אנו מודים וירג&#39;יניה דוהרטי וJunmei יאו לקבלת סיוע טכני. מחקר זה מומן על ידי NIMH (R01 MH084966), ומשרד המחקר של צבא ארה&quot;ב והמתקדמת ביטחון מחקרי הסוכנות (להעניק W911NF-10-1-0059) לבחביונת.

כל הניסויים נעשו שימוש בחולדות הארוך אוונס זכר בוגר. כל הנהלים בהתאם למוסד האמריקאי הלאומי לבריאות (NIH) מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש במכון טכנולוגי של מסצ&#39;וסטס והטיפול בבעלי החיים ולמשרד סקירת שימוש ב USAMRMC. 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Heparinise קטטר ומזרק על ידי הצבת המחט מוגנות בהפרין המכיל 500 צינור μl (1,000 יחידות USP / מיליליטר) ולאחר מכן aspirating וגירוש פתרון הפרין דרך המחט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף קטטר פרפר למזרק. שמור את המגן על המחט של קטטר כדי להגן על הקצה החד מנזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת נפח של הפרין שהוא מעט גדול יותר מנפח דם שייאסף. לנתק את המזרק ולמלא אותו באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש לצרף את המזרק לקטטר ולהשתמש באוויר לגרש פתרון הפרין עודף; להבטיח רק כמויות זעירות להישאר בצינור, המחט, והמזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צנתר סטרילי, עם המזרק עדיין מחובר, על משטח סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לאבטח את העכברוש במטלית נקייה להבטיח כי קדמי וhindpaws נמצאים בעמדה נוחה והנשימה היא בלתי מוגבלת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure לעטוף עם וו ולולאה; להבטיח שאברי מין חיצוניים אינם מכווצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש עוזר בעדינות ובתקיפות לרסן את העכברוש (בטן ובסיס הזנב) על משטח עבודה יציב עם הזנב תלוי מקצה הנגדי. </li></ol></li></ol> דגימת דם 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הזנב במי 42 מעלות צלזיוס במשך 40-50 שניות להרחבת כלי דם ולייבש את הזנב עם מגבת נייר. אתר את וריד הזנב לדמם (לסובב את כל הגוף עם הזנב למנוע מסובב את הזנב). הערה: התחממות מספיקה של הזנב היא קריטית עבור collectio המהירn של דגימת דם. אם כלי הדם הוא מכווץ, מיקום נכון של הצנתר הוא קשה, וזרימת דם מופחתת בהרבה. כרית חימום יכולה לשמש כתחליף לטבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את נקודת הדגימה. הערה: העורק נמצא לאורך היבט אמצע הגב-הזנב; אל תשתמשו בזה לדגימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקד או ורידי זנב שמאלה וימינה ששוכבים לרוחב לעורק. פיגמנטציה של הזנב, שמשתנה לפי זן ועולה עם גיל, עלולה לטשטש חלק מכלי הדם. מקד את חלק של הווריד בחלק התחתון של הזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את אזור היעד עם תמיסת חיטוי chlorhexidine 2%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור לחץ שלילי במזרק וקטטר על ידי משיכת בוכנת מאפס עד כ -50 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הזנב בעדינות ובתקיפות ליד הקצה כדי לשמור על הזנב ישר לאורך אוסף מדגם. ודא שזרימת דם לא האפילה על ידי אחיזה הדוקה מדי.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להכניס את הצנתר לווריד בזווית רדודה כ 5 סנטימטר מקצה הזנב. כאשר הווריד חדר, דם יזרום לקטטר. לאט לאט למשוך את הבוכנה של המזרק כדי לאסוף את הנפח הרצוי בקצב קבוע (~ 20 μl לשניות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייעץ עם צוות הוטרינרים לקבלת מידע על מרבי הדם שניתן לאסוף נפח. הסכום המרבי של דם שצריך להיות שנאסף תלוי במצב המשקל ובריאות של החולדה. אל תיסוג יותר מ -15% מכלל נפח דם בתקופה של 14 יום. הערה: הדם הוא הרבה יותר קשה לגבות מבעלי החיים שהדגישו בחריפות בדקות לפני לטעום אוסף בגלל הורמוני לחץ להצר כלי הדם. לדוגמא, העברת כלוב בבית של החולדה לחדר רומן, לוקח כמה דקות כדי לעטוף את החיה, או החדרה חוזרת ונשנית של הצנתר לוריד כל סיכוי לעורר תגובת לחץ אקוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקל blooזרימת ד על ידי &#39;חליבה&#39; הווריד. הפעל את האצבע לאורכו של הווריד, מהבסיס לכיוון קצה הזנב, אבל להישאר יותר מ 2 סנטימטר מקצה המחט המוחדרת הצנתר או עשוי להיות שנעקר מהווריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דם לא יכול להיות שנאסף בהצלחה מהאתר הראשוני של חדירת צנתר, מחדש להכניס את המחט במעלה הווריד. אם הדם נאסף באתר הראשוני, מחדש חצים על המחט על ידי ניתוק וחיבור מחדש אז קטטר והמזרק לפני מחדש הכנסה בווריד. באופן כללי, למנוע חדירות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כחדירות מרובות יכולות לגרום לקריסת וריד זנב, שבו אספקת הדם לזנב מנותקת והרקמות הרכות הזנב הופכת necrotized, להרדים את העכברוש אם יש קריסת וריד זנב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר נאות נפח דגימה שנאסף, לשחרר לחץ במזרק על ידי ניתוק וחיבור מחדש את הקטטר. לשאוב מעט באמצעות בוכנת המזרק (~ 50 &amp; #181; יב), ולמשוך את המחט מהווריד. הערה: אם המחט נסוגה מבלי לשחרר את הלחץ הראשון במזרק, דם לטפטף מהמחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה להפעיל לחץ לאתר ההכנסה כדי לעצור את הדימום, ולנגב את האזור עם תמיסת חיטוי. להחזיר את החולדה לכלוב בבית שלה. </li></ol> 3. עיבוד דגימת הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר לשאוב כדי להבטיח שאין דם נשאר בתוך מחט קטטר, ולהשתמש במספריים לחתוך את צינור הצנתר בדיוק מעל המחט. לגרש את הדם לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר סטרילי. הערה: אם הדם נדחף דרך המחט, כוח הגז עלול לגרום לתאי דם אדומים להתפקע שיכול להפריע לרבי מבחני במורד הזרם. הסר את המחט, כדי למנוע המוליזה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף פלזמה דם, צינורות שימוש המכילים EDTA כנוגד קרישה (כאן, להשתמש 10 μl של 0.1 מ &#39;EDTA ל200-400 μl דם; להבטיח הריכוז של EDTA המשמש לא מפריע wה- i assay במורד הזרם) ומניחים על קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דגימות דם כל ב2,100 XG בצנטריפוגה בקירור (4 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות בתוך 10 דקות של אוסף. Elute הפלזמה, הימנעות מפריע שכבות תאי דם האדומות ולבנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף סרום דם, דגימות מקום (ללא נוגד קרישה) בטמפרטורת חדר למשך עד 30 דקות כדי לאפשר קרישה. ספין צינורות האיסוף בצנטריפוגה בקירור (4 מעלות צלזיוס) ב2,000 x גרם. הסרום עשוי אז להיות eluted. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות שימוש באופן מיידי, או בחנות ב -80 ° C עד שנה אחת. </li></ol>

<ol>
	<li>Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNAs+in+Patients+with+Acute+Myocardial+Infarction.">Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction.</a> Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).</li><li>Shah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+for+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Polyps:+Systematic+Review.">Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).</li><li>Chan, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+blood-based+protein+biomarker+strategies+in+the+study+of+psychiatric+disorders.">Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders.</a> Prog Neurobiol. , (2014).</li><li>Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+induces+learning+impairment+that+is+mediated+by+interleukin+1beta+in+rodents.">Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents.</a> PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).</li><li>Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+impairment+of+acquisition+of+a+spatial+memory+task+following+isoflurane-nitrous+oxide+anesthesia+in+rats.">Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats.</a> Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).</li><li>Vahl, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+ACTH+and+corticosterone+sampling+methods+in+rats.">Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).</li><li>Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+profile+of+peripheral+blood+in+rats+with+various+behavioral+characteristics+during+acute+emotional+stress.">Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress.</a> Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).</li><li>McEwen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+effects+of+stress+hormones+in+health+and+disease:+Understanding+the+protective+and+damaging+effects+of+stress+and+stress+mediators.">Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators.</a> Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).</li><li>Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+norepinephrine+and+epinephrine+concentrations+in+adrenal+gland+of+the+rats+submitted+to+acute+immobilization+stress.">Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress.</a> Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).</li><li>Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ghrelin-growth+hormone+axis+drives+stress-induced+vulnerability+to+enhanced+fear.">A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear.</a> Mol Psychiatry. , (2013).</li><li>Knoll, A. T., Carlezon, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynorphin,+stress,+and+depression.">Dynorphin, stress, and depression.</a> Brain Res. 1314 (56-73), (2010).</li><li>Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical/hippocampal+monoamines,+HPA-axis+changes+and+aversive+behavior+following+stress+and+restress+in+an+animal+model+of+post-traumatic+stress+disorder.">Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder.</a> Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

כאן אנו מתארים הליך מהיר ופשוט לקבלת דגימת דם מעכברוש המציע יתרונות משמעותיים על פני טכניקות נפוצות אחרות. ראשית, היא אינה דורשת הרדמה, בניגוד לדגימה מוריד הצוואר או בסינוסים retroorbital. כאשר דגימות דם נאספות סביב נהלי התנהגות, ממשל של הרדמה הוא לא רצוי, כי זה יכול להפריע ללמידה וזכרון 4,5. שנית, היא מציעה את היכולת לאסוף כמויות דם גדולות יותר מאשר טכניקות venipuncture אחרות, כגון גבייה מורידי דוושת saphenous או גב. באמצעות עד 1.5 מיליליטר של דם הטכניקה המתוארת כאן, ניתן לגבות מחולדה בנקודת זמן אחת, נפח שמאפשר בקלות מבחני מרובים כדי להפעיל במקביל. לבסוף, הליך זה מקטין את הפוטנציאל לנזק לרקמות בהשוואה לקטיעת קצה זנב או דימום retroorbital. השימוש בהליך זה מאפשר תאימות עם W בעלי החייםelfare חוק והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה, אשר דורש מזעור הכאב והמצוקה שנובע מהנהלים מעבדה שבוצעו על בעלי חיים. מומלץ כי חוקרים חדשים לשיטה זו לתרגל טכניקות איפוק ודימום זנב כדי למזער את הזמן שחיות ניסוי מרוסנות. דם שנאסף בפחות מ 3 דקות מפתיחת האיפוק מספק תוצאות אופטימליות. הפרוטוקול המתואר כאן עשוי לשמש לדגימת 1 עד 4 פעמים בשבוע, אך לא יותר מפעמיים ביום. בעוד אוספי דם חוזרים ונשנים עשויות להתבצע, יש להשתמש באתרי דגימה שונים נעו כלפי מעלה מבסיס הזנב, והוורידים זנב שמאלה וימינה צריכים להיות לסירוגין כאתרי דגימה. סך נפח הדם של מכרסמים הוא 6-7% ממשקל גופם, ולא יותר מ -15% מכלל נפח הדם צריכים להיות שנאספו בתקופה 2 בשבוע. סרוםאו פלזמה מהווה כ 40-60% מנפח הדגימה שנאסף. דגימת דם דרך ורידי זנב לרוחב עשויה גם להתבצע בעכבר כפי שמתוארת כאן עם כמה שינויים קלים. ראשית, ניתן להשתמש בצנתרים רק מד קטן (27 G). שנית, זה מומלץ להשתמש עוצר צינור, ולא לעטוף, כדי לשתק את העכברים. נפח דם שניתן לקבל מהעכבר באמצעות venipuncture של חבילת כלי דם submandibular (200-500 μl) הוא גדול יותר מאשר ניתן לאסוף בבטחה מוריד הזנב (200 מרבי μl). בגלל דגימת דם מכלי הדם הצרור submandibular דורשת איפוק מינימאלי ועשויה להניב יותר דם, זה המסלול המועדף לדגימה בעכבר. המהירות שבה הליך זה עשויה להתבצע, יחד עם הטבע פולשנית שלה, גם ממזערת את ההפרעה הפוטנציאלית של אמצעים המבוסס על דם על ידי תגובת הלחץ האקוטית 6.תגובת לחץ אקוטית יכולה לשנות את הרמות במחזור של מולקולות רבות, כוללים אינטרלויקינים וגורמי חיסון פעילים אחרים 7, הורמונים של ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-יותרת הכליה 8, הורמונים במערכת העצבים הסימפתטית 9, גרלין 10, אופיואידים אנדוגני 11, דופמין, ו סרוטונין 12. אם צעדי מנוחה במחזור של מולקולות או אחרים אלה מוסדרים על ידי מולקולות אלה רצויים, חשוב למזער את תגובת הלחץ, אשר מופעלת בתוך מעט ככל דקות של תחילת חשיפת לחץ. תגובות דחק לא רק לשנות את ההרכב של הדם, אלא גם מהוות מכשול טכני לדגימה בגלל ההתכווצות של כלי דם דם באמצעות כונן מוגבר ממערכת העצבים הסימפתטית. הוא הופך להיות קשה להשיג הגדלת זרימת דם יציבה מעכברוש שגובר תגובת לחץ אקוטית. לכן, המצוקה של בעלי החיים חייבת להיות מיניםized כדי להשיג במהירות דגימות המשקפות את המצב הפיזיולוגי של עניין.

סמנים ביולוגיים המתקבלים מהדם לספק שימושי אבחון, חיזוי, ויצרו רבדי אמצעים בהקשרים רבים קליניים, כולל מחלות לב וכלי דם 1, מדעי סרטן 2, ומחלה פסיכיאטרית 3. גם הם עשויים לשמש במדע בסיסי על מנת להעריך את &quot;המדינה&quot; של האורגניזם, כולל התואר של רעב, דלקת, או בהווה לחץ. יכולים להיות מושפעים בצעדים כאלה על ידי משתנים שעשויות או לא עשוי להיות קריטי לשאלה של עניין, כולל את השעה ביום שהמדגם מתקבל והמגדר של הנושאים. גם זה יכול להיות מושפע מהלחץ המושרה במהלך הליכי דגימת הדם עצמו. הורמוני לחץ ותפיסת כאב יכולים במהירות לשנות את ההרכב של הדם. מכרסמים הם חיות מעבדה הנפוצה ביותר, ומספר שיטות פותחו לאיסוף דם. השיטה האידיאלית של דגימת דם צריכה physiologica המינימליהשפעת l על בעלי החיים, לא דורשת הרדמה, מאפשרת דגימה מהירה וחזרה, ולספק מספיק נפח דם ליישומים במורד הזרם רבים. טכניקות העממיות לאיסוף דם כגון צנתור של קטיעת קצה וריד או זנב הצוואר אינו עומדים בקריטריונים אלה. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר טכניקת דגימת דם לשימוש בחולדות שהן מינימאלי מלחיץ, אינו דורשת הרדמה, מאפשרת לאוספים דם מרובים בנושא אחד, ומספקת גדול יחסית מדגם כך שמבחנים מרובים ניתן לבצע נפח על מדגם יחיד. מטרתה של שיטה זו היא להשיג דגימות דם שמושפעות באופן מינימאלי על ידי תגובת לחץ האקוטית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium heparin (1000 USP units/ml)</td>
			<td>Patternson Veterinary Supply</td>
			<td>25021040010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>JT Taylor</td>
			<td>JT2020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermachlor Rinse-Chlorhexadine</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>6356</td>
			<td>Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>TESV25BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Tuberculin 1cc syringes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BD309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89202-682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#956;l microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>21150-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, stainless steel, 5&#34;</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml plastic beaker</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>414004-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean cloth wrap</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Velcro tape, .75&#34; width</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>B004AF9II6</td>
			<td>Hook and loop tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling blood from the lateral tail vein of the rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

פלזמה דם שנאסף מוריד הזנב לרוחב כפי שתוארו בפרוטוקול נותנת מדגם פלזמה שהיה שקוף וצהוב חיוור בהופעה. כפי שניתן לראות באיור 1, המוליזה במדגם מקנה גוון אדום לפלזמה. תגובת הלחץ האקוטית יכולה במהירות לשנות את ההרכב של דם. לדוגמא, ריכוז corticosterone במחזור יכול להגדיל במידה ניכרת תוך 10 דקות של חשיפת לחץ, כפי שמוצג באיור 2. הרמות בסיסיות הנמוכה של corticosterone מתקבלות בשיטה זו לפני לחץ חשיפה עולות כי הליך הדגימה עצמו אינו מקור משמעותי של מתח. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig1.jpg" /> איור 1:. מדגם מראה לדוגמא () hemolyzed מוצג. לאחר צנטריפוגה, פלזמה או שכבת סרום (המשטח שצוין על ידי ar השחורשורה) מופיעה עם גוון ורוד או אדום. גוונים כהים יותר מצביעים על רמות גבוהות יותר של המוליזה. (ב) לאחר צנטריפוגה, מדגם שנאסף כראוי יהיה מראה ברור, צהבהב לרצועה העליונה (המשטח המסומן בחץ השחור), אשר תואמת את הפלזמה או בסרום-hemolyzed שאינו. בעת הסרת שכבה זו, חשוב לא להפריע את כל הדם הבסיסי, או על ידי לחיצה על קצה פיפטה לכל שכבת הדם או על ידי aspirating חלק מכל הדם לתוך הקצה. כל פלזמה או בסרום מזוהם עם כל דם צריכה להיות מושלכת. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig2.jpg" /> איור 2: corticosterone פלזמה הוא גבוה במהירות הבאה חוויה מלחיצה הדם התקבל מוריד הזנב לרוחב של חולדות ארוך אוונס נקבה בוגרות לפני 10 דקות ולאחר חשיפה ל4 גוונים (10 שניות, 2 kHz, 85 dB) שיתוף מסתיים. עם footshocks (1 שניות, 350 מיקרו-אמפר). corticosterone הפלזמה דם בתחילת המחקר (290.4 ± 138.8 pg / ml) היה פחות משמעותי מהרמות שנצפו 10 דקות לאחר הצגה של מתח footshock (2,204.8 ± 454.5 pg / ml, p = 0.02, n = 4), כפי שנקבע על ידי לא לזווג -test. * P &lt;0.05

Watch this Scientific Journal Video about Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat at JoVE.com

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

דגימת דם מוריד הזנב לרוחב של העכברוש

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

sampling-blood-from-the-lateral-tail-vein-of-the-rat

Research

JoVE Journal

Biology

101.9K Views.  Massachusetts Institute of Technology. Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Video: Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: retro-orbital sinus, jugular vein, maxillary vein, saphenous vein, heart. Each technique has its advantages and disadvantages, and some are not approved any more in some countries (e.g., retro-orbital draws in Holland). A discussion of different techniques for drawing blood are available 1-3.
Here, we present two techniques for drawing blood from rats, each with its specific applications.
Blood draw from the saphenous vein, provided it is done properly, induces minimal distress in animals and does not require anesthesia. This technique allows repeated draws of small amounts of blood, such as needed for pharmacokinetic studies 4,5, determining plasma chemistry, or blood counts 6.
Cardiac puncture allows the collection of large amounts of blood from a single animal (up to 10 ml of blood can be drawn from a 150 g rat). This technique is therefore very useful as a terminal procedure when drawing blood from the saphenous would not provide a large enough sample. We use cardiac puncture when we need sufficient amounts of serum from a specific strain of rats to grow T lymphocyte lines in vitro 4-9.

Blood draws are necessary in a large number of studies, for example to study the pharmacokinetics profile of a compound. Here, we demonstrate how to draw blood from rats using two techniques: blood draw from the saphenous vein or by cardiac puncture.

ציור דם מן החולדות דרך וריד Saphenous ועל ידי נקר לב

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

Micro-דיסקציה של מוח החולדה עבור הפקת RNA או חלבון מן אזור מסוים במוח

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates ...

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

והעשרה של תאים NK מ דם אדם עם קיט RosetteSep מ StemCell טכנולוגיות

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

דם אוסף של סרטן הפרסה האמריקאי, Limulus פוליפמוס

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

הכנת הגידים זנב עכברוש ללימודי biomechanical ו Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

כימות יחיד כלי דם קטנים בחדירות מבודדת-perfused דם עכברוש ריאות הכנה

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

טכניקות דגימת דם ללא מסוף בגינאה חזירים

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for detecting the successful establishment of blood chimerism in parabionts by a caudal vein injection of glucose. Parabiotic mice were constructed. Glucose was injected into the donor mouse through the tail vein, and the fluctuation of blood glucose level was measured in both mice using a blood glucometer at different time points. Our results showed that after glucose injection, the blood glucose level in donor mice increased sharply after 1 min and decreased slowly thereafter. Meanwhile, the blood glucose level of the recipient mice peaked 15 min after injection. Similar results were obtained with Evans blue, used as a positive control for glucose. The synchronous fluctuation of blood glucose levels indicates that blood flow between the two mice was established successfully.

Here we describe a new method of detecting successful establishment of shared blood circulation of two parabionts through a caudal vein injection of glucose, which causes minimal damage and is not fatal to the parabionts.

מזהה הקמת אספקת דם משותף בעכברים Parabiotic על ידי הזרקת הסוכר קאודל וריד

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...