The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

고분자 수성 2 단계 시스템 1. 준비 (ATPS) <ol><li> 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (MW : 35,000) 0.5 g을 달아 수성 PEG 단계 (/ V W) 5 % 10 ㎖를 제조 멸균 15ml의 원뿔에서 완전 성장 배지 9.5 ml의 추가. 주 : 제 중합체를 추가하고 그 다음에 원뿔형 배지의 절반을 추가하는 것은 그 다음 매체의 잔량이 원추형 벽 중합체의 접착 성을 최소화하고, 중합체가 더 빨리 용해 돕는다. </li><li> 덱스 트란 (DEX) 0.128 g (MW : 500,000)를 달아 12.8 % (w / v)의 수용액 DEX 상 1 ㎖를 제조 멸균 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 완전 성장 배지의 0.872 ml의 추가. </li><li> 약 1 분 동안 와동 두 솔루션 배지에서 중합체를 용해. </li><li> 용해 및 균질 혼합물을 보장하기 위해 1 시간 동안 37 ℃에서 수욕에서 두 솔루션 유지. 목욕의 솔루션의 오염 가능성을 방지하기 위해 물 수준의 위 뚜껑을 유지물. </li><li> 멸균 플라스틱 주사기 내로 PEG 상 용액을로드 및 불순물을 제거하기 위해 0.2 ㎛의 공극 크기의 주사기 필터를 통해 전달한다. 천천히 필터를 통해 솔루션을 밀어, PEG 용액을 주사기를 채우기 원뿔 튜브의 상단과 힘을 사용하는 방법에 대한 필터의 삽입에 배치 참고. 그것은 주사기 플런저의 움직임에 대한 저항을 경험하는 정상입니다. 용액의 일부는 필터에 남아 있지만, 중합체의 농도가 변화하지 않으므로 중합체 용액 경미한 손실이 발생한다. </li><li> 피펫 10 DEX 위상 솔루션의 μL 및 별도의 튜브에 매체의 10 μL에 희석은 6.4 % (w / v)의 DEX 단계 솔루션을 초래할 수 있습니다. 대기음 100 PEG 상 용액 μL 및 페트리 접시로 분배. <ol><li> PEG 용액 상으로 DEX 상 용액 (V / w) 6.4 % 0.5 μl를 분배. 시각적으로 현미경 DEX 강하를 관찰하여 성공적인 ATPS 형성을 확인합니다. 드롭 경계두 안정, 별도의 수성 단계의 존재를 나타내는, 계속 표시해야합니다. </li></ol></li><li> 사용할 때까지 4 ° C에서의 주식 수성 PEG와 DEX 단계 솔루션을 저장합니다. 주 : 폴리머 솔루션은 이전에 각 실험에 신선한 준비 및 보관 24 시간 내에 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 인쇄 암의 세포 타원체 2. 준비 <ol><li> 90 % -100 %의 융합 성 단층 관심 (예를 들면, MDA-MB-157 유방암 세포)의 암세포 성장. MDA-MB-157 세포, DMEM은 10 % FBS, 1 %의 글루타민, 및 1 % 항생 물질을 함유 이루어지는 매체를 사용한다. <ol><li> (제조사의 프로토콜에 따라)과 15 ML 원뿔에 서스펜션을로드 셀 분리 버퍼를 사용하여 수확 세포. , 173.3 XG에서 5 분 정도 원심 분리기 뜨는을 제거하고, 재현 탁 세포 완전한 성장 배지 1 ㎖에. </li></ol></li><li> 로드셀 상 혈구 계산하고이를 원하는 숫자를 계산하는원하는 회전 타원체 세포 밀도에 대한 세포의. T75 플라스크에 성장 MDA-MB-157 세포의 합류 단층은 보통 ~ 7 × 10 6 세포를 제공합니다. 주 :. 1.5 × 104 또는 MDA-MB-157 세포에 대한 큰 방울 체적에 필요한 세포 밀도가 단일 회전 타원체는 세포 유형에 의존 할 것이다 생성하기 위해 예를 들어 22, 밀도는 0.3 μL DEX 위상 드롭 당 권장 단일 회전 타원체의 형성을 보장합니다. </li><li> 173.3 XG에서 5 분 동안 원심 분리 두번째 세포 및 원하는 세포 밀도로 현탁 집중 성장 배지의 적당한 용적에 재현 탁 그들을. 참고 : 7 × 106 암세포 수확 예를 들어, 0.3 μL의 DEX 위상 강하는 1.5 × 104 세포 밀도의 타원체를 형성하는데 필요한 세포 현탁액의 총 부피는 140 μL 것이다. 그러나 인해 다음 단계에서 DEX 상 용액으로 희석 만 세포를 재현 탁하는 세포 배양 배지의 70 μl를 사용한다. </li><li&gt; 12.8 %의 동일 부피 (w / v)의 수용액 DEX 상 용액 1.2에서 제조 얻어진 세포 현탁액에 추가. 1.5 × 104 세포 밀도 타원체의 예를 들면, 위상 DEX 용액 70 μl의 세포 현탁액 70 μL를 첨가한다. </li><li> 철저히 세포 DEX 혼합 용액의 균일 한 분포를 보장하기 위해 세포 현탁액을 혼합한다. 피펫 위아래로 거품 형성을 방지하기 위해 조심스럽게 수행해야합니다. </li></ol> 공동 배양 타원체의 인쇄 3. 준비 <ol><li> 암 세포 성장 (예를 들어, MDA-MB-157 인간 유방암 세포) 및 90 % -100 %의 융합 성 단층을지지 세포 (예, 인간 섬유 아세포). (제조사의 프로토콜에 따라) 세포 해리 완충액을 이용하여 각 세포 유형 수확. <ol><li> 각 원뿔형 5 173.3 XG에 분하고, 흡인 상등액을 위해 그들을 원심 분리기, 15 ML 원뿔로 각각의 서스펜션을로드합니다. 완전한 g 1 ml의 각 원뿔의 재현 탁 세포rowth 매체. 참고 : 예컨대 칼 세인 AM (생균 얼룩) 핵 염색 (훽스트) 형광 염료는 두 종류의 세포를 구별하는데 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 혈구에 별도로 각 세포 유형을로드하고 공 배양 세포 타원체를 지원하는 암세포의 원하는 비율에 대한 각각의 세포 유형의 필요한 개수를 계산하도록 계산. T75 플라스크에서 재배 합류 MDA-MB-157 세포의 단층 및 섬유 아 세포는 일반적으로 각각 ~ 7 × 10 6 ~ 6 × 10 6 세포를 제공합니다. </li><li> 두 종류의 세포 수의 바람직한 비율을 제공하는 암 세포에 세포 현탁액을지지 현탁액으로부터 정확한 볼륨. 예를 들어, 하나의 섬유 아세포 세포에 암 세포를 50의 비율을 사용한다. </li><li> 원심 적절한 부피 173.3 XG 재현 탁하고 세포에서 5 분 동안 혼합 세포 현탁액을 함유하는 수성 원추형 DEX (/ V W)와 동일한 성장 배지의 부피를 12.8 %의 최종 농도로 포함하는 결과(1.2에서 준비) 단계 솔루션입니다. </li><li> 부드럽게 현탁액의 균질성을 확인하기 위해 위아래로 얻어진 세포 현탁액을 피펫. </li></ol> 96- 웰 플레이트 종양 타원체 4. 인쇄 <ol><li> 어느 날 이전에 실험에, 1 % 코트 비 처리 된 둥근 바닥 96 웰 플레이트 24 시간 동안 37 ° C에서 (w는 / v)의 플루로 닉. 이 코팅은 배양 기간 동안 세포 부착을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 여과하고, 5 %의 50 μl를 분주를 96 웰 플레이트 (대상 판)의 각 웰에 PEG 수성 상 (/ V w). </li><li> 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 혼합 (2 단계 또는 각각 모노와 공동 문화에 대해 단계 3에서 제조) 및 384 웰 플레이트의 하나의 열 (소스 판)에서 잘 모든 다른 서스펜션의 20 μl를 추가 . </li><li> 액체 핸들러와 &quot;홈&quot;좌표를 등록하는 피펫 팅 머리를 켭니다. 그런 다음 실험 실용을 보장하기 위해 (4.6 이하) 이전에 정의 된 프로토콜을 컴파일하고 매개 변수가 올바른 정의LY. 이 &quot;원점 복귀&quot;단계는 다른 액체 핸들러 다를 수 있습니다. 참고 : 프로토콜의 흐름, 단계별로 아래 4.6에 관계없이 사용되는 로봇 액체 핸들러의 유사합니다 표시; 그러나, 프로그래밍 인터페이스는 다른 의한 소프트웨어의 사용으로 다르​​게 보일 수있다. </li><li> 도 1에 도시 된 바와 같이 액체 핸들러의 워크 스테이션의 위치에 정의 된 소스 플레이트, 대상 판, 피펫 팁 및 박스를 배치. </li><li> 다음 단계를 포함하는 프로토콜을 실행 <ol><li> 로드 워크 스테이션 (그림 1)에서 피펫 팁 (8 팁) 믹싱 액체 핸들러의 피펫 팅 헤드로부터 배럴 중 하나 열입니다. </li><li> 소스 플레이트 (도 1)의 웰에 세포 현탁액을 혼합한다. 기포 형성을 방지하기 웰에 세포 현탁액의 부피보다 작은 혼합 볼륨을 선택. </li><li> 빈 폐기물 팁 상자 (그림 1)에 팁을 꺼냅니다. </li&gt; <li> 부하 10 μL 분배 피펫 팁 피펫 헤드로부터 배럴의 하나의 열 (그림 1). </li><li> 대기음 각 피펫 팁으로 소스 플레이트에서 세포 현탁액 0.3 μL (도 1). </li><li> 대상 판의 하나의 열 (도 1)의 웰에 세포 현탁액을 분배. 0.5 mm의 높이 및 분배 미만 1 μL / sec의 분사 유량을 사용한다. </li><li> 전체 대상 플레​​이트에 컬럼 별 인쇄가 완료 될 때까지 반복 4.6.6을 통해 4.6.1 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 워크 스테이션 표면에서 대상 플레이트를 제거하고 CO 2를 37 ° C에서 습기가 인큐베이터에 배치하고 5 %. 세포를 포함하는 위상 DEX 방울의 교란을 방지하기 인큐베이터로 운반시 접시 수평을 유지한다. </li><li> DEX 단계 드롭 내에서 회전 타원체로 세포의 응집을 할 수 있도록 24 시간 동안 접시를 품어. </li></ol> &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. 암 세포 타원체의 약물 치료 다음 프로토콜은 4 일간의 약물 치료이며, 그것은 다른 치료 기간을 수정할 수 있습니다 일 2. 후 신선한 약물과 갱신이 포함되어 있습니다. <ol><li> 시각 24 시간 후 96 웰 플레이트의 회전 타원체의 형성을 확인합니다. 각 회전 타원체의 최소 및 최대 직경을 평균하여 타원체의 크기 측정을위한 이미지 우물을 필요로합니다. </li><li> 소정의 용해도 농도 제조사 권장 용매 및 원하는 약물의 원액을 준비한다. 예를 들어, ㎖ / 2 mg을 물에 시스플라틴을 용해. 주 : 약물이 빛에 민감한 경우 빛으로부터 약물의 원액을 보호합니다. </li><li> 시리얼 희석 기술을 사용하여, 이전 단계에서 제조 스톡 용액으로부터 세포 배양 배지로 희석 약물 농도를 준비한다. 각 회 희석하여 원하는 농도가 이루어져야한다. DIL의 ution 비율은 시작 재고 농도에 따라 달라질 수 및 작업 농도를 원하는 것입니다. </li><li> 각 웰에 이전 단계에서 제조 된 약물 용액 50 μL를 추가한다. 이 로봇 또는 수동 피펫 팅하여 수행 할 수 있습니다. 주 : 각 약물 농도는 각 웰에 50 ㎕의 이미 PEG 수성 상으로 원하는 농도로 반으로 희석한다. <ol><li> 각 농도 96 웰 플레이트 (N = 16)의 두 개의 열에서 타원체를 사용합니다. </li><li> 대조군 웰에서, PEG 수성상의 기존 50 μL 신선한 배지의 50 μL를 추가한다. </li></ol></li><li> 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 48 시간 및 5 % CO 2,위한 약물과 타원체 부화. </li><li> 배양 48 시간 후, 소정 농도의 신선한 약물 희석액을 제조하고 각 웰에 신선한 약물 용액 50 μl를 첨가하여 약제를 갱신. 주 : 웰이 이미 제 약물 t에서 원하는 약물 농도를 포함reatment. 더 희석이 발생하지 않는 것이므로 따라서 갱신이 단계에서, 각각의 농도가 목적하는 농도로 제조한다. </li><li> 빛으로부터 보호 37 ° C에서 또 다른 48 시간 동안 약 5 % CO 2와 타원체를 품어. </li></ol> 6. 타원체의 세포 생존 능력의 분석 <ol><li> 갱신 약물 (즉, 약물과 타원체의 처리의 총 시간 4 일)와 배양 48 시간 후, 잘 매뉴얼 피펫 팅에 의해 하나의 매체의 총 부피를 측정한다. 참고 : 하나 잘 일반적인 볼륨이 140 μl의 (작은 감소는 증발로 인해 발생) ~이다. </li><li> 웰 총 부피의 10 % 농도 세포 생존 시약 (예 PrestoBlue)의 체적을 계산한다. 각 웰에 세포 생존 시약이 볼륨을 추가합니다. 주 : 웰 140 μL의 기존 미디어 부피, 15.6 μL의 부피는 웰의 총 농도 10 %를 제공 할 필요가있다. 이 계산됩니다9 (140 μL / 9 = 15.6 μL)에 의해 기존의 미디어 볼륨을 분할. </li><li> 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 6 시간 동안 각각의 웰에 첨가 세포 생존 시약, 접시를 인큐베이션. </li><li> 마이크로 플레이트 리더에서 접시를 놓고 각각 560 nm에서 590 nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 신호를 읽어보십시오. </li><li> 동일한 처리 조건에서 값을 평균 한 후 대조군 웰의 처리함으로써 웰로부터 형광 신호를 정규화하여 타원체에서 세포의 생존 비율을 계산한다. </li></ol>

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Chem. 86, 4052-4057 (2014).</li><li>Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+spatio-temporally+controlled+cell+microprinting+with+polymeric+aqueous+biphasic+system.">Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system.</a> Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells.">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).</li><li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies.">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells:+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches.">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

스페 로이드 잘 종양 생리학 및 약물 효능을 이해하고 항암 약물 개발을위한 유용한 도구를 제공하는 실제적인 모델을 제시한다. 이러한 응용 프로그램은 크게 만 표준 실험 실용 액체 처리 도구 및 선별 장비를 필요로 간단한 회전 타원체 생성 및 유지 보수 기술 혜택을 누릴 것입니다. 수성 개의 상 시스템 드롭 위상 내로 자발적 집합체 암세포의 사용은 효율적인 생산과 로봇 액체 핸들러 타원?...

세포 기반 분석법을 개발 및 새로운 항암 약물의 발견을위한 중요한 도구를 제공한다. 1,2 역사적으로, 암 세포의 단층 배양 물은 암 세포의 특정 유형에 대한 후보 화합물의 효과를 조사하기 위해 사용되어왔다. 표준 배양 플레이트에 단층 문화의 유지 보수의 용이성, 시약을 첨가 한 상용 로봇 도구와 표준 플레이트의 호환성 및 화학 물질에 대한 세포 반응의 다운 스트림 분석을위한 검사 장비와는 2D 문화에게 매력적인 도구를 렌더링의 주요 장점은 약물 테스트를 위해. 3 불행하게도, 단층 세포 분석은 종종 신약 개발과 발견을 매우 비용이 많이 드는 과정을, 생체 내에서 화합물의 효능을 예측하지 못한다. 4,5 제약 회사 학술 단위, 만 ~ 1 %로 상당한 투자와 노력에도 불구하고 항암제의 임상 시험에서 약물이 승인되었다지난 20 년간 FDA에 의해. 차원 배양 및 생체 내에서 암세포의 복잡한 3D 환경 사이 6 격차가 단층 배양 시스템의 주요 단점이다. (7) 따라서, 설정에서 종양 세포에 대한 후보 화합물 스크리닝은 더 밀접하게 닮았다 3D 종양 환경은 새로운 화학 요법 약물의 개발을 촉진 할 수있다. (8) 암세포 타원체는 시험관 내에서 중요한 3D 종양 모델을 제시한다. 9,10 타원체는 비 - 부착 표면 또는 스피너 플라스크, 액체 오버레이, 미세 마이크로 같은 기법을 사용하여 현탁액 중의 암세포의 자발 또는 유도 조립체를 통해 형성 컴팩트 클러스터 아르 . 어레이, 미세 유체 및 매달려 방울도 11 ~ 16 타원체는 형상과 중앙 영역에 산소, 영양분, 약물 화합물의 제한으로 전송을 포함한 고형 종양의 주요 기능을 모방; 따라서, 그들은 더 밀접하게 약물 respon를 재생단층 문화에 비해 고형 종양의 자체.이 현저한 이점에도 불구하고 17 ~ 19, 타원체 정기적으로 암 세포에 대한 화학 물질의 스크리닝에 사용되지 않습니다. 상업적으로 이용 가능한 로봇 및 심사 / 이미징 도구와 호환되는 표준 높은 처리량 설정에서 균일 한 크기의 타원체를 생산 난이도는 신약 개발 파이프 라인으로 회전 타원체 문화의 결합을 방해. 사용자 정의 재료와 플레이트는 최근 이러한 요구를 해결하기 위해 시중에서 판매되고 있지만, 비용을 고려은 광범위한 사용을 방지. 새로운 매달려 드롭 플랫폼과 미세 마이크로 우물을 사용하여 높은 처리량의 일관된 크기의 타원체를 생산하는 기능이있는 두 가지 주요 기술. 13,16,20 그러나, 두 가지 접근 방식은 특별한 접시와 제작이 비싸고 엔드 포인트 사용자를위한 불편 장치가 필요 핵심 연구 센터 및 제약 산업 대부분의 주요 EF에서새로운 항암 약물의 발견을위한 요새가 만들어진다. 드롭 플레이트 매달려의 최근 디자인 세포 함유 방울의 안정성에 약간의 개선에도 불구하고, 판 매 다른 구멍은 여전히 방울의 확산 / 병합을 방지하기 위해 문화 중에 사용됩니다. (16)이 크게 실험 처리량을 감소시킨다. 의약품 추가 및 갱신은 수동 또는 로봇 피펫으로 어려운이 판 구성은 플레이트 리더로 기존의 검사 장비와 쉽게 호환되지 않기 때문에 타원체는 생화학 적 분석을위한 표준 플레이트에 전달 될 ​​필요가있다. (21) 마이크로 웰은 또한 소프트 리소그래피를 사용하여 제작 제어 크기 회전 타원체 생산을 할 수 있습니다. 13, 20을하지만, 표준 피펫 팅 툴이 플랫폼의 호환성은 단일 처리 조건에 모든 구 상체를 노출, 다른 약 화합물 / 농도 개별 타원체의 치료 방지 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 높은 적합하지 않다여러 화합물 / 농도의 동시 테스트를 필요로 처리 화합물 스크리닝. 이러한 장애를 극복하기 위해, 표준 96 웰 플레이트에서 일관 크기 암세포 타원체의 높은 처리량의 생산을위한 새로운 기술이 개발되었다. 22, 23 접근법은 폴리에틸렌 글리콜 중합체 수성 개의 상 시스템 (ATPS ()에 기초 상 형성 중합체와 같은 PEG)과 덱스 트란 (DEX). (24) ATPSs는 최근 셀의 미세화를 가능하게하는 새로운 세포 생물학적 다양한 응용 분야에 활용이 높은 수성 미디어의 셀에 생물학적 시약의 전달을 현지화하고있다. 25 ~ 32을 형성하기 회전 타원체가 암세포 DEX 수성 상과 현탁액의 서브 드롭 마이크로 리터와 혼합이 잘 함유 수성 침지 PEG 용액 상으로 피펫 팅한다. 드롭 타원체의 형성을 용이하게하기 위해 침지 위상 및 경계 셀에서 혼화 남아있다. 꼬마 도깨비ortantly, 높은 수성 침지 단계는 회전 타원체의 세포에 영양분을 제공하며, 미디어 삼투압 변화 및 ​​약물 농도의 변동을 일으키는 다른 분석법에 공통 매체 증발의 잘 알려진 문제를 최소화한다. 이 기술은 회전 타원체 생산에만 표준 96- 웰 플레이트에서 시판 시약 피펫 팅 도구를 사용하여 약물 치료를 가능하게한다. 중요한 것은, 타원체의 세포 반응의 분석은 표준 생화학 검정 및 플레이트 판독기를 사용하여 동일한 플레이트에서 수행된다. 로봇 액체 처리에 대한 접근 방식의 ATPS과 적응성 작업의 용이성 모노 문화 및 공동 문화 모두의 높은 처리량 생성이 간단 실험실 기술을 타원체 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 개선 된 테스트 처리량 및 테스트 화합물과 redu의 수가 증가 비용 효율성 (와 약물 개발 및 검색 프로세스에 암 세포 타원체의 통합을 향해 앞으로 중요한 단계가 될 것입니다CED 시약 소비)과 효율성 (시간에 손을 감소). ATPS 접근법을 사용하여 96- 웰 플레이트에서 암세포 타원체의 로봇 제조 상세한 프로토콜 설명한다. 또한, 얻어진 타원체와 상용 생화학 분석을 이용하여 세포 반응의 분석 하류의 약물 치료의 세부 사항이 제시된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mw: 35,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Mw: 500,000</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>5510 0500 9007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12306C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clacein AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>15663-27-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-13261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-108</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>542342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (10 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P10V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (70 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P70V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Handler</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SRT Bravo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Biotek Instruments</td>
			<td>Synergy H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

로봇 액체 핸들러의 워크 스테이션. 그림 1의 피펫 팅 헤드와 4.6에서 타원체의 로봇 인쇄에 사용 된 모든 방송국이 표시되어있다. 이미지는 팁 상자에 대한 두 개의 서로 다른 스테이션 (한 믹싱 팁 세트와 세포 현탁액 수성 DEX 상 혼합물의 / 분배를 흡입에 대한 두 번째 세트)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 전체 셋업은 무균 상태를 유지하기 위해 표준 생물학적 안전 캐비닛 내에 수?...

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Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K 조회수.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

3D Spheroids의 생성을위한 간단한 한깅 드롭 세포 배양 프로토콜

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

연구

생체공학

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically relevant than conventional adherent-sheet cultures, they more accurately recapitulate the complexity and interactions present in real tumors. In order to harness this model to better assess tumor biology, or the efficacy of novel therapeutic agents, it is necessary to be able to generate spheroids reproducibly, in a controlled manner and in significant numbers.
The AggreWell system consists of a high-density array of pyramid-shaped microwells, into which a suspension of single cells is centrifuged. The numbers of cells clustering at the bottom of each microwell, and the number and ratio of distinct cell types involved depend only on the properties of the suspension introduced by the experimenter. Thus, we are able to generate tumor spheroids of arbitrary size and composition without needing to modify the underlying platform technology. The hundreds of microwells per square centimeter of culture surface area in turn ensure that extremely high production levels may be attained via a straightforward, nonlabor-intensive process. We therefore expect that this protocol will be broadly useful to researchers in the tumor spheroid field.

We introduce a protocol for the generation of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of uniform size- and composition-controlled tumor spheroids, using commercially available microwell plates.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is conducted by eliciting an illusion through use of a mirror as if the hemiplegic arm is moving in real-time while moving the healthy arm. It can facilitate brain neuroplasticity through activation of the sensorimotor cortex. However, conventional mirror therapy has a critical limitation in that the hemiplegic arm is not actually moving. Thus, we developed a real-time 2-axis mirror robot system as a simple add-on module for conventional mirror therapy using a closed feedback mechanism, which enables real-time movement of the hemiplegic arm. We used 3 Attitude and Heading Reference System sensors, 2 brushless DC motors for elbow and wrist joints, and exoskeletal frames. In a feasibility study on 6 healthy subjects, robotic mirror therapy was safe and feasible. We further selected tasks useful for activities of daily living training through feedback from rehabilitation doctors. A chronic stroke patient showed improvement in the Fugl-Meyer assessment scale and elbow flexor spasticity after a 2-week application of the mirror robot system. Robotic mirror therapy may enhance proprioceptive input to the sensory cortex, which is considered to be important in neuroplasticity and functional recovery of hemiplegic arms. The mirror robot system presented herein can be easily developed and utilized effectively to advance occupational therapy.

We developed a real-time mirror robot system for functional recovery of hemiplegic arms using automatic control technology, conducted a clinical study on healthy subjects, and determined tasks through feedback from rehabilitation doctors. This simple mirror robot can be applied effectively to occupational therapy in stroke patients with a hemiplegic arm.

반신 불수 팔의 기능 복구를위한 로봇 미러 치료 시스템

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

자동화된 미생물체 시스템을 사용하여 중국 햄스터 난소 세포의 단일 클론 항체의 정화 및 분석

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

A Spine Robotic-Assisted Navigation System for Pedicle Screw Placement

Pedicle screw implantation has excellent treatment effects and is often used by surgeons in spinal fusion surgery. However, due to the complexity of human body anatomy, this surgical procedure is difficult and challenging, especially in minimally invasive surgery or patients with congenital anomalies and kyphoscoliosis deformity. In addition to the abovementioned factors, the surgical experience and technique of the surgeon also affect the recovery rates and complications of the patients after the surgical operation. Therefore, accurately performing pedicle screw implantation has is a constant topic of common concern for surgeons and patients. In recent years, with the technological development, robot-assisted navigation systems have gradually become adopted. These robot-assisted navigation systems provide surgeons with complete preoperative planning before surgery. The system provides 3D reconstructed images of each vertebra, allowing surgeons to understand the patient&#39;s physiological characteristics more quickly. It also provides 2D images of sagittal, coronal, axial and oblique planes so that surgeons can accurately perform pedicle screw placement plan.
Previous studies have demonstrated the effectiveness of robot-assisted navigation systems for pedicle screw implantation procedures, including accuracy and safety assessments. This step-by-step protocol aims to outline a standardized surgical technique note for robotic-assisted pedicle screw placement.

This article presents a standardized surgical technique for robotic-assisted pedicle screw placement by using robotic-assisted navigational systems. We present a step-by-step protocol and describe the workflow and precautions of this procedure.

페디클 나사 배치를 위한 척추 로봇 보조 네비게이션 시스템

Pedicle screw implantation has excellent treatment effects and is often used by surgeons in spinal fusion surgery. However, due to the complexity of human ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

음향 분리기사용 CHO 수확세포 배양액의 1차 해명

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...