נמצאו הבדלים משמעותיים בביטוי של CD31, CD34, Podoplanin וVEGFR-3 בעקבות טיפול בכל אחד מפתרונות האנזים. צריכים להיעשות גם דגימות צבעוניות יחידה עם כל ניסוי מיון על מנת להבטיח כי ספקטרום פליטת fluorochrome אינו חופפות ולכן נותן קריאה שגויה. שלבים קריטיים אלה מהווים גם צעדים שבו שינויים בפרוטוקול התא ייתכן שיהיו צורך או איתור תקלות במהלך cytometry זרימת מיון. בהשוואה לבידוד חרוז המגנטי של 15 LECs שפורסם בעבר שלנו, היתרון של LECs בידוד על ידי FACS כולל את המרכיבים הבאים: בידוד מהיר יותר של תאים עם טוהר גבוה וזיהוי תת תא נפרד ואוכלוסיות נדירות בתוך מדגם הטרוגני. המגבלות העיקריות של הבקר מבוסס FACS ובידוד LM הבקר סובבת סביב מוגבלות מספר התאים זמינים לאימות הבאה תוצאות מיון תא. בנוסף, בזמן שכל נעשה ניסיון לתקן מבחני שלנו והגדרת מכשיר, אותו פרמטרים אלה לא בהכרח לשחזור במעבדות אחרות. לכן, כמה השתנות בתוצאות עלולות להתרחש. בנוסף, אחד הנושאים שביולוגים הלימפה להתמודד הוא היעדר סמנים ספציפיים תאשיבדיל בין סמני הבקר נימים ראשוניים ואיסוף סמני הבקר נימים. בשלב זה, עדיין לא זוהה סמני הבקר שהיה להבחין בין LECs הבריא וLM LECs. מאז רקמת הלימפה מום מכילה גם רגילה למראה כלי הלימפה (איור 1 א), CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGR3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע וכתוצאה מכך יכיל כמו גם חלקם של LECs הנורמלי אלה של פנוטיפ החולה. מחקרים עתידיים הבקר בחינה וביטוי גני LM הבקר ופרוטאומיקה ייתכן שיוכלו לכוון אותנו לכיוון סמני הבקר LM ספציפיים יותר שיכול להבחין LM LECs מLECs באותו הרקמה. בעתיד, אנו מצפים לנצל FACS וסמני הבקר החדשים אלה בניסיון לזהות תת נדיר של אוכלוסיות הבקר הן בערלה ומומי הלימפה. זה יאפשר לנו לבודד אוכלוסיות תאים אלה וללמוד את תפקידם בפיתוח lympמערכת כלי דם ומומי hatic הלימפה. LECs בידוד וLM LECs מבוסס על CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGR3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע צמצמו באופן משמעותי את הזיהום של תאים לא-אנדותל. יתר על כן, טכנולוגית FACS מאפשרת לנו להפריד LECs לתת מבוסס על הביטוי של CD31, PODOPLANIN וVEGFR-3 סמנים פני תא ולהבין את זה בהקשר של פיתוח שושלת תא. לLECs החולה, זה מאפשר ללימודי תא ספציפי שישפוך אור נוסף על גנים הגורמים למחלות הבקר ויכולת הבקר להגיב לגירויים שונים תא במבחנה ובמודלי xenograft בעלי החיים.

תפקידה העיקרי של מערכת הלימפה וכלי הדם הוא לקלוט הלימפה, נוזל ביניים עודף המכיל שומנים, חלבונים ומרכיבים תאיים, ולנהל אותו למערכת ורידי דם. רשת של נימי הלימפה מכוונת לימפה לבלוטות הלימפה שבו הוא הוקרן לנוכחות של אנטיגנים זרים, תהליך חשוב במעקב ופריסה של תאי דם לבנים לנטרל אנטיגנים זרים חיסוניים. מערכת הלימפה חד כיוונית מתחילה ברקמות עם נימי הלימפה הראשוניות, מבנה ייחודי עם שכבה אחת רציפה של תאי האנדותל שטוח מוקף חומה דקות עם צמתים תא מיוחדים המאפשרים כניסה לימפה 1,2. נימים אלה מחוברות מטריצת רקמת חיבור השכנה באמצעות עיגון חוטים כדי למנוע קריסת ספינה בנוכחות של לחץ מוגבר ביניים 3. נימי הלימפה הראשוניות הריקות לאיסוף נימי הלימפהשלהתגבש לגדולים יותר כלי או ורידי הלימפה. בהשוואה ראשוני כלי נימי הלימפה, איסוף יש כלי הלימפה דפנות כולים עבים, שסתומים הלימפה לזווג ונארזים על ידי קרום מרתף רציף שבו כמה תאי שריר חלק מוטבעים 4. פתיחה מתואמת וסגירת שסתומי הלימפה והתכווצות של תאי שריר חלק מאפשרים זרימת הלימפה 3. בבני אדם, ורידי הלימפה מאזורים שונים בגוף מצטרפים לגזעי הלימפה המתמזגים ליצירת שתי צינוריות הלימפה: צינור החזה וצינור הלימפה תקין. צינור החזה מרוקן הלימפה מהצד השמאלי של הגוף ומהצד הימני מתחת לחזה בזמן הלימפה מתנקזת צינור הלימפה תקין מהזרוע הימנית וצד ימין של הראש, צוואר, בית החזה ו. שני צינורות הלימפה לנהל לתוך ורידי subclavian בצוואר 5. הפרעות של מערכת הלימפה מקובצים באופן כללי לרכשND מולדת (טבלה 1). דוגמאות לתנאים נרכשים הנן דַלֶקֶת כְּלֵי הַלְשַׁד ובצקת לימפתית משנית. דַלֶקֶת כְּלֵי הַלְשַׁד היא דלקת של כלי הלימפה עקב זיהום חיידקים. Lymphatics המושפעת להתרחב ולמלא עם תאי polymorphonuclear exudate מכיל. בעור, lymphatics אלה נראית כפסים אדומים, כואבים תת עורי לעתים קרובות מלווים בהגדלה של קשורים צומת הניקוז לימפה (בְּלוּטַת לְשַׁד) 6. בצקת לימפתית משנית נובעת כתוצאה מניזק או שיבוש לחסימת כלי שיט או בלוטה לימפה הלימפה. זה מוביל לנפיחות מתקדמת כרונית עקב הצטברות של דיסטלי לימפה לנזק או שיבוש הליכי. במדינות מפותחות, בצקת לימפתית משנית קשורה לרוב עם ממאירות בי גידולי גרורות להכשיל כלי הלימפה או בלוטות הלימפה אזוריות, או כתוצאה מטיפול אנטי-סרטני לאחר ההסרה כירורגית של בלוטות לימפה, סיסטיק הודעה הקרנה-וthrom פוסט-דלקתיbosis וצלקות 7. בחלקים אחרים של העולם, בצקת לימפתית משנית עשויה להיות משנית לחסימת הלימפה הנגרמת על ידי תולעים טפילים כגון bancrofti Wuchereria 6. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> הפרעות של מערכת כלי דם הלימפה </td></tr><tr><td> רכש </td><td colspan="3"> מולדים </td></tr><tr><td rowspan="3"> בְּלוּטַת לְשַׁד בצקת לימפתית משנית </td><td> עיקרי בצקת לימפתית 10 </td><td> הלימפה מומים סדירים 13 </td><td> הלימפה מומים הקשורים תסמונות 13 </td></tr><tr><td rowspan="2"> למשל Milroy תסמונת Meige תסמונת </td><td> פשוט: מומים הלימפה </td><td rowspan="2"> למשל Klippel-Tranaunay תסמונת הפארקים וובר תסמונת סטרג&#39;-וובר תסמונת </td></tr><tr><td> בשילוב: מומים נימים-הלימפה מום נימים-הלימפה-ורידים מום נימים-הלימפה-arteriovenous מום ורידים-arteriovenous נימים-הלימפה </td></tr></tbody></table> 1. השולחן של ההפרעות של מערכת כלי דם הלימפה. הפרעות מולדות של מערכת הלימפה כוללות בצקת לימפתית ראשונית (אידיופטית) חשבה שנגרם על ידי מוטציות גנטיות, lymphangiectasia וחריגות של 8,9 מערכת הלימפה. בצקת לימפתית ראשונית יכולה להיות לא סדירה שנגרמה ככל הנראה על ידי מוטציות דה נובו, או בירושה. הפרעות הלימפה יכולות גם להיות מבודדות או מהוות חלק מתסמונת כללית יותר 10. באוכלוסיית הילדים, 97% מהלימפההבצקת היא לא סדירה עם ליקויים במבנה כלי הלימפה הפוגעים בניקוז הלימפה אזורית 11. המחלה Milroy היא דוגמא לבצקת לימפתית העיקרית הנגרמת על ידי מוטציה בגן ניכר בלידה או מייד לאחר 12 VEGFR-3. למרות מצב משפחתי בעיקר, המחלה Milroy יכולה גם להיות מזוהה בתינוקות ללא היסטוריה של מחלות Milroy 32 משפחה. החומרה של כל בצקת לימפתית תלויה בכמות הייצור לימפה והיכולת להעביר לימפה בחזרה למחזור ורידי 6. בהתבסס על מצגת קלינית ובהתפשטות תאי אנדותל באתר, מומים של מערכת הלימפה מסווגות כגידולי הלימפה או מומים הלימפה 13. Kaposiform lymphangiomatosis היא דוגמא לגידול הבקר 14. מומים הלימפה הם חשבו להתעורר במהלך התפתחות עוברית ולגדול באופן יחסי לילד 15,16. רק לעתים רחוקות הם לסגת אבל יכולים מאהלרn ללא תסמינים עד טראומה או זיהום משקעים צמיחה מהירה שמובילה לסיבוכים קליניים. המבנה המסודר של רשת והולכה של הלימפה הלימפה מרקמות למחזור ורידים שתואר לעיל הוא מוטרד במומי הלימפה אשר מורכב של אוספים מקומיים של מבני פיברוזיס חריגים מלאים בנוזל הלימפה. אמנם אין עדות קלינית או ניסויים שכלי פיברוזיס אלה מחוברים לזרימת הלימפה או שהם מכילים שסתומים הלימפה פונקציונליים, זהות הלימפה שלהם אושר על ידי ביטוי של מגוון רחב של סמני תא הלימפה כגון PODOPLANIN, CD31, כלי הלימפה האנדותל קולט 1 (LYVE-1), חלבון homeobox פרוספרו 1 (PROX-1) וVEGFR-3 15,17,18. מבני פיברוזיס אלה יכולים להיות קטנים (microcystic) או גדול (macrocystic), אבל רוב המומים הלימפה מכילים הן microcystic ורכיבי macrocystic (איור 1) 16. לאחר ניתוח, Injection sclerotherapy ו / או גלי רדיו אבלציה המומים הלימפה לעתים קרובות מתרחשת שוב. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1. מורפולוגיה של כלי הלימפה אנושי ומומי הלימפה. הלימפה אנושית רגילה () וכלי הלימפה מום (B ו- C) שכותרתו עם נוגדן לPODOPLANIN (תווית בצבע חום, חץ). כלי מום הלימפה אנושיים מאופיינים בהתרחבות ניכרת והבדלים ניכרים בגודל לומן. מבני פיברוזיס החריגים המקומיים אלה יכולים להיות קטן (ב) או גדול (macrocystic, #) (ג) (microcystic, *). רוב המומים הלימפה מכילים את שני מרכיבי microcystic וmacrocystic. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.</a> &lt;/ P&gt; חוקרים אחדים הציעו שמומי הלימפה מייצגים הפרעה התפתחותית של כלי דם הלימפה שבאין לי LECs פוטנציאל צמיחה נורמלי אבל במקום לא הצליח להתחבר לזרימה הרגילה 19. עם זאת, מצאנו כי LECs LM להתרבות מהר יותר ועמיד יותר לאפופטוזיס מאשר עורלת 15 LECs מצביע על כך שיש פגם עיקרי בLECs LM. כאשר LECs LM מושתל במודל xenograft עכבר, הם יוצרים מבנים דמויים מומים הלימפה 15. זה תומך בהשערה כי מומים הלימפה עלולים להיגרם על ידי אחד או יותר מוטציות סומטיות שהמקורה בLECs LM במהלך התפתחות עוברית. ואכן, הדיווחים אחרונים זיהו מוטציה אחת כזו במקטע קטליטי p110α של phosphoinositide-3-קינאז גן (PIK3CA) 20. בהתחשב בהתקדמות טכנולוגית רצפי DNA, מוטציות רלוונטיות גולד להיות מזוהה בקלות רבה יותר בLECs LM המבודד, המנחה את המחקרים עתידיים של תנאים אלה. הבידוד של LECs קיימא יאפשר השוואות בין LECs נורמלי והרגיל במבחנים כגון הגירה, שגשוג, יכולת להרכיב צינור והישרדות בתגובה לזמינות חומרי מזון מופחת או סוכנים פרו-אפופטוטיים 15. LECs המבודד יאפשר לנו לבצע עוד ביטוי גני תא ספציפי ומחקרי proteomic, להתוות אוכלוסיות הבקר חדשות ולגלות סוכנים תרופתיים רומן מתאים לניהול קליני של מומים הלימפה. יש לנו שפורסם בעבר בשיטת בידוד הבקר המבוססת על הפרדה חרוז מגנטית של LECs מעורלה בילוד ומומי הלימפה 15. דיווחנו אסטרטגיה של הפרדת LECs הבריא וחולה מתאי האנדותל של כלי דם המבוססים על היעדר ביטוי CD34, ואחרי חשיפת חלק תא CD34 נג לסלקציה חיובית לCD31.עם זאת, שיטה זו הקשתה על ידי הנוכחות של תאי האנדותל אינו שייר. זה לא היה תלוי בהסרת עור לפני עיכול רקמת חיבור שלאחר מכן. מזהמים אלה בדרך כלל התרבו במהירות רבה יותר ובכך בסופו overgrew תרביות תאי אנדותל למרות ניסיונות שלאחר מכן לחזור על בידוד הבקר. ואכן, זיהום ראשוני של תאי האנדותל אינו נמוכים כמו 2% עד 5% היה מספיק כדי להכניע את אוכלוסיית הבקר 15. זה גרם לנו לבחון שיטת מיון תא מופעלת fluorescently כאופציה לשיפור תשואת תא הבקר וטהרה. בנוסף, השתמשנו רב פרמטר מיון כדי לשפר את הספציפיות של אוכלוסיות הבקר, הוספת VEGFR-3 וPODOPLANIN לסמני הבחירה לזהות CD34 VEGFR-3 LECs נמוך CD31 ממוצע ממוצע ממוצע PODOPLANIN. הרציונל לבחירת סמנים אלה היה מבוסס על הדיווחים כי בעוד לסה&quot;נ LECs וכלי דם דם האנדותלLLS יש סמנים פני תא משותף רבים כגון CD31, LECs להראות וריאציה פנוטיפי בביטוים של CD34, PODOPLANIN וVEGFR-3 סמן תא שטח בהשוואה לתאי האנדותל של כלי דם דם 21-23. CD31 הוא גליקופרוטאין הטרנסממברני 130 kDa הידוע גם במולקולת הידבקות טסיות דם תא האנדותל 1 (PECAM-1). זה נחשב סמן תא פאן-אנדותל שכן הוא בא לידי הביטוי בכל הסוגים של כלי דם והלימפה 21,24,25. CD34 הוא 110-kDa גליקופרוטאין הטרנסממברני נוכחי על אבות היווצרות הדם ביותר ותאי גזע, תאי האנדותל של כלי דם וכלי הלימפה כמה 26. VEGFR-3, קולט לצמיחה של אנדותל כלי דם גורמי C ו- D, הוא בתחילה קיימים בורידים המתפתחים בעובר העכבר, אך בעקבות מפרט הלימפה מוסדר על ידי שעתוק גורמי HMG-תיבה הקשורים ל- ¥ * $ (SOX) -18, hicken ג o valbumin u pstreaשחקן עמ &#39;מ&#39; ו ranscription לא romoter 2 (COUPTF-השני) וPROX-1, VEGFR-3 ביטוי ורידים הולך לאיבוד והוא הופך להיות מוגבל לLECs העוברי 25,27. PODOPLANIN, קרום kDa 38 mucoprotein, יצוין ראשון בכלי הלימפה בכ עוברי יום 11 (~ E11.0) של התפתחות העוברית של עכבר 28 ותוך שהוא מתבטא בחריפות על ידי כלי הלימפה כלי דם, PODOPLANIN ביטוי על ידי האנדותל הלימפה macrocystic במומי הלימפה משתנה יותר 15. Cytometry זרימת ניסויים מראים כי לפחות חלק מתאי אנדותל CD34 הגבוה CD31 ממוצע להביע את סמן הלימפה PODOPLANIN 29. למרות הערכה שיטתית של מכתים LYVE-1 וPODOPLANIN במומי הלימפה אדם הראתה כי הן יעילות במכתימים האנדותל מום הלימפה 30, ברקמות נורמליות, LYVE-1 נמסר להיות מאוד נוכח בהלימפה הראשוניתהאנדותל נימים אבל מופחת ואפילו נעדרו בהאנדותל הלימפה איסוף 31. כמו המטרה שלנו היא לבודד את שני תאי האנדותל הלימפה הראשוניים ואיסוף שבחרנו שלא להשתמש LYVE-1 כחלק מהאסטרטגיה שלנו בחירת תא. לבסוף, ההחלטה להעסיק סמנים אלה הייתה מבוססת גם על הזמינות של נוגדנים המשמשות diagnostically לתיוג כלי הלימפה להדמיה מיקרוסקופית, תכונה שתאפשר קשר בין cytometry זרימה ומחקרי immunofluorescent. מאמר זה יתאר את שיטת עיכול רקמה, מכתים תא והגדרות FACS נדרשת לבידוד מוצלח של CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 LECs ממוצע PODOPLANIN ממוצע, כמו גם תאי האנדותל CD34 גבוהים CD31 ממוצע VEGFR-3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע מעורלה ומום הלימפה רקמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Used to collect tissue samples from the operating theatre.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2179-VC-025</td>
			<td>Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution (100x)</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell dissociation reagent</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>StemPro&#174;Accutase&#174; is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue dye</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Used as a viability stain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Used at 0.04%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington Lab</td>
			<td>4176</td>
			<td>Used at 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Used at 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm nylon cell strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>356204</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343516</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303116,</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>337006</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400126</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400120</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400525</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting

הפרעות במערכת הלימפה כגון בצקת לימפתית העיקרית, מומים הלימפה וגידולי הלימפה הן תנאים נדירים הגורמים לתחלואה משמעותית אך מעט מאוד ידוע על הביולוגיה שלהם. בידוד תאים טהורים ביותר אדם הלימפה אנדותל (LECs) מהרקמה חולה ובריאה היה להקל על מחקרים של האנדותל הלימפה ברמות גנטיות, מולקולריות ותאיות. זה צפוי כי חקירות אלה עשויות לחשוף מטרות לטיפולים חדשים שעשויות לשנות את הניהול הקליני של תנאים אלה. פרוטוקול המתאר את בידודו של אדם עורלת LECs ותאי הלימפה מום הלימפה אנדותל (LM LECs) מוצג. כדי להשיג רקמת השעיה תא בודדת הייתה טחון וטופלה באמצעות אנזימי dispase השני וcollagenase השני. ההשעיה התא בודדת וכתוצאה מכך הייתה אז שכותרתו עם נוגדנים לאשכול של בידול סמנים (CD) CD34, CD31, כלי דם האנדותל Growth Factor-3 (VEGFR-3) וPODOPLANIN. Staiתאי קיימא נד מוינו על סדרן תא מופעל fluorescently (FACS) כדי להפריד את האוכלוסייה ממוצע PODOPLANIN ממוצע LM הבקר CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 מאנדותל האחר ותאי האנדותל אינו. LECs LM מסודרים היו בתרבית והרחיב על צלוחיות מצופים פיברונקטין לשימוש ניסיוני נוסף.

בעקבות עיכול רקמה ראשוני, לאחר 24 שעות בתרבות של דגימות unfractionated, ניתן לצפות מושבות תאי אנדותל שונות (איור 2 א) יחד עם תאים כמו פיברובלסטים ותאי שריר חלק. בעקבות מיון ולאחר 24 שעות בתרבית תאים, CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 התאים ממוצע Podoplanin ממוצע לצרף ולהראות מורפולוגיה טיפוסית מרוצפת (איור 2 ו- C). שימוש בשיטה שתוארה לעיל FACS, אנו מסוגלים לטהר תאים עד טוהר 99.8% ולהבדיל ביניהם לבין CD34 הגבוה CD31 ממוצע VEGFR-3 תאי האנדותל ממוצע Podoplanin ממוצע. תוצאות נציג של gating אסטרטגיה והמיון מוצגים באיור 3. זה פתר את הבעיות חוו בעת השימוש בשיטת בידוד מגנטי חרוז. עד כה, יש לנו passaged תאים אלה עד מעבר 13. לאחר הקטע הזה, LECs LM ועורלת הבקרנתחיל להזדקנות, מלווה בשינויים מורפולוגיים וחלוקת תאים מופחתת. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52691/52691fig2.jpg" /> איור 2. העורלה LECs וLM-הבקר. עשרים וארבע שעות לאחר עיכול אנזימטי, תאים לא ממוינים מכילים הן אנדותל (חץ) ותאים שאינם האנדותל (). בעקבות בידוד תא CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 ממוצע Podoplanin ממוצע FACS, עורלת LECs (ב) ו- LM-LECs (ג) הם נטולי תאי האנדותל אינו ולשמור על מורפולוגיה מרוצפת. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות .</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52691/52691fig3.jpg" /> 3. תא הקרינה המופעל איור מיון אסטרטגיות gating למיון תא של כלי דם ותא האנדותל הלימפהים. (א) בתאים חיים הם מגודרת ראשון על CD34 וביטוי CD31, ואחריו VEGFR-3 וgating PODOPLANIN לסוג כלי דם (B) ותאי האנדותל הלימפה (C) בהתאמה. (ד) מחדש ניתוח של CD34 הגבוה CD31 מסודרים ממוצע VEGFR-3 מופעי תאים ממוצע PODOPLANIN ממוצע&gt; 98% פנוטיפ תא אנדותל כלי דם. תאי הבקר (E) מסודרים על CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 פנוטיפ ממוצע PODOPLANIN ממוצע הם גם&gt; 98% טהורים. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד תאי האנדותל הלימפה בדופן כלי אנושיים מום הלימפה כמו ציסטה-ועורלות באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS). culturing התא הבא והתרחבות של תאים אלה מאפשרים רמה חדשה של תחכום ניסיוני למחקרים גנטיים, proteomic, פונקציונליים והתמיינות תאים.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

isolation-human-lymphatic-endothelial-cells-multi-parameter

Google

Research

JoVE Journal

Medicine

14.2K Views.  The Royal Children&#146;s Hospital.  המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד תאי האנדותל הלימפה בדופן כלי אנושיים מום הלימפה כמו ציסטה-ועורלות באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS). culturing התא הבא והתרחבות של תאים אלה מאפשרים רמה חדשה של תחכום ניסיוני למחקרים גנטיים, proteomic, פונקציונליים והת...

Video: Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human cancer cells in mitosis. The phenanthridine PJ-34 was the most potent molecule. Declustering of extra-centrosomes causes mitotic failure and cell death in multi-centrosomal cells. Most solid human cancers have high occurrence of extra-centrosomes. The activity of PJ-34 was documented in real-time by confocal imaging of live human breast cancer MDA-MB-231 cells transfected with vectors encoding for fluorescent &gamma;-tubulin, which is highly abundant in the centrosomes and for fluorescent histone H2b present in the chromosomes. Aberrant chromosomes arrangements and de-clustered &gamma;-tubulin foci representing declustered centrosomes were detected in the transfected MDA-MB-231 cells after treatment with PJ-34. Un-clustered extra-centrosomes in the two spindle poles preceded their cell death. These results linked for the first time the recently detected exclusive cytotoxic activity of PJ-34 in human cancer cells with extra-centrosomes de-clustering in mitosis, and mitotic failure leading to cell death. According to previous findings observed by confocal imaging of fixed cells, PJ-34 exclusively eradicated cancer cells with multi-centrosomes without impairing normal cells undergoing mitosis with two centrosomes and bi-focal spindles. This cytotoxic activity of PJ-34 was not shared by other potent PARP1 inhibitors, and was observed in PARP1 deficient MEF harboring extracentrosomes, suggesting its independency of PARP1 inhibition. Live confocal imaging offered a useful tool for identifying new molecules eradicating cells during mitosis.

The cytotoxic activity of the phenanthridine PJ-34 in cancer cells undergoing mitosis was documented in real time by live confocal imaging. PJ-34 eradicated human breast cancer MDA-MB-231 cells harboring extra-centrosomes in mitosis. Unlike normal bi-focal mitosis, the extra-centrosomes were not clustered in the two spindle poles in the presence of PJ-34.

מוות של תאים הקשורים מיטוזה חריגה נצפה על ידי ההדמיה Confocal בתאי סרטן חיים

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. The origin, classification and characterization of EPCs are complex; notwithstanding, two prominent sub-types of EPCs have been established: so-called &#34;early&#34; EPCs (subsequently referred to as early-EPCs) and late-outgrowth EPCs (late-EPCs). They can be classified by biological properties as well as by their appearance during in vitro culture. While &#34;early&#34; EPCs appear in less than a week after culture of peripheral blood-derived mononuclear cells in EC-specific media, late-outgrowth EPCs can be found after 2-3 weeks. Late-outgrowth EPCs have been recognized to be directly involved in neovascularization, mainly through their ability to differentiate into mature endothelial cells, whereas &#34;early&#34; EPCs express various angiogenic factors as endogenous cargo to promote angiogenesis in a paracrine manner. During myocardial ischemia/reperfusion (I/R), various factors control the homing of EPCs to regions of blood vessel formation.
Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a chemokine-like pro-inflammatory and ubiquitously expressed cytokine and was recently described to function as key regulator of EPCs migration at physiological concentrations1. Interestingly, MIF is stored in intracellular pools and can rapidly be released into the blood stream after several stimuli (e.g. myocardial infarction). 
This protocol describes a method for the reliable isolation and culture of early-EPCs from adult human peripheral blood based on CD34-positive selection with subsequent culture in medium containing endothelial growth factors on fibronectin-coated plates for use in in vitro migration assays against serum samples of cardiac surgical patients. Furthermore, the migratory influence of MIF on chemotaxis of EPCs compared to other well-known angiogenesis-stimulating cytokines is demonstrated.

Endothelial progenitor cells (EPCs) are crucially involved in the neovascularization of ischemic tissues. This method describes the isolation of human EPCs from peripheral blood, as well as the identification of their migratory potential against serum samples of cardiac surgical patients.

בידוד של ובתאים אנדותל מן הבריאה מתנדבת ופוטנציאל הנדידה שלהם בהשפעת דגימות סרום לאחר ניתוח הלב

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the transcriptome and epigenome of ECs is paramount to understanding their roles in development, health, and disease, but is limited in the availability of isolated primary cells. Recent technologies have enabled the high-throughput profiling of EC transcriptome and epigenome, leading to the identification of previously unknown EC cell subpopulations and developmental trajectories. While EC cultures are a useful tool in the exploration of EC function and dysfunction, the culture conditions and multiple passages can introduce external variables that alter the properties of native EC, including morphology, epigenetic state, and gene expression program. To overcome this limitation, the present paper demonstrates a method of isolating human primary ECs from donor mesenteric arteries aiming to capture their native state. ECs in the intimal layer are dissociated mechanically and biochemically with the use of particular enzymes. The resultant cells can be directly used for bulk RNA or single-cell RNA-sequencing or plated for culture. In addition, a workflow is described for the preparation of human arterial tissue for spatial transcriptomics, specifically for a commercially available platform, although this method is also suitable for other spatial transcriptome profiling techniques. This methodology can be applied to different vessels collected from a variety of donors in health or disease states to gain insights into EC transcriptional and epigenetic regulation, a pivotal aspect of endothelial cell biology.

The protocol describes the isolation, culture, and profiling of endothelial cells from human mesenteric artery. Additionally, a method is provided to prepare human artery for spatial transcriptomics. Proteomics, transcriptomics, and functional assays can be performed on isolated cells. This protocol can be repurposed for any medium- or large-size artery.