מחקר זה מומן בחלקו על ידי איגוד הלב האמריקני להעניק 0950118G.to MC-W.

1. הכנת חרוזים מגנטיים אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות (Dynabeads) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן BSA 0.1% ב PBS על ידי ערבוב 50 מ&quot;ג BSA ב 50 מ&quot;ל PBS באמצעות מערבולת עד BSA מתמוסס. לעקר ידי סינון דרך המסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע TC, העברת 200 μl של resuspended גם אנטי עכברוש Dynabeads כבשים IgG לתוך צינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל ולשטוף את החרוזים: צינור על הר MPC ולתת לשבת במשך דקות על 1 כדי לאפשר חרוזים משקעים. לשאוב supernatant, להסיר את הצינור מתוך MPC ו resuspend את החרוזים של 1 מ&quot;ל סטרילי 0.1% BSA / PBS. פיפטה מעלה ומטה כדי resuspend חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף שלוש פעמים נוספות, ובסך הכל ארבע שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינור מ MPC ו resuspend את החרוזים 500 μl של 0.1% BSA / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl עכברוש אנטי עכבר PECAM-1 (CD-31) נוגדנים הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיועד לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר קר או 2 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים עם סטרילי 0.1% BSA / PBS כמתואר בשלב 1.2 ארבע פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צינור מ MPC ו resuspend את החרוזים 200 μl 0.1% BSA / PBS. חנות אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות Dynabeads על 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1. </li></ol> 2. בידוד ריאתי עכבר לתאי אנדותל מעכברים בילוד לפני שתמשיך עם פרוטוקול טיהור רקמות, IACUC אישור הוועדה של ההליך הנדרש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפעולות הבאות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 מ&quot;ל של תמיסת 1 C / D מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DMEM. מסנן עם מזרק 0.22 מיקרומטר לסנן חם 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 צינור חרוטי מ&quot;ל עם 15 מ&quot;ל DMEM, לאחסן על הקרח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד מדיה (IM) המכיל 20% FBS ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין ב DMEM </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;לטין 2%. מערבבים 2 גרם של עור שור ג&#39;לטין עם מים dd 100 מ&quot;ל, החיטוי 15 דקות בחנות ב 4 ° C. חם עד 37 ° C כדי לנזל לפני צלוחיות ציפוי TC. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי three 6-8 גורים יום ישנות באמצעות זריקה IP של קטמין (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג). בדיקת היעילות של הרדמה לנתח חיות אחד אחד, כדלקמן: גורים פין ללוח, להשרות עור עם אתנול 70% ולהסיר עור מאזור החזה במספריים לנתיחה סטרילית. כלוב הצלעות והבלו לחשוף את הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלו בסביבה נקייה מחיידקים אונות ריאה בודדות, נזהרים שלא לנתח את הסמפונות וכל רקמת חיבור גלוי סביב הריאות. מערבבים את כל הריאות ב קר כקרח DMEM. להרדים את הגורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה למכסה המנוע TC, להסיר אונות ריאה מן DMEM, מקום צלחת 100 מ&quot;מ ו - TC לשאוב DMEM עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים סטריליות, לקצץ את הרקמה דק ידי חיתוך ~ 100 פעמים. העברה 15 מ&quot;ל פתרון חמים C / D של עיכול אנזימטי. דגירה 45 דקות 37 ° C על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע TC, לשאוב את ההשעיה רקמות מעוכל לתוך מזרק כדי 20 מ&quot;ל עם 14 גרם גושים הצינורית מחוברת triturate לתוך ההשעיה תא בודד, לפחות 12 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור את ההשעיה רקמה דרך מסננת תא 70 מיקרומטר ו לשטוף את מסננת עם 15 מ&quot;ל IM להפסיק העיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה ההשעיה התא על ידי צנטריפוגה בשעה 400x גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל 0.1% BSA / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ההשעיה תא 5 הצינור מסביב לתחתית מ&quot;ל פוליסטירן ולהוסיף 22.5 μl אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות Dynabeads. מיועד בטמפרטורת החדר למשך 12 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל בקבוקון T75 עם 2 מ&quot;ל 2% לטין עודף לשאוב ג&#39;לטין. ג&#39;לטין אפשר להתייבש בתוך מכסה המנוע TC עבור כ -30 דקות לפני תאים ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה חרוז תושלם (שלב 2.10), השעיה לפצל תא באופן שווה לשלושה צינורות Eppendorf והר על MPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר החרוזים יש משקעים באמצעות MPC (~ 1 דקות), לאסוף supernatant, להסיר את הצינור מתוך MPC, לשטוף עם חרוזים ~ 1 מ&quot;ל 0.1% BSA / PBS, ולאחר מכן לעלות שוב על MPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף ארבע פעמים (סה&quot;כ 5 שוטף) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend ב 1 מ&quot;ל של VascuLife עם EnGS-MV גורמים החיים קיט 1x פניצילין / סטרפטומיצין (VL) לכל צינור, לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט על בקבוק T75 מראש מצופה להביא הנפח הכולל בבקבוק 10 מ&quot;ל כל אחד עם VL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התקשורת למחרת, לאפשר 1 יום שלם של צמיחה, ולאחר מכן שנה וחצי של התקשורת בכל יום אחר. כאשר התאים&gt; 70-80% ומחוברות או יותר (בדרך כלל לאחר 3-4 ימים של התרבות), הם יכולים להיות מסודר עם אנטי ICAM-2 Dynabeads. </li></ol> 3. הכנת אנטי ICAM-2-נוגדן מצומדות Dynabeads <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dynabeads Anti-ICAM-2-נוגדן מצומדות משמשים עוד לטהר תאים נבחרו עם אנטי PECAM-1 Dynabeads נוגדנים מצומדות ומתורבתים עד ומחוברות. הליך זה מבוצע כפי שתואר עבור Dynabeads אנטי PECAM-1-נוגדן מצומדות (1, לעיל), אלא אנטי עכבר ICAM-2 (CD-102) הנוגדנים משמש במקום נוגדן אנטי PECAM 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dynabeads Anti-ICAM-2-נוגדן מצומדות ניתן לאחסן 4 ° C עדחודש 1. </li></ol> 4. מיון ריאות עכבר לתאי אנדותל עם אנטי ICAM-2 Dynabeads <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> T75 מעיל רקמה תרבות בקבוק עם 2% ג&#39;לטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת מהבקבוק T75 ומחוברות עם תאים ולשטוף עם 8 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב PBS, להוסיף 2 מ&quot;ל 0.05% טריפסין / EDTA ולתת תאים לנתק (כ -5 דקות). הקש צלוחיות קלות לסייע ניתוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים יש מנותקת, להוסיף 2 מ&quot;ל IM לעכב תאים טריפסין ו לגרד לנתק את כל התאים הנותרים חסיד. העברת ההשעיה התא צינור 15 מ&quot;ל ו - ספין למטה 5 דקות בשעה 400x g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת resuspend תא גלולה ב 2 מ&quot;ל 0.1% BSA / PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים צינור 5 פוליסטירן מסביב לתחתית מ&quot;ל ולהוסיף 10 μl אנטי ICAM-2 Dynabeads. מיועד עבור 12 דקות RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול התא השעיה לשני 1.5 מ&quot;ל Eppendorf צינורות לעלות על MPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לאחר חרוזים דבקו למשך דקה אחת. הסר צינורות מ MPC ו resuspend כל הצינורית 1 מ&quot;ל 0.1% BSA / PBS. טען מחדש על MPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף ארבע פעמים (סה&quot;כ 5 שוטף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל צינור עם 1 מ&quot;ל VL ולבצע ספירת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים ב 250-350K תאים לכל בקבוק T25 ו / או 750 אלף-1 מיליון תאים לכל בקבוק T75. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו נפח VL 5 מ&quot;ל ב T25 צלוחיות, ו 10 מ&quot;ל ב T75 צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי התקשורת בכל יום אחר. תאים יכול לשמש בניסויים כאשר התרבות מגיע לכ 80% confluency, בדרך כלל 2-3 ימים. </li></ol> 5. נציג תוצאות בדרך כלל, לאחר 6-7 ימים מיום ההכנה הראשונית של התאים, אנו מסוגלים לקבל על 1.2-1.5 x 10 6 לתאי אנדותל ריאתי משלושה 6-8 גורים בני יומם. תאים להציג מורפולוגיה טיפוסית &quot;המרוצף&quot; תחת מיקרוסקופ אור ולהראות VE-cadherin (CD144) מכתים על תאים תאים צמתים, האופייני לתאי האנדותל (איור 1). רוב MLECs להביע VE-cadherin ו VEGFR2 כפי שמגלה הניתוח FACS (איור 2). בדרך כלל, אנחנו משתמשים בהם לניסויים תוך שבועיים לאחר הבידוד MLEC הראשונית. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ניתוח מיקרוסקופי של monolayer MLEC ומחוברות. (א) תמונת מיקרוסקופ אור המרוצף מראה מורפולוגיה של תאים בתרבית אופייני לתאי אנדותל. מבנים עגולים אחיד הממוקם באזור perinuclear של תאים רבים הם חרוזים מגנטיים המשמשים לבידוד MLEC. (ב) האנדותל ספציפי VE-cadherin הוא מקומי על תאים תאים צמתים כפי שמוצג באמצעות מיקרוסקופיה confocal. בר הוא נציג של 20μm. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2 ניתוח FACS של MLECs תרבותי שכותרתו עם נוגדנים ספציפיים עבור אנדותל הסמנים הספציפיים:. VE-cadherin (CD144) או VEGFR2, הוגש נגדו כתב אישום כמו, ואחריו נוגדן phycoerythrin-מצומדות משנית, מאשרת זהות אנדותל של MLECs מבודדים. הקו האדום מציין אלוטיפ ספציפי שליטה, הקו הירוק מציין VE אנטי-cadherin או אנטי VEGFR2 - ספציפי-IgG.

<ol>
	<li>Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+endothelial+cell+in+tissue+culture.">The human endothelial cell in tissue culture.</a> Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).</li><li>Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+murine+heart+and+lung+endothelial+cells+for+in+vitro+model+systems.">Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems.</a> Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium:+I.+Structure,+function,+and+mechanisms.">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circ Res. 100, 158-173 (2007).</li><li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells.">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).</li><li>Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+gliomas+of+different+WHO+grades.">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades.</a> J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).</li><li>Demeule, M., Labelle, M., R&#233;gina, A., Berthelet, F., B&#233;liveau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+brain,+lung,+and+kidney:+expression+of+the+multidrug+resistance+P-glycoprotein+isoforms.">Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).</li><li>Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+murine+inguinal+and+epididymal+adipose+tissues.">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues.</a> J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).</li><li>Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+human+vascular+endothelial+cadherin+(7B4/cadherin-5),+an+endothelium-specific+cadherin.">Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).</li><li>Zachary, I., Gliki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+transduction+mechanisms+mediating+biological+actions+of+the+vascular+endothelial+growth+factor+family.">Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family.</a> Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).</li><li>Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+heart-derived+endothelial+and+smooth+muscle+cell+cultures:+isolation,+cloning+and+characterization.">Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization.</a> Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).</li><li>Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture.">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li><li>Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C., Vansluys, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+angiogenesis,+endothelial+migration,+proliferation,+and+MAPK+signaling+in+Rap1b-deficient+mice.">Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice.</a> Blood. 111, 2647-2656 (2008).</li></ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי בית הספר לרפואה של ויסקונסין IACUC ועדת תחת פרוטוקול AUA # 00001206.

כלי הדם ECS הוכיחו להיות מודל שימושי בתחומים רבים של הביולוגיה כלי הדם הם האמינו להיות יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ללמוד (אנגיוגנזה למשל) מאשר HUVECs למד נרחב 3. בעבר, זה כבר דיווחו כי כלי הדם ECS ניתן להשיג, כליות רקמת לב, שומן, עור הרשתית, מוח, גליומות, וגם ריאה 2, 4-7, 10, 11. עם זאת, שיטה עקבית ואמינה הבידוד של כלי הדם ECS עדיין נדרשת. הנוהל המובא כאן הוא שינוי של הפרוטוקול שפורסם בעבר 2, זה שונה נהלים פרסם ביותר כי היא משתמשת במקום גורים של בעלי חיים מבוגרים. זה חיוני להצלחת בידוד כמו תאים מבעלי חיים צעירים בעלי פוטנציאל גבוה יותר ריבוי תרבויות שמקורם ברקמות שלהם נוטים להניב מספר גבוה יותר של תאים. אחת החיות בשבוע הישן נראה אופטימלי, אבל עכברים צעירים (4 בן יומו) יכול לשמש גם. כמו כן, מספר גבוה או נמוך של הגורים יכולה לשמש אם נדרש, כפי שאנו הצליחו לבודד MLECs מאחד הסיירים. עם זאת, בעוד דרוג כלפי מעלה או מטה את תהליך הבידוד, ציפוי צפיפות התאים חייב להישאר ללא שינוי, כמו זה גם קריטי עבור התפשטות תאים. תהליך צעד 2-טיהור MLECs באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדות הראשון נגד PECAM-1 ו מאשר אנטי ICAM-2 נוגדנים הוא הרבה יותר יעיל בהשגת טהור תרבויות EC מאשר אחד צעד את התהליכים שתוארו לעיל טיהור. פרוטוקול זה מבטל את הצורך להשתמש בטכניקות ידני מייגע מאוד, צנטריפוגה שיפוע FACS פחות יעיל מיון עבור תאים השלכת מזהמים כגון fibroblasts, כדוריות דם ותאי שריר חלק. האוכלוסייה MLEC וכתוצאה מכך ניתן להשתמש בניתוח מבחנה של תגובות angiogenic, חדירות כלי הדם גלגול ליקוציט, ריפוי פצעים, כמו גם ניתוח ביוכימי של מסלולי איתות. במידת הצורך, ניתן MLECs מצופה על גבי משטחים שונים כגון coverslips פיברונקטין או ג&#39;לטין מצופה עבור מערכים immunofluorescence או אלקטרודה עבור טרנס האנדותל (TER) מדידות של התנגדות. התוצאות המתקבלות ניתן להשוות ישירות פנוטיפים נצפתה in vivo, אשר חשוב במיוחד בהקשר של מספר גדל והולך של נוקאאוט קווי עכבר מהונדס. יישום מוצלח של השיטה עבור בניתוח מבחנה של מנגנוני הסלולר הבסיסית פגמים נצפתה in vivo, כבר הציגה 12.

<table><tbody><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15032-13</td><td></td></tr><tr><td>forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>14G cannula</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482516N</td><td></td></tr><tr><td>20 ml syringe</td><td>BD Biosciences</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110.35</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Particle Concentrator (MPC)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553369</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) </td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase (C/D)</td><td>Roche Group</td><td>11097113001</td><td>100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Skin Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL0004</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin/EDTA </td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;mu;m nylon</td><td>Falcon BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>tissue culture flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice

לתאי אנדותל לספק מודל מחקר שימושי בתחומים רבים של הביולוגיה וסקולרית. מאז הבידוד הראשון שלה 1, אדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVECs) הראו להיות נוח, קל להשיג והתרבות, ובכך הם לתאי אנדותל ביותר למד נרחב. עם זאת, המחקר התמקד בתהליכים כמו אחרים, אנגיוגנזה חדירות או רבים, לתאי אנדותל כלי הדם (ECS) הם מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית הרבה יותר ללמוד 2. יתר על כן, ECS מבודד עכברים knockout לספק כלי יעיל לניתוח של vivo תפקוד החלבון לשעבר. מספר גישות לבודד כלי הדם תרבות ECS ממוצא שונה דווחו עד כה 3-7, אבל הבידוד תרבות עקבית של טהור ECS עדיין בעיה טכנית גדולה במעבדות רבות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד על שיטה אמינה פשוטה יחסית של בידוד ועכבר culturing הריאות לתאי אנדותל (MLECs). בגישה זו, רקמת הריאה המתקבל 6 - עד היום-8 גורים הישן החתך הראשון לחתיכות, מעוכל עם collagenase / dispase (C / D) פתרון והתפזרו מכני לתוך ההשעיה תא בודד. MLECS הם מטוהרים מן ההשעיה התא באמצעות סלקציה חיובית עם נוגדן אנטי PECAM-1 מצומדות כדי Dynabeads מרוכז באמצעות חלקיקים מגנטיים (MPC). תאים אלה בתרבית מטוהרים על תרבות ג&#39;לטין מצופה רקמה (TC) מנות עד שהם הופכים ומחוברות. בשלב זה, התאים עוד מטוהרים באמצעות Dynabeads מצמידים את הנוגדן אנטי ICAM 2. MLECs שהושגו עם פרוטוקול זה תערוכה פנוטיפ המרוצף, דמיינו כפי מיקרוסקופיה שלב לעומת האור, פנוטיפ האנדותל שלהם אושרה באמצעות ניתוח FACS עם אנטי VE-cadherin 8 ואנטי VEGFR2 9 נוגדנים מכתים immunofluorescent של cadherin-VE. בידיים שלנו, זה הליך בן שני שלבים בידוד עקבית ומהימנה התשואות אוכלוסייה טהורה של MLECs, אשר יכול להיות מתורבת יותר. שיטה זו תאפשר לחוקרים לנצל מספר גדל והולך של בנוקאאוט ו העכברים הטרנסגניים ישירות לתאם במחקרים vivo עם תוצאות של ניסויים במבחנה שבוצעו על MLECs מבודד ובכך לסייע לחשוף את המנגנונים המולקולריים של פנוטיפים כלי דם נצפתה in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice at JoVE.com

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מקור.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

isolation-culture-pulmonary-endothelial-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

47.0K Views.  BloodCenter of Wisconsin. כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מק...

Video: Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

דור של קו הונצח Murine מוח כלי דם האנדותל סלולרי כ<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם מחסום דם מוח

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Neuroscience

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

בידוד והתרבות של תאי האנדותל מהמוח הקדמי עוברי

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional complex of tight and adherens junctions. Together with other cell-types such as astrocytes or pericytes, they form the neurovascular unit (NVU), which specifically regulates the interchange of fluids, molecules and cells between the peripheral blood and the CNS. Through this complex and dynamic system BMECs are involved in various processes maintaining the homeostasis of the CNS. A dysfunction of the BBB is observed as an essential step in the pathogenesis of many severe CNS diseases. However, specific and targeted therapies are very limited, as the underlying mechanisms are still far from being understood. 
Animal and in vitro models have been extensively used to gain in-depth understanding of complex physiological and pathophysiological processes. By reduction and simplification it is possible to focus the investigation on the subject of interest and to exclude a variety of confounding factors. However, comparability and transferability are also reduced in model systems, which have to be taken into account for evaluation. The most common animal models are based on mice, among other reasons, mainly due to the constantly increasing possibilities of methodology. In vitro studies of isolated murine BMECs might enable an in-depth analysis of their properties and of the blood-brain-barrier under physiological and pathophysiological conditions. Further insights into the complex mechanisms at the BBB potentially provide the basis for new therapeutic strategies.
This protocol describes a method to isolate primary murine microvascular endothelial cells by a sequence of physical and chemical purification steps. Special considerations for purity and cultivation of MBMECs as well as quality control, potential applications and limitations are discussed.

Brain microvascular endothelial cells (BMEC) are interconnected by specific junctional proteins forming a highly regulated barrier separating blood and the central nervous system (CNS), the so-called blood-brain-barrier (BBB). The isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells, as discussed in this protocol, enables detailed in vitro studies of the BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Medicine

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in medical conditions including diabetes, atherosclerosis, sepsis, and acute lung injury. A reliable and reproducible method to isolate pure endothelial cells from mice is needed to investigate the role of endothelial cells in the pathogenesis of these and other conditions. In this protocol, lung microvascular endothelial cells were prepared from 5-7 day old neonatal mouse pups. Lungs are harvested, minced, and enzymatically digested with collagenase I, and released cells are cultured overnight. Endothelial cells are then selected using anti-PECAM1 (CD-31) IgG conjugated to magnetic beads, and cells again are cultured to confluence. A secondary cell selection then occurs with anti-ICAM2 (CD-102) IgG conjugated to magnetic beads to increase the purity of the endothelial cells, and the cells again are cultured to confluence. The entire process takes approximately 7-10 days before the cells can be used for experimentation. This simple protocol yields highly pure (purity &#62;92%) endothelial cells that can be immediately used for in vitro studies, including the studies focused on endothelial cytokine and chemokine production, leukocyte-endothelial interactions, endothelial coagulation pathways, and endothelial permeability. With many knockouts and transgenic mouse lines available, this procedure also lends itself to understanding the function of specific genes expressed by endothelial cells in healthy and pathologic responses to injury, infection, and inflammation.

In this article, primary lung endothelial cells were isolated and cultured from neonatal mice.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

Immunology and Infection

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...