The authors have no acknowledgements.

הערה: כל הנהלים הקשורים לשימוש בבעלי החיים מתבצעות בהתאם לחקיקה המקומית. העבודה שלנו היא אושרה על ידי ועדת בעלי החיים בריאות המחוזית סידני המקומי הרווחה. הנהלים אפשרו מתוארים בתיעוד רישיון פרויקט ולעקוב אחר הנחיות שתבטחנה את שלומם של בעלי החיים בכל העת. להבטיח עמידה בחקיקה על ניסויים בבעלי חיים במדינה שבן העבודה נעשית. 1. פרוטוקול להכנת EM מקבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשל מקבע 100 מיליליטר, להכין paraformaldehyde על ידי הוספת 2 גרם של אבקת paraformaldehyde 25 מיליליטר מים מזוקקים בבקבוק חרוטי, חום עד 65 מעלות צלזיוס, תוך ערבוב עם בוחש מגנטי כל הזמן. הערה: Glutaraldehyde, paraformaldehyde וחיץ cacodylate נתרן כל חומרים מסוכנים וחייב תמיד להיות מטופלים בfumehood. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לאחר מכן להתקרר. במידת הצורך, להוסיף dropw פתרון נתרן הידרוקסידיISE תוך ערבוב כדי לנקות פתרון לחלוטין. הערה: נתרן הידרוקסידי הוא מסוכן, לטפל בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של glutaraldehyde מניית הכיתה EM, 50 מיליליטר של חיץ cacodylate 0.2 M נתרן ו -2 גרם של סוכרוז ומערבבים עם בוחש מגנטי. הוסף 2 מיליליטר של 1.0 M CaCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם לpH 7.4 לפני קבלת פתרון עד במים מזוקקים 100 מיליליטר. מקבע הסופי מכיל glutaraldehyde 2.5%, Paraformaldehyde 2%, 2 mmol CaCl 2, 2% סוכרוז במאגר M 0.1 cacodylate. ודא שosmolality הכולל הוא 440 mOsmol / L. השתמש בתוך 24 שעות של הכנה. </li></ol> 2. זלוף קיבוע של כבד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר חם זלוף ומקבע ל35-37 מעלות צלזיוס. הטמפרטורה הנכונה של חיץ exsanguination ומקבע עוזרת להבטיח את שלמות רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את החיה עם זריקת intraperitoneal אחת של 50 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין ו5 מ&quot;ג / קילוגרם Xylazine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שבעלי החיים נמצאים תחתהרדמה עמוקה, שהוערכה על ידי נסיגת גפיים אחוריות וקמצוץ זנב, חתך Y הוא עשה עם מספריים קהים הסתיים בבטנו של בעל החיים כדי לחשוף את הווריד הכבד ופורטל. הערה: ודא שהציוד הוא נקי, כדי למנוע זיהום של דגימות עם מיקרואורגניזמים וכללי פסולת שניתן לראות בקלות על SEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור שני תפרים רופפים מאוד מסביב לוריד הפורטל הפרוקסימלי אחד בכבד, יותר האחרים distally אל הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cannulate וריד השער עם צינורית בגודל המתאימה IV (18 G לחולדות, 22 G לעכברים) תפרי .Tighten לאבטח צינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל זלוף עם נאגר מלוח פוספט חימם עד 37 מעלות צלזיוס, ובלחץ של 10 סנטימטרים של H 2 0. בין 5 ל 20 מיליליטר של PBS נדרש בדרך כלל ללגרום לדימום מחודש הכבד. הערה: אל תאפשר לבועות אוויר להיכנס הכבד דרך הצינורות מחוברים לצינורית כפי שהם לגרום לחפצים משניים לאמבוליזציה ולחץ; נזק לhepatocytes, סיnusoids וfenestrations LSEC מתרחש אם לחץ זלוף הוא גבוה מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את הווריד נבוב בטן ובית חזה על מנת לאפשר לחיץ כדי לצאת באופן חופשי מהכבד. זה מונע נזק בחזרה בלחץ גבוה לLSECs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהכבד הוא ללא דם, להחליף PBS עם מקבע EM וינקב עבור כ 5 דקות, עד שהכבד קשוח ומאוד חיוור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק זלוף ולחתוך את הכבד הקבוע ל1-2 מ&quot;מ 3 בלוקים באמצעות אזמל חד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה שלאחר תיקון במקבע EM ל24-72 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: באופן כללי, underfixation גורמת יותר מאשר חפצי overfixation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות מקבע הבאים תקופה שלאחר תיקון לחיץ 0.1 cacodylate M נתרן לאחסון ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: דוגמאות מאוחסנות בדרך זו תישמר לתקופה משמעותית של זמן (עד 12 חודשים), קיבעון המשני בזמן זאת ובדיקה מומלצת לתוצאות הטובות ביותר. </li></ol> 3. המחט Perfusion הערה: קיבוע מחט הנו נגזר של קיבעון זלוף שכרוך בהזרקה של מקבע ישירות לתוך רקמת כבד ביופסיה. המטרה היא למקבע להיות סמוקה דרך כלי הדם כדי לגרום לדימום המחודש ולחשוף את כל גוש הרקמה למקבע. יש להקפיד לשמור על לחץ הזרקה נמוך, כדי למנוע פגיעה בלחץ 18,19. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חתיכה קטנה של כבד מבעלי החיים או הנושא ולשטוף בתמיסת מלח כדי להסיר דם ופסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר מלח הרגיל למצויד במחט עדינה מד (בדרך כלל מזרק אינסולין) מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק המלוח מאוד לאט לתוך הכבד עד דם סמוק מהרקמה. זריקות מרובות ייתכן שתידרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את מקבע EM למצויד במחט עדינה מד (בדרך כלל מזרק אינסולין) מזרק אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק מקבע מאוד לאט לתוך הכבד עד שהוא הופך קשה ושיזוף בצבע. הזרקה מרובהים עשוי להידרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הכבד הקבוע ל1-2 מ&quot;מ 3 בלוקים באמצעות אזמל חד. דגירה במקבעת EM ל24-72 שעות 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים ב 0.1 חיץ cacodylate M נתרן לפני תחילת קיבעון המשני. </li></ol> 4. הכנה לסריקה מיקרוסקופית אלקטרונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם לשטוף 3 פעמים במאגר cacodylate 0.1 M נתרן. כדי לתקן שומנים, לאחר לתקן את המדגם ב 2% tetroxide אוסמיום במאגר cacodylate 0.1 M נתרן לשעה 2. הערה: שטיפה מלאה היא מאוד חשובה כמו צלב tetroxide glutaraldehyde ואוסמיום להגיב וליצור חפצים על SEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הדגימות בהגדלת ריכוזים של אתנול להתחיל התייבשות. שטיפה ראשונה באתנול 50% במשך 5 דקות; 3 פעמים ולאחר מכן ל5 דקות עם 70% אתנול; לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות עם 90% אתנול; לשטוף 2 פעמים במשך 5 דקות ב 100% אתנול; ולבסוף לשטוף 2 פעמים במשך 10 דקות ב 100% אתנול (מסננת מולקולרית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל אתנול מהדגימות<html> ולהחליף עם hexamethyldisilazane (HMDS) בfumehood ולהשאיר למשך 10 דקות. הסר HMDS מדגימות הרקמה ולאפשר להתאדות. הערה: HMDS הוא hygroscopic מאוד כאשר קר ולכן מאפשרים להגיע RT לפני השימוש לצעד התייבשות סופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, הר הדגימות באופן מיידי או להכניס אותם לתוך תא ייבוש עד מוכן לעלות לSEM. </li></ol> 5. הרכבה הערה: הרכבת דגימה נכונה תהיה למקסם את מספר sinusoids מסומן בצורה ברורה לניתוח תחת SEM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית הבסיס של ספחי SEM מתכת ולהחיל קלטת פחמן מוליך דו-צדדית לחלק העליון של הספחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו דגימות באמצעות מיקרוסקופ לנתח לזהות את פני השטח עם sinusoids הטוב ביותר עבור SEM שלאחר מכן. מניחים משטח שכלפי מעלה על פני השטח קלטת פחמן של הבדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מקל היטב לבדל, דגימות מוכנות לציפוי גמגום עכשיו. </li></ol>&gt; 6. ציפוי ove_title &quot; הערה: ציפוי הדגימה עם סרט משובח של מוליך מתכת (זהב או פלטינה) בטענת coater גמגום הדגימה ומגנה עליו מפני נזקי קרן האלקטרונים. אם הציפוי הוא מבנים עבים מדי של ריבית עשויים להיות מוסתרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספחי מקום לתא הוואקום של coater גמגום קנס האוטומטי, להגדיר את המצב לסיבוב וציפוי גמגום אוטומטי במשך 45 שניות. השתמש ציפוי פלטינה לעדין המפרט, אבל הזהב מתאים גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח שכבה דקה של צבע פחמן למשטחים החיצוניים של הדגימות כבד רכובים, נזהר שלא מעיל משטחי סינוסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדגימות מצופות בפלטינה וצבע פחמן התייבש הם מוכנים לתצפית על SEM. דוגמאות ניתן לאחסן בתא ייבוש. </li></ol> 7. שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני הסורק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים סורק ולחזור מיקרוסקופ כדי ואקום. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות נהלי הפעלה מיקרוסקופ רגילים להדמיה של דגימות על ידי החל בהגדלה נמוכה, להגדיל בהדרגה הגדלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא מיקרוסקופ מותאם כראוי לעבודת מרחק, גודל נקודה ואסטיגמציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו את שלמות קיבעון. אם LSEC הוא לרוב ללא תשלום מפערים ומכיל fenestrations מדידת 30-250 קוטר ננומטר זה בדרך כלל מצביע על כך שהכנת הדגימה הייתה מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם sinusoids מלא של פערים או נטול fenestrations הכנת הדגימה לא הייתה מוצלחת או שיש פתולוגיה המשמעותית. במקרה זה, פורס את המדגם בסכין גילוח עדין מאוד, ומשטחי חיתוך שכבה על גבי שכבה ונותחו לsinusoids הקבוע בהצלחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכ 15,000-20,000 × הגדלה לבחור משטחי LSEC שטוחים שהם ללא פסולת עם קיבעון טוב ובי fenestrations גלוי לעין (בדרך כלל מכיל לפחות 10 fenestrations). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור תמונות של לפחות 10 sinusoids לכבד, מאזורים השונים של בלוקים, באמצעות לפחות שני רחובות לכבד. דגימת 10 micrographs ב15,000 - 20,000 × הגדלה לכל בעלי חיים היא בדרך כלל מספיק לכימות של fenestrations להיות נציג של כל הכבד. </li></ol> 8. ניתוח הערה: תוכנת ImageJ אשר ניתן להוריד בחינם מNIH מנוצלת לכמת קוטר אשנוב ותדר <a href="http://imagej.nih.gov/ij">(www.imagej.nih.gov/ij).</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה הפתוחה J ולהגדיר את היקף שימוש בסרגל קנה המידה המוטבע בתמונה (צילום המסך 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכלי המצולע בImageJ, עקבות באזור השטוח של כל LSEC כוללים אזורי fenestrated וחלונות. פשוט לא זכר את צלחות המסננת כמו זה בטעות יהיה לנפח נקבוביות. תכלול כל חתיכות גדולות של פסולת שנמצאות על פני התא שעשויה להיות obscurifenestrations ng. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד קוטר אשנוב, לעקוב אחר קו בקוטר הארוך ביותר של כל אשנוב על ידי בחירה בכלי השורה, ולחץ על &quot;M&quot; כדי למדוד את הקו, ו&quot; ד &quot;(לצייר) למתוח את הקו בתמונה באופן קבוע. קו זה מוגדר כקוטר אשנוב. אורך הקו יהיה זמין כעת בתיבת תוצאות ImageJ (צילום מסך 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את כל הפערים שהם חורים גדולים יותר בציטופלסמה LSEC מעל 250 ננומטר, כמו גם fenestrations. פערים הם לעתים קרובות חפצים המשקפים זלוף העני או קיבעון, אולם פערים יכולים להתרחש גם כתוצאה ממחלה והרעילות. נתונים לפערים יהיו פטור מחישוב הפרמטרים אשנוב מאוחר יותר בניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האזור של פערים שאינם מעגליים צריך להיות מחושב על ידי התחקות סביב הפערים וחישוב השטח שלהם על ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבק את הנתונים מתיבת התוצאות בImageJ לתוך גיליון אלקטרוני Excel למעיל-הפרווהניתוח r. </li></ol> 9. חישובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוטר ממוצע = אשנוב הממוצע של כל קטרי אשנוב (לא כוללים פערים, שבו פערים ≥ 250 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשנוב אזור = πr 2, שבו r, הרדיוס, מחושב מקוטר fenestrations הבודד (r = ד / 2) הפערים, לא כולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקבוביות (%) = (Σ (πr 2) / שטח כולל ניתח - אזור Σ (פערים =)) (מיקרומטר 2)) × 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תדירות אשנוב = מספר כולל של fenestrations / (שטח כולל ניתח-Σ (שטח של פערים) (מיקרומטר 2). </li></ol> 10. הצגת אשנוב נתונים הערה: במידת האפשר, פרסומים כוללים כימות של נתונים אשנוב צריכים לכלול את הפרטים הבאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוטר אשנוב, עם הצהרה המאשר את מה שקטרי גבול שבו משמשים להגדרת fenestrations (בדרך כללבין 50-250 ננומטר), תדירות אשנוב (מספר / מיקרומטר 2) ונקבובי (%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצהרה המאשרת אם פערים נכללו בניתוח, גרף התפלגות תדירות קוטר אשנוב והמספר של כבדים, בלוקים, תמונות וfenestrations צריך להיכלל בניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., Arias, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Liver: Biology and Pathobiology. , 387-404 (2009).</li><li>Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+and+the+liver+sieve:+the+role+of+fenestrated+sinusoidal+endothelium+in+lipoprotein+metabolism,+atherosclerosis,+and+cirrhosis.">Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis.</a> Hepatology. 21, 863-874 (1995).</li><li>Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+sieve:+considerations+concerning+the+structure+and+function+of+endothelial+fenestrae,+the+sinusoidal+wall+and+the+space+of+Disse.">The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse.</a> Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).</li><li>Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+feeding+and+fasting+on+fenestrations+in+the+liver+sinusoidal+endothelial+cell.">The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell.</a> Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).</li><li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+serotonin+receptor-2B+rescues+small-for-size+liver+graft+failure+in+mice.">Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice.</a> Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).</li><li>Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Loss+of+Responsiveness+to+2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine+in+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells.">Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).</li><li>Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Old+age+is+associated+with+ultrastructural+changes+in+isolated+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).</li><li>Le Couteur, D. G., Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Calorie Restriction, Aging and Longevity. , 191-216 (2010).</li><li>McLean, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+pseudocapillarization+of+the+human+liver.">Age-related pseudocapillarization of the human liver.</a> J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).</li><li>Le Couteur, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudocapillarization+and+associated+energy+limitation+in+the+aged+rat+liver.">Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver.</a> Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+acute+oxidative+stress+on+the+ultrastructure+of+the+perfused+rat+liver.">The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver.</a> Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).</li><li>Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alcoholic+liver+injury:+defenestration+in+noncirrhotic+livers-a+scanning+electron+microscopic+study.">Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study.</a> Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).</li><li>Jamieson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+liver+sinusoidal+endothelium+in+a+baboon+model+of+type+1+diabetes.">Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).</li><li>Fraser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+perfusion+pressure+damages+the+sieving+ability+of+sinusoidal+endothelium+in+rat+livers.">High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers.</a> Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).</li><li>Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electron+microscopic+study+of+the+fenestrated+endothelial+lining+of+rat+liver+sinusoids.">An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids.</a> J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).</li><li>Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrastructural+characterization+of+the+endothelial+cell+in+the+rat+liver+sinusoid+under+normal+and+various+experimental+conditions,+as+a+contribution+to+the+distinction+between+endothelial+and+Kupffer+cells.">An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells.</a> J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).</li><li>Fahimi, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+and+immersion+fixation+of+rat+liver+with+glutaraldehyde.">Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde.</a> Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).</li><li>Wisse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+methods+for+electron+microscopy+of+human+and+other+liver.">Fixation methods for electron microscopy of human and other liver.</a> World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).</li><li>Vreuls, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jet-fixation:+a+novel+method+to+improve+microscopy+of+human+liver+needle+biopsies.">Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies.</a> Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).</li><li>Furrer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+reverts+age-related+capillarization+and+failure+of+regeneration+in+the+liver+through+a+VEGF-dependent+pathway.">Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OxLDL+induced+injury+and+defenestration+of+HLSECs+via+LOX-1.">OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1.</a> J Mol Endocrinol. , (2014).</li><li>May, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+model+for+conditional+induction+and+rescue+of+portal+hypertension+reveals+a+role+of+VEGF-mediated+regulation+of+sinusoidal+fenestrations.">A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations.</a> PLoS One. 6 (7), e21478 (2011).</li><li>Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+can+act+as+vascular+permeability+factor+in+the+hepatic+sinusoids+through+upregulation+of+porosity+of+endothelial+cells.">VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).</li><li>Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD47-binding+peptide+of+thrombospondin-1+induces+defenestration+of+liver+sinusoidal+endothelial+cells.">The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells.</a> Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).</li><li>Wack, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinusoidal+ultrastructure+evaluated+during+the+revascularization+of+regenerating+rat+liver.">Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver.</a> Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).</li><li>Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sinusoidal+wall+permeability+and+liver+fatty+change+after+two-thirds+hepatectomy:+An+ultrastructural+study+in+the+rat.">Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat.</a> Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).</li><li>Straub, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic-stimulated+liver+sinusoidal+capillarization+in+mice+requires+NADPH+oxidase&#8211;generated+superoxide.">Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase&#8211;generated superoxide.</a> J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).</li><li>Barber&#225;-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+changes+in+endothelial+cells+of+developing+rat+liver+in+the+transition+from+fetal+to+postnatal+life.">Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life.</a> JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).</li><li>Jamieson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caloric+restriction+reduces+age-related+pseudocapillarization+of+the+hepatic+sinusoid.">Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid.</a> Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperlipidemia+and+surfactants:+the+liver+sieve+is+a+link.">Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link.</a> Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+oxidative+stress+on+the+liver+sieve.">The effects of oxidative stress on the liver sieve.</a> J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).</li><li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations.">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li><li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells.">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li><li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy.">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

היכולת מדויקת וreproducibly למדוד את מעמדו של האנדותל סינוסי הכבד היא צעד חשוב בהבנת הביולוגיה של תאים מאוד מיוחדים אלה. טכניקות חדשות כגון מיקרוסקופיה המובנה התאורה 32, מיקרוסקופיה כוח אטומית 33 וד-STORM (ישיר סטוכסטיים אופטי Reconstrucion מיקרוסקופית) 34 תהיה להקנ...

תאי הכבד סינוסי האנדותל (LSECs) הם מאוד תאי האנדותל מובחנים המרפדים את הקיר של סינוסואידה הכבד. LSECs הם מחוררים עם fenestrations ש- diaphragmed עישון, transcellular נקבוביות 50-250 ננומטר בקוטר. עד 20% מהשטח של LSECs מכוסה על ידי fenestrations, שהם בדרך כלל בקבוצות של עשרות עד מאות נקראים צלחות מסננת 1-3 (איור 1). Fenestrations לאפשר העברה של פלזמה וnanosubstrates בין הדם וhepatocytes, יצירת מערכת אולטרה סינון יעילה ביותר. Fenestrations הם מבנים דינמיים - שניהם בגודל ו / או מספר ניתן לשנות בתגובה למצבים שונים פיסיולוגיים, תרופות, ומחלות. לדוגמא, fenestrations גדול יותר בצם מאשר במדינה נמאס 4; 2-די-iodoamphetamine מגדיל מספר אשנוב; 5,6 וירידה בגודל ובמספר fenestrations לכל תא מתרחש במדינות הזדקנות ומחלות רבות 7-13 </sup&gt;. מדידה מדויקת של הגודל ומספר fenestrations חשובה להבנה כיצד מורפולוגיה LSEC מושפעת מחלה שונות, רעילה, ומדינות פיסיולוגיות; ההשפעה שלהם על תפקוד כבד; ולפיתוח אשנוב-ויסות התערבויות טיפוליות 1. המחקר של fenestrations קשה. הקוטר של fenestrations נמצא מתחת לרזולוציה של מיקרוסקופ אור הרגילה, כך במיקרוסקופ אלקטרונים רק בעבר תצפית באמצעות שני בLSECs רקמת כבד או מתורבתת שלם היה אפשרי. מיקרוסקופ האלקטרונים הסורקים (SEM) יש בתדירות הגבוהה ביותר נעשה שימוש כדי ללמוד גודל אשנוב, תדירות ונקבובית (אחוז קרום LSEC שהוא מחורר ידי fenestrations) כי SEM מאפשר התצפית של שטחים גדולים של פני השטח האנדותל והמדידה של אלפים, אם לא עשרות אלפים fenestrations. למרות השירות שלה, את התוצאות המדווחים מSEM מבוססות מחקרים לפרמטרים LSEC כגון גודל אשנוב, מספר, תדירות ונקבובית להשתנות במידה רבה בספרות (טבלת 1). Fenestrations וצלחות מסננת הן מבנים שבריריים שחוזה, לשבור, להתרחב או להתגבש במהלך הכנת דגימה, יש צורך בעיבוד ובכך הקפיד לשמור על שלמותם. לחץ זלוף גבוה 14; osmolarity שגויה של מקבע ומאגרים 15; קיבעון לקוי או קיבעון זמן; ומהירות של התייבשות לאחר קיבוע-וייבושם בכל תחומי העיבוד לSEM שעשוי לייצר חפצים המפריעים לשימור ultrastructure (איור 2). אובדן fenestrations (&#39;defenestration&#39;) והצטמקות אשנוב יכול להתרחש כתוצאה מקיבעון עני, וכתוצאה מכך קוטר אשנוב מופחת ונקבובי תא. שיטות כדי לשפר את השימור של דגימות לניתוח SEM תוארו בעבר 15-17 ותידוננהכאן עם טיפים נוספים על איך לשפר את שימור דגימה. המטרות העיקריות של שימור הדגימה הן להסיר דם מsinusoids כך את פני השטח של LSEC ניתן דמיינו וכדי למנוע נזק LSEC משני בלחץ גבוה או קיבעון מתעכב. זלוף הכבד השלם של מקבע דרך וריד הפורטל הוא השיטה המועדפת לקיבוע כבד. כפי שתואר בפירוט במקום אחר 16,18 זלוף חייבת להתבצע בלחץ נמוך (למשל 10 סנטימטר של H 2 0), כדי למנוע חפצי זלוף הקשורים ללחץ ונזק לLSEC, בא לידי ביטוי בדרך כלל פערים גדולים כמו בקרום התא. עם זאת, לעתים קרובות ניתן להשיג קיבעון סביר באמצעות זלוף מחט של ביופסית כבד מבני האדם ובעלי חיים, כפי שתואר בפירוט במקום אחר 19. טכניקה זו כרוכה בהזרקה ישירות מקבעת לתוך הרקמה עד דם סמוק מתוך המדגם והרקמות היא מוצקות וקבוע. קיבוע של דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים צריך להיות Performed מהר ככל האפשר הבא הפסקת זרימת דם למניעת שינויי ultrastructural מתרחשים כתוצאה מתהליכי הכבדים autolytic מאוד מהירים. כמו כן, אנו מציגים שיטה של ​​ניתוח תמונה שממזער את ההכללה של חפצים, וסטנדרטיזציה מדידת fenestrations. וריאציה בבחירת sinusoids לmicrographs, ניתוח תמונה של חפצים, ומדידה של שטח תא לתדר נקבוביות ואשנוב הובילו לפערים גדולים בתוצאות שפורסמו. גישה סטנדרטית להערכה ומדידה של fenestrations ודרישות מינימום להצגת נתונים שלא טופלה באופן ברור בספרות בעבר 4,10,20-31.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="658">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Name of material</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:93px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:311px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">EM grade Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C001</td>
			<td style="width:311px;">Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Paraformaldehyde powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td style="width:311px;">Always prepare Paraformaldehyde fresh</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:155px;">Sodium Cacodylate powder</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C0250</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:155px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">C1016</td>
			<td style="width:311px;">Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:155px;">Osmium tretroxide</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td style="width:93px;">C011</td>
			<td style="width:311px;">Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Ethanol- Absolute</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>459836&#160;</td>
			<td style="width:311px;">100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Other grades of Ethanol</td>
			<td style="width:100px;">Labtech</td>
			<td style="width:93px;">EL5</td>
			<td style="width:311px;">Prepare graded Ethanols with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Hexamethyldisilazane</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>52619&#160;</td>
			<td style="width:311px;">Allow to reach room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:155px;">Cannulas</td>
			<td style="width:100px;">Terumo</td>
			<td style="width:93px;">TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td>
			<td style="width:311px;">18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:155px;">Conductive Carbon tape</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>IA0201</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Carbon Paint</td>
			<td style="width:100px;">ProSciTech</td>
			<td>I003</td>
			<td style="width:311px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Ketamine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be optained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Xylazine</td>
			<td style="width:100px;"></td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td style="width:311px;">Must be obtained under licence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:155px;">Molecular Sieve</td>
			<td style="width:100px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:93px;">208647</td>
			<td style="width:311px;">Removes water from the 100 % Ethanol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a standardized method for the analysis of liver sinusoidal endothelial cells and their fenestrations by scanning electron microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

הדמיה ראשונית בהגדלה נמוכה על ידי סריקה מיקרוסקופי אלקטרונים מגלה משטח שטוח של דגימת הכבד בשטח חשוף גדול מספיק כדי להתבונן רבים כלי כבד גדולים וsinusoids (איור 1 א). הבטחת מיקום בלוק כבד נכון על בדל ההרכבה היא חיונית לקבלת תמונות ברורות של sinusoids והכמוסה של Glisson של ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy at JoVE.com

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

סטנדרטי שיטה לניתוח של תאי הכבד סינוסי האנדותל וFenestrations על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

a-standardized-method-for-analysis-liver-sinusoidal-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Views.  University of Sydney and Concord Hospital. The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Video: A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

לימוד ההסתדרות המולקולרית של פוטוסינתזה ממברנות בתוך הרקמות ליף Freeze-שבר ידי Cryo-סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הפרוטוקולים (SEM) עבור בעייתי הצמח, Oomycete, וכן דוגמאות פטרייתיים

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

זרימת עבודה טומוגרפיה של מערך לרכישה ממוקדת של מידע אודות אמצעי אחסון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

סריקת בלוק-פנים טורית מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) של דגימות רקמה ביולוגית

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...