Name: robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing at JoVE.com

The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

1. הכנת מערכת שלב שתי פולימרית מימית (ATPS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 0.5 גרם של פוליאתילן גליקול (PEG) (MW: 35,000) ולהוסיף אותו ל9.5 מיליליטר של מדיום גידול מלא בחרוטי 15 מיליליטר סטרילי כדי להכין 10 מיליליטר של 5% (w / v) שלב PEG המימי. הערה: הוספת מחצית בינונית לחרוטים הראשונים ואחרי הוספת הפולימר ולאחר מכן את יתרת הסכום של מדיום ממזער הידבקות של הפולימר לקירות חרוטי ומסייע הפולימר יתמוסס מהר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 0.128 גרם של dextran (DEX) (MW: 500,000) ולהוסיף אותו ל.872 מיליליטר של מדיום גידול מלא בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge סטרילי כדי להכין 1 מיליליטר של 12.8% (w / v) שלב DEX המימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת שני פתרונות לדקות על 1 לפזר הפולימרים במדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את שני הפתרונות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להבטיח פירוק ותערובות הומוגנית. שמור את הכובעים מעל פני המים, כדי למנוע האפשרות של זיהום של פתרונות מהאמבטיהמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את פתרון שלב PEG לתוך מזרק סטרילי, פלסטיק ולהעביר אותו דרך מסנן מזרק של גודל נקבובית 0.2 מיקרומטר כדי להסיר זיהומים. הערה: מלא את המזרק עם פתרון PEG, למקם אותו בהכנסה של המסנן על גבי צינור חרוטי ותוך שימוש בכוח, לדחוף את הפתרון באמצעות המסנן לאט. זה נורמלי לחוות התנגדות נגד תנועה של בוכנת המזרק. הפסד קטן של פתרון הפולימר מתרחש כחלק מהפתרון יישאר במסנן, אבל ריכוז הפולימר לא ישתנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של פתרון שלב DEX ולדלל אותו ב 10 μl של מדיום בצינור נפרד ללגרום 6.4% (w / v) פתרון שלב DEX. לשאוב מפתרון שלב PEG 100 μl ומוציא אותו לתוך צלחת פטרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 0.5 μl של 6.4% (w / v) פתרון שלב DEX לפתרון שלב PEG. חזותי לאשר הקמת ATPS מוצלחת על ידי התבוננות ירידת DEX תחת מיקרוסקופ. גבול הירידהצריך להישאר גלוי, המצביע על נוכחותם של שני שלבים יציבים, נפרדים מימי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את המניה המימית PEG ופתרונות שלב DEX ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הערה: מומלץ שפתרונות פולימר מוכנים טריים לפני כל ניסוי ושימוש בתוך 24 שעות של אחסון. </li></ol> 2. הכנה לSpheroids Cell ההדפסה של הסרטן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי סרטן של עניין (למשל, תאי סרטן השד מד&quot;א- MB-157) ל- 90% -100% monolayer מחוברות. למד&quot;א-MB-157 תאים, להשתמש בינוני מורכב DMEM המכיל 10% FBS, גלוטמין 1%, ואנטיביוטיקת 1%. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים באמצעות חיץ ניתוק תא (על פי הפרוטוקול של היצרן) ולטעון את ההשעיה לחרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה זה במשך 5 דקות ב173.3 XG, להסיר supernatant, ותאי resuspend ב 1 מיליליטר של מדיום גידול שלם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי עומס על hemocytometer ולספור אותם על מנת לחשב את המספר הדרוששל תאים לצפיפות תאי אליפטית רצויה. Monolayer ומחוברות של מד&quot;א-MB-157 תאים שגודלו בבקבוק T75 בדרך כלל נותנת ~ 7 x 10 6 תאים. הערה:. צפיפות תאים דרושה לירידת נפח כדי ליצור אליפטית אחת תהיה תלויה בסוג התא 22 לדוגמא, צפיפות של 1.5 x 10 4 או גדולים יותר למד&quot;א-MB-157 תאים מומלצת לכל טיפת שלב DEX 0.3 μl ל להבטיח היווצרות אליפטית יחידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה בפעם שנייה במשך 5 דקות ב173.3 XG וresuspend אותם בנפח מתאים של מדיום גידול להתרכז תלוי על צפיפות תאים רצויה. הערה: לדוגמא, אם 7 x 10 6 תאים סרטניים נקצרו, הנפח הכולל של השעיה תא הנדרשת ליצירת אליפטית של צפיפות 1.5 x 10 4 תאים בירידת שלב DEX 0.3 μl יהיה 140 μl. עם זאת, בשל דילול עם פתרון שלב DEX בשלב הבא, להשתמש רק 70 μl של מדיום תרבית תאים לresuspend תאים. </li><li&gt; הוסף להשעית תא וכתוצאה מכך נפח שווה של 12.8% (w / v) פתרון שלב DEX המימי ערוכים 1.2. לדוגמא אליפטית צפיפות 1.5 x 10 4 תאים, 70 μl של פתרון שלב DEX מתווסף 70 μl של השעיה תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב ביסודיות את ההשעיה התא על מנת להבטיח פיזור אחיד של תאים וערבוב של פתרון DEX. Pipetting למעלה ולמטה צריכים להיעשות בעדינות כדי למנוע היווצרות בועה. </li></ol> 3. הכנה לדפוס של Spheroids Co-תרבותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי סרטן (לדוגמא, מד&quot;א-MB-157 תאים אנושיים של סרטן השד) ותאי תמיכה (למשל, fibroblasts אדם) ל- 90% -100% monolayer מחוברות. לקצור כל סוג תא באמצעות חיץ ניתוק תא (על פי הפרוטוקול של היצרן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון כל השעיה לחרוטי 15 מיליליטר, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב173.3 XG, וsupernatant לשאוב מכל חרוטי. תאי Resuspend של כל חרוטי ב 1 מיליליטר של g המלאבינוני rowth. הערה: צבעי ניאון כגון Calcein AM (כתם תא חי) וצבעים גרעיניים (Hoechst) ניתן להשתמש כדי להבחין בין שני סוגי התאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון כל סוג תא בנפרד על hemocytometer ולספור אותם על מנת לחשב את המספר הנדרש של כל סוג תא ליחס רצוי של תאי סרטן לתאים תומכים בspheroids שיתוף תרבותי. monolayers המחוברות של מד&quot;א-MB-157 תאים וfibroblasts גדל בצלוחיות T75 בדרך כלל נותנים ~ 7 x 10 6 ו ~ 6 x 10 6 תאים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הנפח הנכון מההשעיה של תאים תומכים להשעיה תאים סרטניים לתת יחס רצוי של מספר שני סוגי תאים. לדוגמא, השתמש יחס של 50 תאים סרטניים לתאי פיברובלסטים 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חרוטי המכילים את ההשעיה התא המעורבת במשך 5 דקות ב173.3 תאי XG וגלולים בנפח מתאים ללגרום לצפיפות סופית הכוללות כמויות שווה של מדיום גידול ו12.8% (w / v) DEX המימיפתרון שלב (שהוכן ב1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה השעיה תא וכתוצאה מלמעלה ולמטה כדי להבטיח ההומוגניות של ההשעיה. </li></ol> 4. הדפסה של Spheroids גידול לתוך צלחת 96-היטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני ניסויים, צלחות מעיל שאינם מטופלים, מסביב לתחתית 96-היטב עם 1% (w / v) pluronic על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ציפוי זה מונע תא קובץ מצורף על פני תקופת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl 5% המסוננים (w / v) שלב PEG המימי לבאר כל צלחת 96-היטב (צלחת יעד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, לערבב את ההשעיה התא (מוכן בשלב 2 או שלב 3 למונה ותרבות משותפת, בהתאמה), ולהוסיף 20 μl של ההשעיה לכל זה היטב מעמודה של צלחת 384 גם אחד (צלחת מקור) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המטפל הנוזלי ו&quot; הביתה &quot;ראש pipetting לרשום קואורדינטות. לאחר מכן לאסוף פרוטוקול שהוגדר בעבר (להלן ב4.6) כדי להבטיח מעבדתי ופרמטרים מוגדרים נכוניםly. זה צעד &quot;מתביית&quot; עשוי להיות שונה עבור מפעילי נוזל שונים. הערה: הזרימה של הפרוטוקול, שמוצג צעד-אחר-צעד בהמשך ב4.6, יהיה דומה ללא קשר למטפל נוזל רובוטית משמש; עם זאת, ממשק תכנות עשוי להיראות שונה בשל השימוש בתוכנות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת המקור, צלחת היעד, ותיבות קצה פיפטה בעמדות מוגדרות בתחנת העבודה של המטפל הנוזלי כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את הפרוטוקול הכולל את השלבים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס עמודה אחת של חביות מהראש pipetting של המטפל הנוזלי עם ערבוב הטיפים פיפטה (8 טיפים) מתחנת העבודה (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את ההשעיה התא בבארות של צלחת המקור (איור 1). בחר ערבוב קטן יותר מתא ההשעיה הנפח בבארות כדי למנוע היווצרות בועת נפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא טיפים לתיבה ריקה טיפים פסולת (איור 1). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס עמודה אחת של חביות מהראש pipetting עם טיפים פיפטה מחלק 10 μl (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב 0.3 μl של ההשעיה התא מצלחת המקור (איור 1) לכל קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר ההשעיה התא לתוך בארות של טור של צלחת יעד אחד (איור 1). השתמש בגובה לוותר של 0.5 מ&quot;מ וקצב זרימה לוותר של μl הקטן מ 1 / sec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 4.6.1 באמצעות 4.6.6 עד הדפסת טור-by-טור לכל צלחת היעד היא מלאה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את צלחת היעד ממשטח העבודה ולשים אותו בחממה לחה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לשמור אופקי צלחת כאשר נשא אותה לחממה כדי למנוע שיבוש של טיפות שלב DEX המכילות תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת למשך 24 שעות כדי לאפשר צבירה של תאים לתוך אליפטית בתוך טיפת שלב DEX. </li></ol> &lt;class = &quot;jove_title&quot; p&gt; 5. טיפול התרופתי של Spheroids תאים הסרטני שימו לב כי בפרוטוקול הבא הוא לטיפול תרופתי 4 ימים ויכלול את חידוש בתרופה טרי לאחר יום 2. זה יכול להיות שונה לתקופות טיפול אחרות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזותי לאשר היווצרות אליפטית ב96-גם צלחות לאחר 24 שעות. במידת הצורך, בארות תמונה למדידת הגודל של spheroids על ידי ממוצע הקטרים ​​הקטנים ביותר והגדולים ביותר של כל אליפטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון המניות של תרופה רצויה על ידי המסתו בממס המומלץ על ידי היצרן בריכוז מסיסות שנקבע מראש. לדוגמא, לפזר ציספלטין במים ב2 מ&quot;ג / מיליליטר. הערה: הגן על פתרון המניות של התרופה מהאור אם התרופה היא רגישה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטכניקת דילול סדרתי, להכין ריכוזי תרופה מדוללים עם מדיום תרבית תאים ממניות הפתרון מוכן בשלב הקודם. כל דילול צריך להיעשות פעמיים הריכוז הרצוי. דיליחסי ution ישתנו בהתאם לריכוז המניה מתחיל ורצויים ריכוזים עובדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון תרופה שהוכן בשלב הקודם לכל אחד. ניתן לעשות זאת על ידי רובוט או pipetting הידני. הערה: כל ריכוז תרופה יהיה מדולל במחצית לריכוז הרצוי על ידי שלב PEG המימי 50 μl כבר בכל טוב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש spheroids משני טורים של צלחת 96-היטב (n = 16) עבור כל ריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבארות שליטה, להוסיף רק 50 μl של מדיום תרבות טרי 50 μl הקיים של שלב PEG המימי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה spheroids עם התרופה במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, מוגנות מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות של דגירה, להכין דילולים טריים של התרופה בריכוזים רצויים ולחדש את התרופה על ידי הוספת 50 μl של פתרון תרופה טרי היטב כל אחד. הערה: הבארות כבר מכילות ריכוז התרופה הרצויה מt התרופה הראשוןreatment. לכן בשלב זה חידוש, כל ריכוז הנו מוכן בריכוז הרצוי שכן אין דילול יתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה spheroids עם התרופה לעוד שעה 48 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, המוגנת מפני אור. </li></ol> 6. ניתוח סלולרי ליכולת הקיום בSpheroids <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 48 שעות של דגירה עם תרופה מחודשת (כלומר, זמן כולל של טיפול בspheroids עם סמים הוא 4 ימים), למדוד את הנפח הכולל של מדיום באחד היטב על ידי pipetting הידני. הערה: נפח אופייני ובאחד הוא ~ 140 μl (ירידה קטנה מתרחשת עקב אידוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הנפח של מגיב תא כדאיות (למשל, PrestoBlue) כריכוז של 10% מכלל גם הנפח. הוספת נפח זה של מגיב כדאיות תא היטב כל אחד. הערה: עם קיים נפח תקשורת של 140 μl בבאר, בהיקף של 15.6 μl נדרש לתת ריכוז של 10% מכלל תושבי עיר היטב. זה מחושב על ידיהחלוקה הקיימת תקשורת על ידי 9 (140 μl / 9 = 15.6 μl) הנפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת עם מגיב כדאיות תא מתווסף גם כל 6 שעות על 37 מעלות צלזיוס, המוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת בקורא מיקרו צלחת ולקרוא את אותות הקרינה ב 560 ננומטר ואורכי גל עירור 590 ננומטר ופליטה, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כדאיות אחוזים מהתאים בspheroids ידי נרמול אות הניאון מבארות שטופלו לזה של בארות שליטה לאחר שקלול הערכים מאותם תנאי הטיפול. </li></ol>

<ol>
	<li>Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+in+drug+discovery.">Systems biology in drug discovery.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).</li><li>Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+for+anticancer+drug+discovery--a+novel+approach+based+on+engineered+mammalian+cell+lines.">In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines.</a> Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).</li><li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+microarrays+in+drug+discovery.">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li><li>Gidrol, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D+cell+microarrays+in+pharmacology.">2D and 3D cell microarrays in pharmacology.</a> Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).</li><li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery.">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).</li><li>Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decline+in+new+drug+launches:+myth+or+reality?+Retrospective+observational+study+using+30+years+of+data+from+the+UK.">Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK.</a> BMJ Open. 3, (2013).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li><li>Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+engineering:+the+other+face+of+tissue+engineering.">Tumor engineering: the other face of tissue engineering.</a> Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).</li><li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression.">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li><li>Carlsson, J., Yuhas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-overlay+culture+of+cellular+spheroids.">Liquid-overlay culture of cellular spheroids.</a> Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).</li><li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-induced+angiogenesis+studied+in+confrontation+cultures+of+multicellular+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies+grown+from+pluripotent+embryonic+stem+cells.">Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells.</a> FASEB J. 15, 995-1005 (2001).</li><li>Tekin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+microwells+for+formation+and+retrieval+of+cell+aggregates.">Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates.</a> Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).</li><li>Patra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+for+uniform-sized+cell+spheroids+formation,+culture,+harvesting+and+flow+cytometry+analysis.">A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis.</a> Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).</li><li>Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconfigurable+microfluidic+hanging+drop+network+for+multi-tissue+interaction+and+analysis.">Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis.</a> Nat. Commun. 5, 4250 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-ring+structures+stabilize+microdroplets+to+enable+long+term+spheroid+culture+in+384+hanging+drop+array+plates.">Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates.</a> Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).</li><li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy.">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).</li><li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures:+from+molecular+mechanisms+to+clinical+applications.">Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications.</a> Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).</li><li>Minchinton, A., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumors.">Drug penetration in solid tumors.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li><li>Jeong, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tension-mediated,+concave-microwell+arrays+for+large-scale,+simultaneous+production+of+homogeneously+sized+embryoid+bodies.">Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies.</a> Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).</li><li>Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+imaging,+and+analysis+plate+for+facile+handling+of+384+hanging+drop+3D+tissue+spheroids.">Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids.</a> JALA. 19, 208-214 (2014).</li><li>Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput,+polymeric+aqueous+two-phase+printing+of+tumor+spheroids.">High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids.</a> Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).</li><li>Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+aqueous+biphasic+tumor+spheroid+microtechnology+for+anti-cancer+drug+testing+in+3D+culture.">Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).</li><li>Albertsson, P. -. A., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+diagrams.">Phase diagrams.</a> Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).</li><li>Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+co-culture+patterning+using+aqueous+two-phase+systems.">Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li><li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aqueous+two-phase+system+patterning+of+detection+antibody+solutions+for+cross-reaction-free+multiplex+ELISA.">Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA.</a> Sci. Rep. 4, 4878 (2014).</li><li>Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+direct+visual+analysis+of+hydrolytic+enzyme+activity+using+aqueous+two-phase+system+droplet+phase+transitions.">Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions.</a> Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).</li><li>Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+spatio-temporally+controlled+cell+microprinting+with+polymeric+aqueous+biphasic+system.">Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system.</a> Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells.">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies.">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells:+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches.">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

Spheroids להציג מודל מציאותי כדי להבין טוב יותר פיזיולוגיה גידול ויעילות תרופה ולספק כלי שימושי לגילוי תרופות אנטי-סרטני. יישומים כגון יפיקו תועלת רבה מטכניקות דור אליפטית ותחזוקה פשוטות שרק דורשים מעבדתי סטנדרטי, כלים טיפול נוזליים וציוד הקרנה. השימוש במערכת דו-שלב מי?...

מבחני מבוססי תאים לספק כלי חשוב לפיתוח והגילוי של תרופות אנטי-סרטניות חדשות. 1,2 מבחינה הסטורית, תרבויות monolayer של תאי הסרטן להיות מועסקת לחקור את היעילות של תרכובות מועמד מפני סוגים מסוימים של תאים סרטניים. קלות התחזוקה של תרבויות monolayer בתרבות צלחות סטנדרטית, התאימות של צלחות סטנדרטיים עם כלים רובוטיים מסחריים לתוספת של חומרים כימיים, ועם ציוד הקרנה לניתוח במורד הזרם של תגובות תאיות לתרכובות כימיות הם היתרונות העיקריים שהופכים את תרבויות 2D כלי אטרקטיבי לבדיקת סמים. 3 למרבה הצער, מבחני תא monolayer לעתים קרובות אינם מצליחים לחזות את היעילות של תרכובות in vivo, מה שהופך את פיתוח תרופות וגילוי תהליך יקר מאוד. 4,5 למרות השקעה משמעותית ומאמץ על ידי חברות תרופות ויחידות אקדמיות, ~ 1% בלבד תרופות אנטי-סרטני תרופות בניסויים קליניים אושרועל ידי ה- FDA בשני העשורים האחרונים. 6 פער בין תרבויות 2D and 3D הסביבה המורכבת של תאי סרטן בגוף חי הוא חסרון עיקרי של מערכות תרבות monolayer. 7 לכן, ההקרנה של תרכובות מועמד נגד תאים סרטניים בסביבה שדומה יותר ל סביבת גידול 3D עשויה לזרז פיתוח של תרופות כימותרפיות רומן. 8 spheroids תאים סרטניים להציג מודל 3D גידול רלוונטי במבחנה. 9,10 Spheroids הוא אשכולות קומפקטיים היוצרים באמצעות הרכבה ספונטנית או מושרה של תאים סרטניים על משטחים שאינם חסיד או בהשעיה תוך שימוש בטכניקות כגון בקבוק טווה, כיסוי נוזל, מיקרו microfabricated . גם מערכים, מיקרופלואידיקה, וטיפות תלויות 11-16 Spheroids לחקות תכונות עיקריות של גידולים מוצקים כוללים גיאומטריה ותחבורה מוגבלת של חמצן, חומרי מזון, ותרכובות תרופה לאזור המרכזי; ומכאן, שהם להתחדש respon התרופה באופן הדוק יותרse של גידולים מוצקים בהשוואה לתרבויות monolayer. 17-19 למרות היתרון הבולט הזה, spheroids אינו בשימוש שיגרתי עבור הקרנה של תרכובות כימיות כנגד תאים סרטניים. קושי לייצר spheroids בגודל אחיד בהגדרת תפוקה גבוהה סטנדרטית שתואמת לרובוטיקה זמינה מסחרי וכלים הקרנה / הדמיה פוגע שילוב של תרבות אליפטית לצנרת פיתוח תרופות. למרות שחומרים מותאמים אישית וצלחות הפכו זמינים מסחרי לאחרונה לתת מענה לצורך זה, שיקולי עלות להרתיע השימוש הנרחב שלהם. שתי טכניקות עיקריות עם היכולת לייצר spheroids בגודל עקבי בתפוקה גבוהה להשתמש פלטפורמת ירידת תלייה חדשה ומיקרו-בארות microfabricated. 13,16,20 עם זאת, שתי הגישות דורשות צלחות ומכשירים שהם יקרים כדי להמציא ולא נוחים למשתמשי קצה מיוחדים במרכזי מחקר ליבה והפרמצבטיקה בי EF הגדול ביותרמבצרים לגילוי של תרופות אנטי-סרטניות חדשות מתקבלות. למרות שיפור מסוים ביציבות של טיפות המכיל תא עם עיצוב האחרון של תליית צלחות ירידה, כל חור אחר רק של הצלחת עדיין משמש בתרבות, כדי למנוע התפשטות / מיזוג של טיפות. 16 זה מקטין את התפוקה ניסיונית באופן משמעותי. בנוסף לסמים והתחדשות קשה עם ידני או רובוטית pipetting וspheroids צריך להיות מועבר לתוך צלחת סטנדרטית לאנליזה ביוכימית כי תצורת צלחת זה לא בקלות בקנה אחד עם ציוד הקרנה קונבנציונלי כגון קוראי צלחת. 21 מיקרו-בארות מפוברקות באמצעות ליתוגרפיה הרכה גם לאפשר ייצור אליפטית גודל מבוקר. 13,20 עם זאת, אי התאמה של פלטפורמה זו עם כלים pipetting סטנדרטיים מונעת טיפול של spheroids הבודד עם תרכובות סמים / ריכוזים שונים, חושפת את כל spheroids למצב טיפול בודד. לכן, שיטה זו אינה מתאימה לגבוההקרנת מתחם תפוקה שדורשת בדיקות סימולטני של תרכובות / ריכוזים מרובים. כדי להתגבר על המכשולים הללו, טכניקה חדשה לייצור תפוקה גבוה של spheroids תאים סרטניים בגודל באופן עקבי ב96-גם צלחות סטנדרטי פותחה. 22,23 הגישה מבוססת על מערכת פולימרים מימית שני שלבים (ATPS) עם פוליאתילן גליקול ( לאחרונה PEG) וdextran (DEX) כמו פולימרים יוצרי שלב. 24 ATPSs כבר נוצל במגוון רחב של יישומים ביולוגיים תא הרומן לאפשר micropatterning תא ומקומי מסירה של חומרים כימיים ביולוגיים לתאים בתקשורת מימית מאוד. 25-32 כדי ליצור אליפטית, תאי סרטן מעורבבים עם שלב DEX המימי וירידה תת-microliter של ההשעיה וכתוצאה מכך הוא pipetted לפתרון שלב PEG המכיל גם הטבילה מימית. הירידה נשארה immiscible מהשלב הטבילה ותאי גבולות כדי להקל על היווצרות אליפטית. שֵׁדוֹןortantly, שלב הטבילה המימי מאוד מספק חומרים מזינים לתאים של אליפטית וממזער את הבעיה הידועה של אידוי תקשורת משותפת לכמה מבחני אחרים שגורמים לשינויים בosmolality תקשורת ותנודות של ריכוזי תרופה. טכניקה זו מאפשרת ייצור אליפטית וטיפול תרופתי רק באמצעות חומרים כימיים, זמינים מסחרית וכלים pipetting ב96-גם צלחות סטנדרטית. חשוב לציין, ניתוח של תגובות תאיות של spheroids מתבצע באותה הצלחת באמצעות מבחני ביוכימיים סטנדרטיים וקוראי צלחת. הקלות של עבודה עם ATPS וכושר הסתגלות של הגישה לטיפול נוזל רובוטית עושה דור תפוקה גבוה של שני מונו-תרבות ושיתוף התרבות spheroids טכניקת מעבדה פשוטה. גישה חדשה זו תהיה צעד גדול קדימה לכיוון אינטגרציה של spheroids תאים סרטניים בתהליכי פיתוח תרופות וגילוי עם תפוקת בדיקות משופרת ועלות-תועלת (מספר גדל והולך של תרכובות וredu נבדקוצריכת CED מגיב) ויעילות (הפחתת ידיים על זמן). פרוטוקול מפורט לייצור הרובוטית של spheroids תאים סרטניים ב96-גם צלחות בגישת ATPS מתואר להלן. בנוסף, פרטים של טיפול התרופתי של spheroids וכתוצאה מכך וניתוח במורד הזרם של תגובות תאיות באמצעות assay ביוכימיים מסחרי מוצגים.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagents and Consumables&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol, MW: 35,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500,000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Clacein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Life Technologies</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Life Technologies</td><td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>Sigma Aldrich</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (10 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tips (70 &amp;micro;l)</td><td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>Round-bottom 96-well plates</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

תחנת העבודה של המטפל הנוזלי רובוטית מוצגת באיור 1. ראש pipetting וכל התחנות בשימוש בהדפסה רובוטית של spheroids בסעיף 4.6 מסומנות. התמונה מציגה את השימוש בשתי תחנות שונות לתיבות קצה (סט אחד של טיפים לערבוב והסט השני לaspirating / מחלק של תערובת שלב תא השעיה מימי DEX). כל ההתקנה ש...

Watch this Scientific Journal Video about Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing at JoVE.com

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.0K Views.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Video: Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is exposed to in vivo. Solid tumors grow not as a sheet attached to plastic, but instead as a collection of clonal cells in a three-dimensional (3D) space interacting with their neighbors, and with distinct spatial properties such as the disruption of normal cellular polarity. These interactions cause 3D-cultured cells to acquire morphological and cellular characteristics which are more relevant to in vivo tumors. Additionally, a tumor mass is in direct contact with other cell types such as stromal and immune cells, as well as the extracellular matrix from all other cell types. The matrix deposited is comprised of macromolecules such as collagen and fibronectin.
In an attempt to increase the translation of research findings in oncology from bench to bedside, many groups have started to investigate the use of 3D model systems in their drug development strategies. These systems are thought to be more physiologically relevant because they attempt to recapitulate the complex and heterogeneous environment of a tumor. These systems, however, can be quite complex, and, although amenable to growth in 96-well formats, and some now even in 384, they offer few choices for large-scale growth and screening. This observed gap has led to the development of the methods described here in detail to culture tumor spheroids in a high-throughput capacity in 1536-well plates. These methods represent a compromise to the highly complex matrix-based systems, which are difficult to screen, and conventional 2D assays. A variety of cancer cell lines harboring different genetic mutations are successfully screened, examining compound efficacy by using a curated library of compounds targeting the Mitogen-Activated Protein Kinase or MAPK pathway. The spheroid culture responses are then compared to the response of cells grown in 2D, and differential activities are reported. These methods provide a unique protocol for testing compound activity in a high-throughput 3D setting.

Across a wide variety of disease indications, more physiologically relevant models are being developed and implemented into drug discovery programs. The new model system described here demonstrates how three-dimensional tumor spheroids can be cultured and screened in a high-throughput 1536-well plate-based system to search for new oncology drugs.

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Cancer Research

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor cells into neighboring tissue. Thus, invasion is a crucial step in metastasis, making the invasion process research and development of anti-metastatic drugs, highly significant. To address this demand, there is a need to develop 3D in vitro models which imitate the architecture of solid tumors and their microenvironment most closely to in vivo state on one hand, but at the same time be reproducible, robust and suitable for high yield and high content measurements. Currently, most invasion assays lean on sophisticated microfluidic technologies which are adequate for research but not for high volume drug screening. Other assays using plate-based devices with isolated individual spheroids in each well are material consuming and have low sample size per condition. The goal of the current protocol is to provide a simple and reproducible biomimetic 3D cell-based system for the analysis of invasion capacity in large populations of tumor spheroids. We developed a 3D model for invasion assay based on HMCA imaging plate for the research of tumor invasion and anti-metastatic drug discovery. This device enables the production of numerous uniform spheroids per well (high sample size per condition) surrounded by ECM components, while continuously and simultaneously observing and measuring the spheroids at single-element resolution for medium throughput screening of anti-metastatic drugs. This platform is presented here by the production of HeLa and MCF7 spheroids for exemplifying single cell and collective invasion. We compare the influence of the ECM component hyaluronic acid (HA) on the invasive capacity of collagen surrounding HeLa spheroids. Finally, we introduce Fisetin (invasion inhibitor) to HeLa spheroids and nitric oxide (NO) (invasion activator) to MCF7 spheroids. The results are analyzed by in-house software which enables semi-automatic, simple and fast analysis which facilitates multi-parameter examination.

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

A HMCA-based imaging plate is presented for invasion assay performance. This plate facilitates the formation of three-dimensional (3D) tumor spheroids and the measurement of cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). The invasion assay quantification is achieved by semi-automatic analysis.

ניתוח של סרטן תאים הפלישה ושל סמים אנטי גרורתי הקרנת באמצעות מערך הידרוג מיקרו-תא (HMCA)-המבוסס על צלחות

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

ייצור של מספר הגדול של spheroids גידול מבוקר גודל באמצעות צלחות microwell

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Generation of 3D Tumor Spheroids for Drug Evaluation Studies

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the evaluation of anticancer drugs. However, the conventional culture methods lack the ability to manipulate the tumor spheroids in a homogeneous manner at the three-dimensional level. To address this limitation, in this paper, we present a convenient and effective method of constructing average-sized tumor spheroids. Additionally, we describe a method of image-based analysis using artificial intelligence-based analysis software that can scan the whole plate and obtain data on three-dimensional spheroids. Several parameters were studied. By using a standard method of tumor spheroid construction and a high-throughput imaging and analysis system, the effectiveness and accuracy of drug tests performed on three-dimensional spheroids can be dramatically increased.

This article demonstrates a standardized method for constructing three-dimensional tumor spheroids. A strategy for spheroid observation and image-based deep-learning analysis using an automated imaging system is also described.

יצירת ספרואידים תלת ממדיים להערכת תרופות

In recent decades, in addition to monolayer-cultured cells, three-dimensional tumor spheroids have been developed as a potentially powerful tool for the ...

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

ניתוח פנוטיפי חצי אוטומטי של תרביות תאים ספרואידים תלת-ממדיים פונקציונליים

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

Biochemistry

היווצרות ספרואידים רב-תאיים לניתוח מטבולי והיפוקסיה מבוסס FLIM

Production and Multi-Parameter Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) of Multicellular Spheroids

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug therapies&#160;and using bio- and nanosensors in a 3D context. Their ease of production, predictable size, growth, and observed nutrient and metabolite gradients are important to recapitulate the 3D niche-like&#160;cell microenvironment. However, spheroid heterogeneity and variability of their production methods can influence overall cell metabolism, viability, and drug response. This makes it difficult to choose the most appropriate&#160;methodology, considering the requirements in size, variability, needs of biofabrication, and use as in vitro 3D tissue models in stem and cancer cell biology. In particular, spheroid production can influence their compatibility with quantitative live microscopies, such as optical metabolic imaging, fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), monitoring of spheroid&#160;hypoxia with nanosensors, or viability. Here, a number of conventional spheroid formation protocols are presented, highlighting their compatibility with the live widefield, confocal, and two-photon microscopies. The follow-up imaging to analysis&#160;pipeline with multiplexed autofluorescence FLIM and, using various types of cancer and stem cell spheroids, is also presented.

מחבר זרקור: סטנדרטיזציה של שיטות היווצרות כדוריד לניתוח מטבולי וחמצון באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים

Here, we describe different multicellular spheroid formation methods to perform follow-up multi-parameter live cell microscopy. Using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), cellular autofluorescence, staining dyes, and nanoparticles, the approach for analysis of cell metabolism, hypoxia, and cell death in live three-dimensional (3D) cancer and stem cell-derived spheroids is demonstrated.

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים

Multicellular tumor spheroids are a popular 3D tissue microaggregate&#160;model for reproducing tumor microenvironment, testing and optimizing drug ...

הפקה רובוטית של תאי סרטן Spheroids עם מערכת מימית שני שלבים לבדיקת סמים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים

ניתוח של סרטן תאים הפלישה ושל סמים אנטי גרורתי הקרנת באמצעות מערך הידרוג מיקרו-תא (HMCA)-המבוסס על צלחות

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

ייצור של מספר הגדול של spheroids גידול מבוקר גודל באמצעות צלחות microwell

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

יצירת ספרואידים תלת ממדיים להערכת תרופות

ניתוח פנוטיפי חצי אוטומטי של תרביות תאים ספרואידים תלת-ממדיים פונקציונליים

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים

ייצור ומיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של תאים חיים מרובי פרמטרים (FLIM) של ספרואידים רב-תאיים