SS ממומן על ידי מלגה קלינית Wellcome Trust ביניים, CW על ידי קרן Wellcome תכנית גרנט.

1. Microslide הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precoat microslide שישה ערוץ עם סוג קולגן עכברוש זנבי (RTC, בדילול מלא PBS 1:100 נותן דילול עבודה של 220 מיקרוגרם / מיליליטר). זה מבוצע על ידי הזרקת 30 μl של פתרון RTC המדולל ישירות לערוצים ודוגרים במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, ואחרי שלושה שוטף עם PBS. </li></ol> 2. זריעת תאים בMicroslides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את בקבוק מחוברות T75 של תאים בתרבית אדם כבד סינוסי אנדותל (HSEC) (מבודד מרקמת כבד כפי שתואר לעיל 13) בטריפסין-EDTA, לשטוף ב-PBS, ו resuspend ב 3 x 10 6 תאים / מיליליטר בתקשורת מלאה (אנדותל אנושי תקשורת הבסיסית בתוספת 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 100 U / ml פניצילין וסטרפטומיצין 100μg/ml, 10% בסרום אנושי חום מומת AB, 10 / מיליליטר ng של גורם גדילת אנדותל כלי דם ו10 / מיליליטר ng של גורם גדילת hepatocyte). הזרק 30 μl של השעיה תא נואשctly לכל ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר תאים לדבוק במשך שעה 1 בחממה humidified על 37 ° C עם 5% CO 2 אווירה על מדף שקופיות. לאחר שנתן לתאים לדבוק למלא את היציאות בכל צד של כל ערוץ עם מדיום שלם (איור 1). </li></ol> 3. ציטוקין גירוי של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצאת מתאים בחממה ל24 שעות. להעריך את צמיחת תא באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך. 24 שעות לפני assay הידבקות, לעורר monolayers אנדותל עם ציטוקינים על ידי החלפת תקשורת הצמיחה עם תקשורת מלאה בתוספת גידול הגורם נמק אלפא ואינטרפרון גאמא, הן ב10 ng / ml. </li></ol> 4. בידוד של הדם ההיקפיים לימפוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד ימפוציטים דם היקפיים מכל דם בתחילה על ידי מטהר את שבריר מונונוקלארים ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות על תקשורת צנטריפוגה הפרדת התא מתאימה ל25 דקות ב800x גרם. דגירה התאים על פלסטיק במשך שעה 1 כדי לאפשר היצמדות של מונוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות דבקות לשאוב פלסטיק הלימפוציטים מועשרים supernatant. שטוף את לימפוציטים וresuspend אותם (בדרך כלל 1 x 10 6 תאים / מיליליטר בזרימה בינונית (תקשורת הבסיסית האנדותל מכילה 0.1% (v / v) אלבומין בסרום שור (BSA)). </li></ol> 5. טיפול מקדים של האנדותל או leucocytes עם המעכבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילולים מומלצים של נוגדני פונקציה חוסמת או מעכבי מולקולה קטנים ב% media/0.1 אנדותל (V / V) BSA. החלף בינוני להשלים עם חסימת פתרון נוגדן / מעכב בערוץ microslide נבחר 30 דקות לפני לזרום assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפה הטיפול המקדים של קולטני chemokine על לימפוציטים מסוג מתוכנן, resuspend leucocytes המבודד בפתרון RPMI מכיל 0.1% (v / v) BSA ודגירה עם 200 / מיליליטר ng של רעלן שעלת לחסום את פעילות קולטן מצמידים G-חלבון של קולטני chemokine; לחלופין לדלל ספציפי פונקציהחסימת נוגדנים או מעכבי מולקולה קטנים של קולטני chemokine בדילול מומלץ. דגירה leucocytes על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ואז לשטוף וresuspend בזרימה בינונית. </li></ol> 6. התקנה של מערכת Assay זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm תא שקוף תרמוסטטית מבוקר ל37 ° C. החדר צריך להיות יציאות להחדרת צינורות סיליקון ואספקה ​​אלקטרונית לשסתום סולנואיד אלקטרוני המאפשר מיתוג בין תאים ותקשורת עם כמעט ללא נפח מת. הקאמרית הוא רכוב על מיקרוסקופ הפוכה כדי לאפשר למיקרוסקופ לעומת שלב. איור 2 מדגים את תא הזרימה assay ומיקרוסקופ וmicroslide להציב על הבמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מראש מזרק זכוכית 50 מיליליטר עם מנעול luer עם 10 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים ולצרף באורך של צינורות סיליקון 25 סנטימטר ליציאת המזרק. הכנס במשאבת מזרק. לשנות את קצב הנסיגה של משאבת המזרק פיהוראות יצרן microslide כדי לשמור על לחץ גזירה של 0.05 אבא (0.5 דיין / 2 סנטימטר, איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח שני 5 מיליליטר מזרקים, לבטל את הבוכנות ולצרף את החביות לשתי יציאות בזרימה של שסתום סולנואיד אלקטרוני באמצעות צינורות סיליקון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף 12 סנטימטר של צינורות סיליקון למחוץ זרימת השסתום. השסתום מאפשר התחלפות בין חיץ סלולרי בחינם לשטוף (% media/0.1 אנדותל (V / V) BSA) וההשעיה לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את שסתום סולנואיד האלקטרוני על ידי הוספת חיץ לשטוף בשתי חביות המזרק ולהבטיח חיץ זורם מחבית אחת דרך השסתום ולתוך צינורות סיליקון מחוץ לזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בבורר שסתום החלופי לחבית אחרת ולהבטיח את החיץ זורם ושכל הבועות יוסרו מהמערכת. הסרת חיץ לשטוף מאחת החביות ולהחליף עם איור 4 א השעיה לימפוציטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את טובין סיליקוןg ממשאבת המזרק ליציאה אחת של ערוץ microslide נבחר באמצעות מתאם microslide. ואז לחבר את צינורות סיליקון משסתום יצוא לנמל ההפך באמצעות מתאם microslide. ודא שצינורות סיליקון והמתאמים מלאים חיץ לשטוף לפני חיבור כדי למנוע בועות אוויר שנכנסו למערכת (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמחובר למערכת הזרימה, הנח את microslide על הבמה מיקרוסקופ ולצרף עם קליפים או קלטת כדי למנוע תנועה. הגדר את המיקרוסקופ למטרת 10X יחד עם הגדרת השלב המתאימה. ודא monolayer האנדותל הוא מדמיין ובפוקוס באמצעות עדשת העין. יכולות להיות שנתפסו להבטיח תמונות באמצעות מצלמה שמחוברת למיקרוסקופ לפיה ניתן העבירו תמונות למוניטור וקליטות. </li></ol> 7. לזרום טכניקת Assay והקלטה של ​​הידבקות לניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנקב את שכבת האנדותל עם לשטוף חיץ עבור 2 דקות על ידי החל withdrawal של משאבת המזרק כדי להסיר כל פסולת או נוגדן חסימה מאוגד ולאחר מכן לעבור את השסתום כדי לאפשר בולוס 5 דקות של פתרון יקוציט במתח קיר גזירה מתמיד של 0.05 אבא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך 2 דקות האחרונות של בולוס יקוציט, להקליט 10 שדות אקראיים לאורכו של microslide. זה מאפשר ניתוח לא מקוון של מתגלגלים / קשירת הלימפוציטים על monolayer אנדותל. הקלט את כל שדה לכ 10 שניות לפני שעברתי לבא אחריו ולהבטיח כי הקלטות נעשות נגד כיוון הזרימה, כדי למנוע הקלטה באותו התא מתגלגל פעמיים ברצף מהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב בולוס יקוציט עם בולוס 5 דקות של חיץ לשטוף ידי החזרת השסתום למיקום ההתחלה שלה. במהלך 2 דקות האחרונות של בולוס זה לבצע את השלב שני על ידי בחירת הקלטה לפחות 10 שדות שנבחרו באקראי לאורכו של microslide. הקלט את כל שדה למשך כ 5 שניות לפני שעברתי לבא אחריו ולהבטיח כי monolayer אנדותל וleucoc חסידytes נמצא במוקד ברור. זה מאפשר ניתוח לא מקוון של הדפוס של הידבקות. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65, 859-873 (1991).</li><li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear.">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+forces+promote+lymphocyte+migration+across+vascular+endothelium+bearing+apical+chemokines.">Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines.</a> Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).</li><li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells.">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li><li>Aspinall, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16(+)+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium.">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li><li>Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR+3+activation+promotes+lymphocyte+transendothelial+migration+across+human+hepatic+endothelium+under+fluid+flow.">CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow.</a> Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).</li><li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים

השלב הקריטי ביותר לביצוע זרימה assay הצלחה הוא להבטיח כי monolayer בריא ומחוברות של תאי האנדותל הוא מוכן לפני assay זרימת ההידבקות. תאי האנדותל ראשוניים יכולים להיות קשים לתרבות ורגישה לשינויים בשיטות culturing. חשוב ש1) זרימת תאים הם מצופים כראוי ואחיד עם תאי אנדותל בשכבה; לHSEC להשתמש בסוג קולגן זנב חולדה אני אבל זה עשוי להיות שונה לאוכלוסיות אנדותל אחרות, 2) תרבות בינונית מתאים לסוג התא, עבור HSEC שתארנו בינוני המלאה שלנו בקטע הפרוטוקול. צעדים חיוניים אחרים כוללים הגדרת משאבת המזרק בקצב המתאים כדי לשקף את הרמות פיסיולוגיות של מאמץ גזירה. במהלך הזרימה assay זה הכרחי כדי למנוע בועות אוויר בתוך הזרם במעגל אשר עלול לגרום נזק monolayer אנדותל או רצועת תאים חיסוניים מפני שטח אנדותל. זה ניתן למנוע על ידי enSuring שכל צינורות סיליקון ומתאמי perfused עם חיץ לשטוף לפני חיבור, שכל בועות האוויר יוסרו ושהתקשורת prewarmed לפני השימוש. בעת חיבור המתאמים ליציאות בmicroslide זה מאוד חשוב שיש ממשק נוזל / נוזל במהלך חיבור, אם יש אוויר אז זה יהווה פער אוויר בתוך המערכת שתשבש את monolayer אנדותל בזמן נסיגת המזרק צעד. פתרון יקוציט בחבית המזרק צריך תסיסה קבועה על מנת להבטיח שהתאים לא להתפשר, ובכך שמירה על צפיפות תאים קבועה לאורך כל הניסוי. במהלך שלבי ההקלטה חשוב כדי להבטיח את דמותה של שכבת האנדותל היא כראוי ממוקדת וברורה, כדי לאפשר ניתוח מחובר מדויק, וכי במהלך השלב השני של הזרימה assay (בולוס יקוציט הודעה) שמספיק זמן נותר במהלך לשטוף החיץ שלב לפני ההקלטה התחדש על מנת להבטיח כיכל leucocytes nonadherent יוסרו. כמו כן זה הכרחי להשתמש בתאי אנדותל בשכבה של צפיפות המתאימה כדי למנוע אובדן של תאים אשר יכול להפריע לדפוסי זרימה בנימי דם צרים וגם יכול להיות קשה להבחין מleucocytes חסיד גדול יותר תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. יש לנו תארנו צפיפות זריעה אופטימלית לתאי אנדותל סינוסי כבד אנושיים, אבל עשוי להשתנות בין אוכלוסיות שונות אנדותל ומינים. התקדמות משמעותית נעשתה בלימוד גיוס יקוציט במודלים של בעלי חיים עם מיקרוסקופיה intravital. היתרון העיקרי של שיטת assay זרימת ההידבקות הוא שגיוס יקוציט ניתן ללמוד במערכת בינארית עם תאי אנדותל אנושיים ראשוניים. יתר על כן, ניתן ללמוד האינטראקציות הללו תחת רמות רלוונטיות הפיזיולוגיות של מאמץ גזירה. זה חשוב כדי לאשר את הממצאים של מחקרים בבעלי החיים intravital עם מערכות סלולריות אדם כייתכנו differences בנכסי אנדותל בין מינים. אחת המגבלות של הזרימה assay הוא שגיוס יקוציט נחקרת בסביבה חד תאית של monolayer אנדותל. בנוסף פעם אחת leucocytes יש דבק וtransmigrated פני האנדותל שהם לא יכולים להיות בהווה במספרים מספיקים כדי להיות מבודדים וחשוף לתהליכים במורד הזרם. למרות מגבלות אלה, ברגע שassay זרימת ההידבקות כבר שולט בו ניתן לפתח לבצע ניתוח נוסף של מפל הידבקות יקוציט ומותאם לשחזר את הסביבה תאית. הקלטה ממושכת של שדות יחיד והשימוש בתוכנת מעקב יכולה לשמש גם כדי לנתח את ההתנהגות של leucocytes זחילה. יתר על כן עם השלמת הזרימה assay יכול להיחקר microslides באמצעות מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר וסימון immunofluorescent ללמוד הידבקות וגלגול ביתר פירוט. בנוסף, יש לנו לפתח בעבראד מודל במבחנה שבי leucocytes זורם יכולים לקיים אינטראקציה עם האנדותל בכבד המותנה בנוכחות של הפטוציטים. assay זה גם יכול להיות שפותח כדי ללמוד אוכלוסיות של leucocytes: הקבוצה שלנו ביצעה מחקרים עם תת כגון תאי T רגולטורים, תאי B, וleucocytes כבד הסתננות. מחקרים אלה הם הוכחה לכך שassay זרימת ההידבקות הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור גיוס יקוציט ספציפי בכלל ואיברים במערכות אנושיות.

עכשיו זה מבוסס היטב כי גיוס יקוציט באופן כללי כדלקמן הפרדיגמה של מפל הידבקות הרב שלבי 1. זה כרוך בלכידתו של leucocytes מזורם דם על ידי תאי האנדותל המצפים את דפנות כלי הדם. בתחילה, leucocytes לעבור צעד מתגלגל שמתווך על ידי קולטנים selectin או חברי superfamily אימונוגלובולינים. זה מאפשר קולטני G-חלבון בשילוב (GPCRs) הביע על פני השטח יקוציט כדי להיות מופעלים על ידי כמוקינים מוצגים על glycocalyx אנדותל. זה מוביל לשינוי של אישור integrin למדינת &#39;זיקה גבוהה&#39; על פני השטח יקוציט ולעצור והידבקות משרד לאנדותל. הידבקות המשרד בעקבות כך על ידי שינוי צורה וזחילה של יקוציט על כלי השיט. השלב האחרון הוא גלגול דרך monolayer אנדותל, אשר יכול להתרחש דרך נתיבי paracellular או transcellular. בעוד מפל הידבקות הרב שלבי לתארשל המנגנון הכללי של גיוס יקוציט בתוך הגוף יש הבדלים ספציפיים איברים. בכבד רוב גיוס יקוציט מתרחש בתוך sinusoids בכבד בניגוד לאיברים אחרים שבו גיוס בדרך כלל מתרחש בתוך venules פוסט הנימים 2. Sinusoids הכבד הם סביבת גזירה נמוכה וleucocytes לעבור צעד קשירה קצר לפני למצק הידבקות אשר selectin 2 עצמאיים. ערוצים אלה בשורה של האנדותל סינוסי בכבד שהוא רציף ומכיל fenestrae, הנקבוביות פתוח ננומטר 100-200 בקוטר, ואין קרום במרתף 3. הבהרת המנגנונים המולקולריים אשר מתווכים גיוס יקוציט פני האנדותל סינוסי כבד אנושי יכולה לזהות איבר מטרות טיפוליות ספציפיות למחלות כבד דלקתיות. מבחני הידבקות זרימה הם כלים חיוניים בלימוד גיוס יקוציט. הם מאפשרים השחזור של recru יקוציטitment בנוכחות של מתח גזירה לנתח הידבקות תחת כוחות מוגדרים היטב. השימוש התכוף ביותר עבור assay הוא הידבקות יקוציט המחקר לmonolayers אנדותל בתרבית או מצעים מטוהרים. זרימת תאים זמינים באופן מסחרי משמשים לינקבו תאים בתנאים של זרימה למינרית בין שני משטחים שטוחים ולאחר מכן לדמיין את התהליך הדינמי של הידבקות במיקרוסקופ 4. קבוצות קודמות הוכיחו כי אינטראקציות דבקים מסוימות להתרחש רק תחת זרם ולא ניתן ללמוד במבחנים סטטיים 5,6. יש לנו בשימוש בטכניקה זו כדי לשחזר את sinusoids הכבד וללמוד גיוס יקוציט בתנאים של לחץ גזירה נמוך. HSEC האנושי ראשוני בתרבית microslides וleucocytes אז יכול להיות perfused מעל monolayer זה בשיעור של זרימה מחושב לשחזר את מאמץ הגזירה בתוך sinusoids הכבד. מאמץ הגזירה הוא מתח שמוחל מקביל או משיק למשטח כמו מולosed למתח רגיל שהוא בניצב. כל נוזל שנע לאורך גבול יפעיל לחץ גזירה על גבול זה. מאמץ גזירה הוכח להיות מרכיב חיוני של גלגול הלימפוציטים 7. בתנאים אלה ניתן דמיינו בכל שלב של מפל ההידבקות על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב. שיטה זו אפשרה תובנות חשובות הגיוס של leucocytes בתוך הכבד, כולל המחקר של מולקולות הדבקות קונבנציונליות 8, את התפקיד של כמוקינים וקולטנים chemokine 9-11, ומולקולות הדבקות טיפוסיות כגון הידבקות כלי דם חלבון -1 (VAP-1 ) 8,12 והלימפה נפוצה וקולט-1 (פיקח-1) 13 האנדותל של כלי דם. בעוד assay זה כבר מוזכר בכמה מהפרסומים של הקבוצה שלנו, התיאור שלה היה קצר ואנחנו צריכים לקחת את ההזדמנות הזאת כדי לספק צעד מפורט על ידי מדריך צעד כדי לעזור בפתרון בעיות ולמנוע טעויות טכניות בעת ניסיוןing assay. יתר על כן, יש לנו לאחרונה שיניתי את המקור של תאי microslide המאפשר שינויים מדויקים בלחץ גזירה. אנו מאמינים כי זה מרחיב את תחולתו של assay לתאי האנדותל ואחרים של מערכת חיסון. השיטה הבאה מתארת ​​את ההכנה וטכניקה לביצוע assay הידבקות זרימה מבוססת עם תאים אנושיים בכבד סינוסי אנדותל וימפוציטים דם היקפיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

חדירת יקוציט לתוך רקמת כבד אנושית היא תהליך נפוץ בכל המחלות הכבד דלקתיות המבוגרים. חדירה כרונית יכולה לנהוג הפיתוח של סיסטיק והתקדמות לשחמת כבדה. הבנת המנגנונים המולקולריים המתווכים גיוס יקוציט אל הכבד יכולה לזהות מטרות טיפוליות חשובות למחלת כבד. האינטראקציה מפתח במהלך גיוס יקוציט היא זה של תאים דלקתיים עם האנדותל בתנאים של לחץ גזירה. גיוס אל הכבד מתרחש בתוך ערוצי גזירה הנמוך של sinusoids הכבד שקירותיו מכוסים על ידי תאים בכבד סינוסי אנדותל (HSEC). התנאים בתוך sinusoids בכבד יכולים להיות סכמו על ידי מרוסס leucocytes בערוצים בשורה של monolayers HSEC אדם בספיקות מסוימות. בתנאים אלה leucocytes לעבור שלב קצר קשירה ואחרי הפעלה והידבקות משרד, ולאחריו שלב זחילה וגלגול הבא פני אנדותלשכבה. באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב, ניתן דמיינו כל צעד של &#39;מפל הידבקות&#39; זה ונרשם ואחרי ניתוח מצב לא מקוון. תאי האנדותל או leucocytes ניתן קודם לכן במעכבי כדי לקבוע את התפקיד של מולקולות ספציפיות בתהליך זה.

Assay זה יש את היכולת לחזות את מפל זרימת הידבקות הרב שלבי ולהבהיר את המנגנונים מולקולריים שבבסיס על ידי השוואת תוצאות של ניסויי שליטה לאלה עם מעכבים מולקולריים. יכולות להיות סכמו מיטות כלי דם שונות על ידי שילוב של תאי האנדותל ספציפיים ושינוי תנאי לחץ גזירה. כל צעד של מפל ההידבקות ניתן לנתח במצב לא מקוון על ידי ביצוע שיטת ההקלטה שתוארה בפרוטוקול. הצעד הראשון של מפל ההידבקות הוא הגלגול של leucocytes אשר יכול לבוא לידי ביטוי כאחוז מתאים חסיד בסך הכל. ניתוח מנותק מאפשר מספר התאים חסיד להיות מנוי בכל שדה שנרשם במהלך בולוס יקוציט. השמעה של התמונה מאפשרת השוואה של תאים הנמצאים בתוקף חסיד ואלה שעוברים תנועה מתגלגלת על פני האנדותל. תנועת רולינג ניתן דמיינו באמצעות טכניקה זו, כל שדה שנרשם לפחות 10 שניות. תאים מתגלגלים מזוהים במהירות מופחתת שלהם על פני אנדותל לעומת זורם תאים. התנהגות זו חייבת להיות הפגינה במשך לפחות 5 שניות בלי ניתוק. מפל ההידבקות בתוך sinusoids הכבד מתרחש בסביבת גזירה נמוכה במחקרים vivo אישר מתגלגלת מינימאלי עם רק צעד קשירה קצר. יש לנו אישרו כי זרימת assay משקף את הסביבה של sinusoids בכבד על ידי הוכחת כי פחות מ10% מleucocytes חסיד בהתמדה להתהפך מגורה HSEC במבחנים אלה. הצעד הבא של מפל ההידבקות הוא הידבקות משרד. דבקות סה&quot;כ ניתן לחשב מהשלב השני של הקלטה במהלך בולוס לשטוף חיץ (שלב 7.3). ניתוח מנותק מאפשר את המספר הכולל של תאים חסיד בתקיפות שנספר בכל תחום (איור 5). תאים בתקיפות חסיד מוגדרים כתאים שאינם נייחים או shapechanged עם איטי התנהגות זחילה.המספר הממוצע של תאים לכל שדה ואז יכול להיות מחושב. לאחר מכן ניתן להשתמש נתון זה, בשילוב עם שטח הפנים הכולל של שדה הראייה (שנקבע תוך שימוש graticule או שווה ערך), ריכוז של לימפוציטים (בדרך כלל 1 x 10 6 תאים / מיליליטר) ואת קצב הזרימה להביע את המידה דבקות הלימפוציטים כתאים חסיד / מ&quot;מ 2/10 6 תאי perfused. לומד את הדפוס של הידבקות כרוכה בניתוח של שני השלבים האחרונים של מפל ההידבקות כולל לשנות צורה, זחילה וההגירה transendothelial. Leucocytes חסיד אל פני השטח העליונים של monolayer HSEC מופיע שלב בהיר בעוד אלה שהגרו דרך monolayer מופיע שלב כהה (איור 6). אז יכולים להיות מסווגים כתאים מציגים הידבקות &#39;סטטי&#39; (/ עגול nonmigrated), מורפולוגיה &#39;-שינה צורה&#39; או כ &#39;היגר&#39; וקטגוריות בודדות לאחר מכן הביעו כאחוז מאוכלוסייה הדבקה בסך הכל. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> איור 1. חד שכבתי של תאים ראשוניים בכבד אנושי סינוסי אנדותל בתוך תא זרימה. א) Microslides מלא בתקשורת המכילה monolayer של תאי האנדותל שקדמה לתחילת assay הידבקות זרימת תמונה בניגוד שלב. ב &#39;) של monolayer אנדותל מחוברות, צריכים להיות שנזרעו תאי אנדותל בmicroslide אשר precoated (לתאי אנדותל בכבד אנושיים הזה צריך להיות עם סוג קולגן עכברוש זנב 1) וזה חיוני כי תאי האנדותל בריאים בתרבות ובמחוברות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; src /&gt; איור 2. תא זרימת assay. הגדרת תא הזרימה assay ניתן לראות כאן, זה מורכב מתא שקוף שהוא רכוב על מיקרוסקופ הפוכה. דוד ממוקם בתא וצריך להיות מבוקר תרמוסטטית כדי לשמור על טמפרטורה של 37 ° C. לא צריך להיות יציאות זמינות לחיבור צינורות סיליקון מmicroslide בתוך התא למשאבת מזרק הנמצא בחוץ. Microslide ממוקם ישירות על הבמה מיקרוסקופ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> איור 3. מזרק משאבה. משאבת מזרק היא להתחברed באמצעות צינורות סיליקון לתא הזרימה. המשאבה מוגדרת שיעור נסיגה ספציפי בהתאם למאמץ הגזירה הרצוי הנדרש עבור assay. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> איור 4. חיבור שסתום לתא זרימה.) שסתום סולנואיד אלקטרוני מאפשר מעבר בין שתי חביות מזרק המכילות גם תאים או תקשורת עם כמעט ללא שטח מת. ב &#39;) ברגע שהשסתום הוא סמוק ושתי החביות מוגדרות, צינורות סיליקון מהשסתום מחובר לתא הזרימה. זה קריטי, כי בעת חיבור המתאם בצינורות סיליקון ליציאה בחדר הזרימה קיים ממשק נוזל / נוזל. &lt;target = &quot;_blank&quot; href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> איור 5. מדידה בסך הכל דבקות יקוציט. במהלך שתי דקות האחרונות של שלב בולוס לשטוף חיץ (כפי שתואר בפרוטוקול), מינימום של עשרה שדות אקראיים צריך להיות מוקלט. אלה ניתן לנתח את השורה ואת המספר הכולל של תאים חסיד בחוזקה ניתן לספור בכל תחום. הידבקות כוללת של leucocytes ניתן להשוות בין תאי בקרה ואלה קודם לכן בחסימת נוגדנים, הנה אנחנו מראים שדה נציג משקופית שליטה ושקופיות pretreated עם הידבקות תאית מולקולה-1 נוגדן חסימה (ICAM-1). חיצים נוספו כדי להדגיש את לויקוציטים חסיד, בייצוגיםtive שדה משקופית השליטה יש בסך הכל של 25 לויקוציטים המזוהה ובשקופית לחסום ICAM-1 יש בסך הכל של 13 לויקוציטים המזוהה. ברים סולם = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> איור 6. גם ניתוח של הדפוס של הידבקות יקוציט על משטחי אנדותל על ידי מיקרוסקופ לעומת שלב. ניתוח מנותק משדות שנרשמו יכול לשמש כדי לחקור את הכיוון ומהירות של הידבקות יקוציט. צעדים ספציפיים של מפל ההידבקות ניתן דמיינו ולכמת באמצעות הדמיה בניגוד שלב. תאים בהירים שלב שהם חסיד בחוזקה אך לא הופעל ניתן לכנות הידבקות &#39;סיבוב&#39;, התאים אשר הפעלד ובהיר שלב יכולים להיקרא &#39;צורה השתנתה&#39; והתאים שהם כהים שלב הם התאים שעברו הגירת transendothelial וניתן לכנות &#39;היגר&#39;. התמונה מציגה דוגמאות של כל דפוס של הידבקות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress at JoVE.com

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

גיוס יקוציט אל הכבד מתרחש בתוך הערוצים מיוחדים של sinusoids הכבד שקירותיו מכוסים על ידי תאי אנדותל סינוסי כבד ייחודיים. מיקרוסקופ לעומת השלב של גיוס יקוציט פני האנדותל סינוסי בכבד אדם בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי יכול להקל על הבהרת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליך זה.

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

a-flow-adhesion-assay-to-study-leucocyte-recruitment-to-human-hepatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K Views.  University of Birmingham.  גיוס יקוציט אל הכבד מתרחש בתוך הערוצים מיוחדים של sinusoids הכבד שקירותיו מכוסים על ידי תאי אנדותל סינוסי כבד ייחודיים. מיקרוסקופ לעומת השלב של גיוס יקוציט פני האנדותל סינוסי בכבד אדם בתנאים של לחץ גזירה פיסיולוגי יכול להקל על הבהרת המנגנונים ...

Video: A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

הדמיה הדבקה ליקוציט כדי האנדותל דם בלחץ גבוה Intraluminal

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

בידודו של האדם וריד טבורי תאים אנדותל והשימוש בהם לחקר גלגול נשמות נויטרופילים בתנאי זרימה

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

אדם נויטרופילים תזרים לשכת הידבקות Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

סטטי הידבקות Assay לחקר Integrin ההפעלה בT לימפוציטים

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

במבחנת in vivo המודל ללמוד הידבקות חיידקים לכלי השיט וול תנאי זרימה תחת

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...