VSR נתמכה על ידי IIF מארי קירי גרנט (פצע באדמה, ראשי התיבות של: פצע מושרה אותות חשמליים בthaliana ארבידופסיס).

1. בכנימות לתי-פוסקת הערה: הבחירה של מיני צמחים וכנימה להקלטות EPG תלויה במטרת המחקר. למחקרים על thaliana ארבידופסיס, brassicae Brevicoryne הכנימה הוא מתאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האחורי ב כנימות brassicae בחממה על כרוב בר. שמור את הצמחים המשמשים לגידול כנימה בכלובים, כדי למנוע זיהום צמחים אחרים. שמור צמחי גידול-כנימה וצמחים ניסיוניים (בoleracea מקרה ב &#39;שלנו וא thaliana) בחדרים נפרדים, כדי למנוע זיהום של מפעלים ניסיוניים עם כנימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הכנימות לצמחים טריים על כל 2 שבועות, לפני שגרם נזק משמעותי צמח, או להגיע התפוצצות אוכלוסין. העבר 10-20 כנימות בוגרות למפעל גידול טרי ליזום מושבה חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג גידול צמחים באופן קבוע לזיהום על ידי מינים לא רצויים כנימה, אוכלי עשב חרקים אחרים, טפילי כנימה, וFungאני שעשוי להשפיע על הבריאות של המושבה הכנימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף מבוגרת, כנימות כנפיים עד שבוע לאחר נשירתם הסופית להקלטת EPG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסויים, להחזיר את הצמחים הניסיוניים שלא היו רגיל לתא הצמיחה, כפי שלעתים קרובות יש להם כמה צאצאים שהופקו במהלך ההקלטה, שלא מדעת יכולה לזהם צמחים אחרים. </li></ol> 2. חרקים חיווט להקלטת EPG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך אלקטרודות חרקים, להשיג הפינים פליז (ציפורניים, מ&quot;מ Ø 1.2), חוטי נחושת דקים (O 0.2 מ&quot;מ), חוט זהב דק מאוד (בערך Ø 20 מיקרומטר), דבק כסף על בסיס מים, בורג קטן הלחמה פשוטה עם נוזל הלחמה וחוט הלחמה-אבקי שרף, סטראו עם הגדלה 10X, מספריים קטנים או אזמל, שני מלקחיים עדינים, וגיליון קלקר או תיבה. הערה: מיקסר מערבולת עשוי להיות שימושי. הערה: פרוטוקול צעד-אחר-צעד כדי להפוך אלקטרודות מופיע באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכנימהטיפול ויישום דבק, להשיג: מברשת צמר גמלי צבעי מים קטנה ורכה (גודל 2 או קטן יותר) וסיכות חרקים כגון אלו המשמשים לאוספים חרקים, למרות שמחט תפירה עדינה או קיסם יכולה לעבוד גם כן. שלב 4 מראה כיצד להתחיל בהקלטת EPG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 1. הערה: שלבי 1 ו -2 להלן מראים כיצד להכין אלקטרודות חרקים מינוס הכנימה. שלב 3 מראה כיצד להתחבר כנימה לאלקטרודה. קיבעון אבק של הכנימה מומלץ בחיווט, אבל לא תמיד נדרש למינים איטיים נעו (למשל, ב brassicae). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את בורג ההלחמה ולהמס כמה חוט הלחמה בקצה (איור 2 א) שלה. להרטיב את הראש של סיכת מחבר פליז עם כמה נוזל הלחמה (איור 2) וטובל אותו במתכת ההלחמה נמסה (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נדן של מתכת מותכת הלחמה בקצה אחד של פיסה ארוכה של 1-2 סנטימטר של החוט נחושת הדק (איור2D). אז להביא את חוט הסיכה ונחושת יחד נגד הבורג החם (איור 2E) ולהעביר אותם יחד משם להתקרר ולחזק (איור 2F). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לנער (או מערבולת) הבקבוקון עם דבק כסף לכמה דקות, עד שתחליב חלק מוצג. Cut (מספריים או סכין מנתחים) כמה חתיכות של חוט הזהב (בסך של כ 1.5 ס&quot;מ אורך) על צלחת האובייקט של סטראו (איור 2G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח סיכת פליז עם חוטי נחושת מולחמים (שנעשו בסעיף 2.3) ולטבול את הקצה החופשי של חוטי הנחושת לתוך מאגר הדבק הקטן הכסף שאסף בבתוך המכסה של הבקבוקון לאחר פתיחתו (איור 2H). הערה: יש צורך רק טיפה קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הקצה טבל דבק של חוטי הנחושת לחתיכת חוט זהב, תוך הרמת קצה אחד כדי למנוע מריחה של הדבק לצלחת אובייקט סטראו. נסה חפיפה copper וחוט זהב לכמה מ&quot;מ (איור ט 2), הפצת הדבק לאורך החפיפה של שני חוטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהדבק כבר מיובש מספיק כדי לשמור על החוטים מאוחדים. בדוק את קשר הדבק לאחר הייבוש ולהוסיף קצת דבק טרי עם סיכה קטנה או פיסת החוט נחושת אחרת אם חלקים מסוימים של החוטים הצטרפו להראות חלקים ללא דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר האלקטרודה החרקים מוכנה, לאחסן אותו, לדוגמא מוכנסת לתוך חתיכת הקלקר. הערה: אורכו של חוט הזהב יקבע את חופש תנועה של הכנימה: אם הוא קצר מדי (פחות מ -5 מ&quot;מ), הכנימה עלולה להרגיש מוגבלת ולא התנהג בצורה נורמלית; אם זה ארוך מדי (&gt; 2 סנטימטר), הכנימה תהיה לנוע בחופשיות. כנימות נוטות לעבור לצד adaxial של עלים, אם מותר. אם חוט הזהב נוגע העלה, האות תהיה קצרה חשמלית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנימה עשויה להישמר במקום באמצעות יניקת אור, באמצעות ואקום; במקרה זה, לא להתקיןהוא יניקת מכשיר תחת סטראו. מניחים את פתיחת היניקה במרכז השדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות לנער את הבקבוקון עם דבק כסף לכמה דקות (או מערבולת) עד תחליב חלק נוצר. לאסוף כנימה עם המברשת הקטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מכשיר היניקה והר הכנימה על פתיחת היניקה (איור י 2), עם החלק האחורי של הבטן הפך לנסיין. עם המברשת העדינה, להסיר כל שעוות משטח מהבטן (בשפע בכנימות כרוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את בקבוקון הדבק ולהרטיב סיכה עם טיפה קטנה מאוד של דבק כסף (איור 2K). החל הטיפה של דבק הכסף על הגב של הבטן של הכנימה (איור 2L-M). בואו אגל זה יבש לחלוטין במשך כמה דקות, במרץ לנער את בקבוקון הדבק שוב ולהוסיף טיפה שנייה של דבק כסף על גבי הראשון. שים לב: בעוד דבק הכסף הוא מוליך חשמלי, הוא אינו גורם משמעותינזק לציפורן של החרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סגירת בקבוקון הדבק, הכנס את הקצה החופשי של חוט הזהב לתוך אגל הרטוב ולשמור על החוט עדיין תוך מתן אפשרות לדבק להתייבש לחלוטין (איור 2N). הימנע מריחת דבק על רגליים או אנטנות וזורקי כנימה אם זה קרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את מכשיר קיבוע היניקה ולהרים את החרק (איור 2 טו) בזהירות. במידת צורך, להשתמש במברשת עדינה כדי לסייע בהסרת הכנימה ממכשיר היניקה. הערה: חיווט ב brassicae אינו דורש ואקום, כפי שהם יכולים להיות חוטית על פיסת רקמת מעבדה דיוק, המשטח מחוספס של שמספקת כנימה עם מספיק אחיזה, כך שזה לא יהיה הרים לאחר החלת ירידה של דבק רטוב לבטן שלה. לאחר ייבוש דבק אחד יכול להרים את הכנימה מהרקמה בעזרת מברשת עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את סיכת פליז עם החרקים קווי לקלקר ואם יש צורך, להמשיךחיווט כל חרקים האחרים שישמש להקלטת EPG. הערה: פרוטוקולים אלה לחיווט כנימות לעבוד גם עבורנו. המשתמש יכול למצוא / שיטתו שלו לחיווט כנימות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים צמחים בכלוב פאראדיי (איור 2P) על תמיכה שאינה מוליכה: להשתמש צלחות פטרי או צלחת זכוכית או פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס אלקטרודה צמח באדמה של כל סיר. הכנס את סיכת הנחושת של החרקים קווי למחבר הקלט של הקדם-מגבר EPG (איור 2Q). הערה: את האלקטרודה הקרקע אינה מתאים לאלקטרודה הקרקע משמשת בטכניקות אלקטרו אחרות. יש לו את מתח היסט צורך להתאים ולפצות על מתחי קיטוב אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בממשק של התוכנה + stylet רכישה, עם תדר דגימה קבוע של 100 הרץ, הזן שם קובץ, ציין את זמן ההקלטה, ולכתוב טקסט כדי לציין את הפרטים של הניסוי (טיפול, צמח / inse<html> מיני CT, וכו &#39;) בשורות הערה 2 ו -3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את החרקים על אזור נחיתה מתאים של הצמח ולהתחיל בהפעלת ההקלטה על ידי לחיצה על הכפתור התחל של רכישת תוכנת ממשק (stylet +). הערה 1: מקסימום של 8 ערוצים ניתן להשתמש בו זמנית בEPG להגדיר. ניתן להשתמש באחד EPG-אלקטרודה או כמה EPG-אלקטרודות לכל צמח. הערה 2: כאשר המוקד של המחקר הוא כנימת ההתנהגות, להתחיל את ההקלטה לפני גישת מפעל של הכנימות, כדי למנוע חסר פעילויות חדירת המפעל הראשונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללימוד תגובות אלקטרו של SES לגירויים, להמתין לפחות 10 דקות לאחר הכנימה נכנסה לשלב השיפה, כדי להבטיח שהכנימה נמצאת בשלב בליעת השיפה מתמשך, וכי בסיס האות הוא יציב. רק אז, מתחיל כל ניסוי גירוי צמח. </li></ol></li></ol>tp_upload / 52,826 / 52826fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. ביצוע EPG-אלקטרודות עם כנימות או חרקים אחרים לhemipteran גרף חדירה חשמלי (EPG) הקלטות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לוחות AI, צעדים הנדרשים כדי להכין EPG-אלקטרודות מינוס הכנימה. ראשית, להמס חתיכת הלחמת מתכת על קצה בורג הלחמה (). לאחר מכן, לטבול את הראש של סיכת פליז לירידה של נוזל הלחמה (ב &#39;), וליצור קשר עם אותו עם המתכת המותכת בקצה בורג הלחמה (C). מייד לאחר שלב זה, פנה לסוף החוט נחושת ועד לקצה של בורג ההלחמה, כדי להדביק אותו לראש של סיכת פליז (EF). עם אזמל או להב, לחתוך חתיכה של חוט הזהב (G). טובליםאת הקצה החופשי של חוטי הנחושת (הצטרפו בקצה השני לפין פליז) על דבק הכסף (H), ומהירות להצטרף חוט הזהב אליו (אני) לפני הכסף מתייבש. חוט הזהב הוא מנצח מצוין, ויכול להיות מקוטב. במציאות, ברוב המכריע של המקרים הקיטוב הוא קטן מדי כדי להיות מזוהה, ואם כן, זה יכול להיות מתוגמל עבור עם מתח ההיסט (V). לוחות JO, צעדים הדרושים כדי להתחבר כנימה (או חרק hemipteran אחר) לאלקטרודה. ראשית, להרים בזהירות כנימה עם מברשת צבעי מים עדינה ומניח אותו על הפתיחה של מכשיר שאיבת ואקום (J). הפעל את משאבת הוואקום ולכסות את חור שסתום האוויר עם פיסת נייר ליישם יניקה. טובלים את הקצה של סיכת החרקים לדבק הכסף (K), ולשים טיפת דבק קטנה על גבי הבטן של הכנימה, תחת סטראו (LM). בתוך ה~ 20 שניות הבאות, לפני שאגל דבק כסף על מתייבש הכנימה, הכניסו את הקצה של חוט הזהב של האלקטרודה החרקים לתוך אגל הרטוב של דבק כסף, ולשמור אותו במקום 1-3 דקות, עד שדבק הכסף יש לחלוטין (N) האוויר היבש. בשלב זה, לבטל את היניקה על ידי הסרת פיסת נייר שמכסה את חור שסתום האוויר של מכשיר השאיבה ולהסיר את הכנימה בזהירות, ממכשיר היניקה: הרמת הכנימה לאחר חיווט לעתים קרובות דורש קצת עזרה על ידי מברשת עדינה (O). לוח P מציג סקירה של כל EPG להקים בתוך כלוב פאראדיי, ולוח Q מציג סקירה של שילוב צמח-הכנימה לEPG. ראה סעיף 2 לעיל לקבלת הסבר מפורט יותר של תהליך זה. אותיות קטנות הן תוויות המתייחסות לפריטים שצריך לעשות EPG-אלקטרודות:: בורג הלחמה; ב: נמסה הלחמת מתכת;ג: נוזל הלחמה; ד: סיכת נחושת מחבר (מסמר); דואר: חוטי נחושת; f: חוט זהב 18μm O; ז: מכשיר יניקה; שעות: כנימה; i: דבק כסף על בסיס מים; j: כלוב פאראדיי; יא: אלקטרודה צמח; l: מחבר קלט (BNC) של טרום-מגבר EPG.

<ol>
	<li>Salvador-Recatal&#224;, V., Tjallingii, W. F., Farmer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time,+in+vivo.+intracellular+recordings+of+caterpillar-induced+depolarization+waves+in+sieve+elements+using+aphid+electrodes.">Real-time, in vivo. intracellular recordings of caterpillar-induced depolarization waves in sieve elements using aphid electrodes.</a> New Phytologist. 203 (2), 674-684 (2014).</li><li>Van Bel, A. J., Knoblauch, M., Furch, A. C., Hafke, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Questions)n+on+phloem+biology.+1.+Electropotential+waves,+Ca2++fluxes+and+cellular+cascades+along+the+propagation+pathway.">(Questions)n on phloem biology. 1. Electropotential waves, Ca2+ fluxes and cellular cascades along the propagation pathway.</a> Plant Science. 181 (3), 210-218 (2011).</li><li>Rhodes, J. D., Thain, J. F., Wildon, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathway+for+electrical+signal+conduction+in+the+wounded+tomato+plant.">The pathway for electrical signal conduction in the wounded tomato plant.</a> Planta. 200, 50-57 (1996).</li><li>Fromm, J., Eschrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+ionic+movements+with+phloem+unloading+and+loading+in+barley+leaves.">Correlation of ionic movements with phloem unloading and loading in barley leaves.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 27, 577-585 (1989).</li><li>Brette, R., Destexhe, A., Brette, R., Destexhe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Recordings.">Intracellular Recordings.</a> Handbook of Neural Activity Measurement. , 44-91 (2012).</li><li>Umrath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untersuchungen+&#252;ber+Plasma+und+Plasamstromung+an+Characeen.+IV.+Potentialmessungen+an+Nitella+mucronata.+mit+besonderer+Ber&#252;cksichtingung+der+Erregungserscheinungen.">Untersuchungen &#252;ber Plasma und Plasamstromung an Characeen. IV. Potentialmessungen an Nitella mucronata. mit besonderer Ber&#252;cksichtingung der Erregungserscheinungen.</a> Protoplasma. 9, 576-597 (1930).</li><li>Umrath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Erregungsvorgang+bei+Nitella+mucronata.">Der Erregungsvorgang bei Nitella mucronata.</a> Protoplasma. 17, 258-300 (1932).</li><li>Carden, D. E., Walker, D. J., Flowers, T. J., Miller, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+measurements+of+the+contribution+of+cytosolic+Na++and+K++to+salt+tolerance.">Single-cell measurements of the contribution of cytosolic Na+ and K+ to salt tolerance.</a> Plant Physiology. 131 (2), 676-683 (2003).</li><li>Miles, P. W., McLean, D. L., Kinsey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+two+species+of+aphid+ingest+food+through+an+open+stylet+sheath.">Evidence that two species of aphid ingest food through an open stylet sheath.</a> Experientia. 20 (10), 582 (1964).</li><li>McLean, D. L., Kinsey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+electronically+recording+aphid+feeding+and+salivation.">A technique for electronically recording aphid feeding and salivation.</a> Nature. 202, 1358-1359 (1965).</li><li>Tjallingii, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+recording+of+penetration+behaviour+by+aphids.">Electronic recording of penetration behaviour by aphids.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 721-730 (1978).</li><li>Tjallingii, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potentials+as+an+indication+for+plant+cell+penetration+by+aphid+stylets.">Membrane potentials as an indication for plant cell penetration by aphid stylets.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 38, 187-193 (1985).</li><li>Alvarez, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+Solanum+stoloniferum.+responses+to+probing+by+the+green+peach+aphid+Myzus+persicae.+and+the+potato+aphid+Macrosiphum+euphorbiae.">Comparative analysis of Solanum stoloniferum. responses to probing by the green peach aphid Myzus persicae. and the potato aphid Macrosiphum euphorbiae.</a> Insect Science. 20 (2), 207-227 (2013).</li><li>Carmo-Sousa, M., Moreno, A., Garzo, E., Fereres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-persistently+transmitted+virus+induces+a+pull-push+strategy+in+its+aphid+vector+to+optimize+transmission+and+spread.">A non-persistently transmitted virus induces a pull-push strategy in its aphid vector to optimize transmission and spread.</a> Virus Research. 186, 38-46 (2014).</li><li>Jacobson, A. L., Kennedy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Penetration+Graph+studies+to+investigate+the+effects+of+cyantraniliprole+on+feeding+behavior+of+Myzus+persicae.+(Hemiptera:+Aphididae)+on+Capsicum+annuum.">Electrical Penetration Graph studies to investigate the effects of cyantraniliprole on feeding behavior of Myzus persicae. (Hemiptera: Aphididae) on Capsicum annuum.</a> Pest Management Science. 70 (5), 836-840 (2014).</li><li>Morris, G., Foster, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duelling+aphids:+electrical+penetration+graphs+reveal+the+value+of+fighting+for+a+feeding+site.">Duelling aphids: electrical penetration graphs reveal the value of fighting for a feeding site.</a> Journal of Experimental Biology. 211 (9), 1490-1494 (2008).</li></ol>

WFT launched EPG Systems as a retirement activity, and is affiliated with it financially.

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט להכנת החשמל חדירה גרף הקלטות (EPG). טכניקת EPG היא מבוססת היטב, עם 100-200 משתמשים פעילים ברחבי העולם, וזה יושם למחקרים רבים בנושאים שונים, לדוגמא: א) התנגדות צמח מארח לכנימות וחרקים נושאי stylet אחרים 13; מנגנוני תמסורת ב) וירוס צמח והפתוגן 14;</...

היכולת לייצר אותות חשמליים למרחקים ארוכים היא תכונת יתרון של אורגניזמים רב-תאיים, המאפשרת לתגובות יעילים לגירויים חיצוניים. תכונה זו התפתחה באופן עצמאי בצמחים ובעלי חיים, ובכך מייצגת מקרה של אבולוציה מתכנסת. בהתחשב בכך שאותות חשמליים בשילוב עם פונקציות חשובות בבעלי חיים כגון העברת עצבית והתכווצות שרירים, בסיס המולקולרי, מנגנון של העברת, ופונקציה של אותות חשמליים הנוצר על-גירוי בבעלי חיים הם נושאים של מחקר אינטנסיבי. בניגוד לכך, איתות חשמלית מושרה גירוי בצמחים זכתה לתשומת לב מחקרית קטנה. למרות שיש לי צמחים אין עצבים או שרירים, נראה שיש מספיק ראיות כדי להניח שאותות חשמליים הנוצר על-הגירוי בצמחים לשחק תפקיד מפתח בתגובותיהם לגורמים סביבתיים. השיפה, מרכיב החיים של כלי דם המפעל, כבר הניח כמשנה עיקריstrate להעברת אותות חשמליים הנוצר על-גירוי, מגירוי / פגומה לאזורי מגורה שאינם / ניזוק 2. התאים העיקריים בהשיפה הם אלמנטים המסננת (SES), תאים פשוטים יחסית, מוארכים. הקצוות של SES מחוברים לSEs האחר, ויצרו נמוכה התנגדות מתמשכת,, מערכת צינור מסננת שהתפשטה ברחבי המפעל. יש, עם זאת, מעט מאוד מחקרים על התכונות חשמליות של תאים מאוד מיוחדים אלה. במחקרים הקודמים אלה, חוקרי הגישה SEs גם עם זכוכית מיקרו-אלקטרודות 3 stylets או הוכנס-לשתול עם אלקטרודות זכוכית שמצמידות את כנימות, לאחר stylectomy (חיתוך) 4. microelectrodes הזכוכית עשוי מזכוכית נימים שהם משכו בקצה אחד עם חום לקצה קנס של פחות מ 1 מיקרומטר בקוטר, ולאחר מכן מלאה עם פתרון KCl. חוט Ag / AgCl או פלטינה, מוכנס לתוך אלקטרודת הזכוכית מלאה-KCl אז מחובר לכניסת המגבר, ורפרנטאלקטרודה מוכנסת לתוך האמבטיה המקיפה את התא של עניין, השלימה המעגל. התקנה זו מתעדת את ההבדל בפוטנציאל בין האלקטרודה תאי הרפרנט ואלקטרודה המדידה תאית, כלומר, פוטנציאל הממברנה של התא 5. בשיטה זו, Umrath עשה ההקלטה תאית הראשונה מתא צמח, באמצעות Nitella אצות 6,7. Nitella הוא אורגניזם פשוט יחסית עם תאים גדולים, ולכן נוח לניסויי אלקטרופיזיולוגיה תאיים. לעומת זאת, ההכנסה של אלקטרודות זכוכית תאיות לתוך התאים הקטנים של צמחים רב-תאי, תלת-ממדיים של כדור הארץ היא תובענית מבחינה טכנית, דורשת חוקר מיומן, כמו גם להדמיה מתוחכמת, מיקרומניפולציה, וציוד נגד רעידות. למרות אלקטרודות זכוכית מתאימות כדי להקליט מהתאים שטחיים בצמחים, כגון תאי האפידרמיס שורש 8, recordin תאיתGS מהתאים מוטבע עמוק ברקמה של הצמח, כגון SES, תגובות הנגרמים נזק סיבה סבירה מאוד, מבלבל את התוצאות. בשנת 1989, פרום וEschrich דיווחו על השימוש בשיטה חלופית, שנקראו &quot;שיטת הכנימה &#39;, שבו אלקטרודות זכוכית הם מצמידים לstylets כנימה לאחר stylectomy 4. שיטת הכנימה היא פולשנית, כי stylets גמיש לא לגרום נזק לרקמות או תאים כאלקטרודות זכוכית לעשות. stylets הכנימה הוא ההמצאה הגדולה של הטבע לחדירת צמח, וכנימות הן הרבה יותר מאשר בני אדם מיומנות במציאת SES. למרבה הצער, שיטה זו היא גם כנימה תובענית ביותר במונחים של מומחיות וציוד טכניים. בנוסף, ההצלחה של כל ניסוי שמיישם טכניקה זו תלויה לחלוטין בלהיות במצב האכלת כנימה - עם stylet הוכנס ביציבות לSE, בעת stylectomy. חשיבה ברטרוספקטיבית, אפשר לראות שהסיכויים הצלחה של טכניקה זו היו יכולים להיות שליmproved על ידי הוספה להגדרת ניסוי מכשיר המאפשר זיהוי או לא stylet הכנימה הוא בSE בעת החלת stylectomy. בשנת 1964, מקלין וקינסי תיארו &quot;מערכת ניטור אלקטרונית&quot; לחקר התנהגות ההאכלה של כנימות בזמן אמת 9,10. במערכת זו, הכנימה והצמח-חדר stylet שולבו מעגל חשמלי. מאוחר יותר, בשנת 1978, Tjallingii המציא גרסה שונה של המערכת, הנקרא מערכת &quot;חשמל חדירה גרף&quot; (EPG) 11,12. בעוד מערכת הניטור האלקטרונית המקורית הייתה רגישה לפוטנציאלים-מקור התנגדות בלבד, עם מערכת ה- EPG, כוח electromotive (EMF) שמקורה פוטנציאלים, כלומר, שנוצרו במפעל או בחרקים, יכולים להיות מוקלטים, בנוסף לפוטנציאל הנובע מ התנגדות (R) בחרקים. זה מייצג שיפור חשוב, משום ששניהם אות הרכיבים, EMF וR,לספק מידע רלוונטי ביולוגי על אירועים במהלך חדירת מפעל על ידי כנימות. מה עושה קדם מגבר EPG רגיש לR-הרכיבים הוא התנגדות הקלט הנמוכה יחסית של 1 GΩ, שהוא קרוב לממוצע של התנגדות צמח / כנימה. מתח היסט קטן (איור 1, V) בסך של כ +100 mV מוחל על הצמח, אשר לאחר מכן מחולק על פני צמח וחרקים בצד אחד, והתנגדות הקלט בצד השני. המתחים ושינוייהם נמדדים בנקודה (איור 1 א &#39;, ב&#39;) בין החרקים ונגד הקלט. לכן, R-הרכיבים מייצגים אפנון התנגדות צמח-כנימה של מתח ההיסט, ואילו EMF-הרכיבים הם חלק מסוים של פוטנציאלי צמח בקצה stylet ופוטנציאלים שנגרמו בחרקים. פוטנציאלי הצמח - הרלוונטיים ביותר כאן - הם פוטנציאל בעיקר קרום של תאי הצמח ניקבו ידי stylets הכנימה. פוטנציאלי החרקים נראים בעיקרפוטנציאל הזרמה נגרמת על ידי תנועות נוזל בתוך שתי תעלות stylet, כלומר, מזון ותעלות הרוק; אין פוטנציאלי עצב או שריר פנימיים נרשמים בEPG. בפועל, פונקציות קצה stylet כקצה האלקטרודה. כל תאי הצמח טעונים שלילי בתוך ביחס למחוץ החיובי של התא. הזרם החשמלי (כלומר, התנועה של יונים טעונים בתמיסה מימית) זורמים מבפנים ללהיפך מחוץ וסגנו מאוד מוגבל בשל העמידות הגבוהה של קרום התא. בדרך כלל פוטנציאל המנוחה נשמר קבוע. עם זאת, כאשר יונים שליליים לצאת או יונים חיוביים לעבור דרך קרום התא, את פוטנציאל הקרום מופחת, כלומר, זה depolarizes &#39;. שלילת קוטביות מתרחשת במקרה של עירור תא. יונים ולאחר מכן לעבור פנימה או החוצה כאשר תעלות יונים מסוימות בקרום נפתחות או כאשר הקרום פגום ויונים לדלוף פנימה והחוצה. כל התאים תעלות יונים ומשאבות בtהוא פלזמת קרום שיביא את פוטנציאל הממברנה לרמת המנוחה שלה על ידי שחזור הריכוז המקורי של יונים שונים בתוך התא. פוטנציאל המנוחה והשינויים שלה הם רכיבי EMF, ולכן, טכניקת EPG מתאימה למדוד אותם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52826/52826fig1.jpg" /> איור 1. EPG-אלקטרודות. EPG-אלקטרודה היא כנימת חיים משולבת במעגל חשמלי חדירה גרף (EPG), stylet שמוכנס לתוך אלמנט מסננת (SE) במצב האכלה יציב. אם SE-משופד stylet הוא במנוחה (פנל), המתח במעגל, שנרשם על ידי EPG, יציב וברמת מתח המנוחה (לוח C, מנוחה). אם SE הוא נרגש, depolarizes הקרום (לוח ב &#39;), שהיא דמיינה בEPG כמו עלייה הדרגתית במתח (פנל C, שלילת קוטביות). כאיזון היוני בSE חוזר לנוח, כלומר, זה repolarizes, המתח נרשם על ידי EPG יורד בהדרגה לרמת פוטנציאל המנוחה (לוח C, repolarization). בפנל C, &quot;&quot; ו &quot;B&quot; מתייחסים לתרחישים המוצגים בלוחות A ו- B, בהתאמה. V = מקור מתח היסט מתכוונן. הר&quot;י = נגד קלט. במקביל לנגד החיצוני 1 GΩ, יש המגבר 1.5 נגד TΩ (לוחות A ו- B, באפור) גבוהים פנימי (בopamp). בשלט רחוק של המתג מראש מגבר EPG יכול להיות שונה מרגיל לEMF-מצב, המאפשר קבלת ערכי מתח מדויקים ביותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52826/52826fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בחלק הבא, אנו מספקים את הקורא עם פרוטוקול בסיסי לביצוע ניסויי EPG שתקף לשני מחקרים המתמקדים בחרקים וממוקדים-צמח.

<table><tbody><tr><td>Brass connector pins</td><td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>&amp;Phi; 1.2 mm</td></tr><tr><td>Thin copper wire</td><td>EPG Systems/hardw.shop</td><td></td><td>approx. &amp;Phi; 0.2 mm</td></tr><tr><td>Thin gold wire</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>&amp;Phi; 18 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Soldering fluid</td><td>hardware shop</td><td></td><td>matching the soldering wire</td></tr><tr><td>Resin-cored soldering wire</td><td>hardware shop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water-based silver glue</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.epgsystems.eu/&quot;&gt;recipe in: www.epgsystems.eu&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Paper wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Soldering bolt</td><td>any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Hund Wetzlar</td><td></td><td>minimum magnification is 10X</td></tr><tr><td>Small scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>A. Hartenstein</td><td>L46</td><td></td></tr><tr><td>Watercolor brushes</td><td>any</td><td></td><td>Number 1 or 2</td></tr><tr><td>Air suction device</td><td></td><td></td><td>see description in: www.epgsystems.eu</td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>any</td><td></td><td>No. 1 or 2</td></tr><tr><td>Solid table</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td></td><td></td><td>Hand made</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Fujitsu Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition software</td><td>EPG Systems</td><td></td><td>Stylet+d</td></tr><tr><td>Giga-4 (-8) Complete System</td><td>EPG Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>includes the following:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Main control box with USB output</td><td></td><td>Di155/Di710</td><td>12/14 bit, rate 100&amp;nbsp;Hz (softw. fixed)</td></tr><tr><td>EPG probes 4 (8)</td><td></td><td></td><td>50x DC pre-amplifier</td></tr><tr><td>Swivel clamps on rod</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC power adaptor</td><td></td><td></td><td>bipolar, 230/115 VAC to -/+8 VDC</td></tr><tr><td>Plant electrodes and cables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Additional test and ground cables&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a new application of the electrical penetration graph (epg) for acquiring and measuring electrical signals in phloem sieve elements

תכונות אלקטרו של תאים לעתים קרובות למדו במבחנה, לאחר מתנער מהם הסביבות האם שלהם. עם זאת, המחקר של הולכה חשמלית בין תאים מרוחקים באורגניזם דורש in vivo, הקלטות ללא ממצא של תאים המוטבעים בתוך הסביבה הטבעית שלהם. השידור של אותות חשמליים מפצועים לאזורים הלא-פצועים במפעל מאז ארוך מעורר את העניין של בוטנאים. השיפה, החלק החי של כלי דם הצמח שהתפשט ברחבי המפעל, כבר הניח כרקמה גדולה בשידור חשמל במפעלים. חוסר שיטות אלקטרו המתאימים מציב אתגרים רבים לחקר התכונות החשמליים של תאי השיפה in vivo. כאן אנו מציגים גישה חדשנית לאלקטרופיזיולוגיה תאית של אלמנטים מסננת (SES) המשתמשת בכנימות חיים, או חרקים hemipteran השיפה האכלה אחרים, משולבת בהגר&quot;א החדירה החשמליph מעגל (EPG). צדדיות, החוסן, והדיוק של שיטה זו אפשרו להקליט וללמוד בפירוט את האותות חשמליים הנוצר על-הפצע בSEs של ורידים של thaliana ארבידופסיס צמח מודל 1 מרכזיים. כאן אנו מראים כי EPG-אלקטרודות יכולות להיות מיושמות בקלות לקלטות אלקטרו תאיות של SES בעורקים שוליים, כמו גם ללמוד את היכולת של SES להגיב באותות חשמליים לכמה גירויים חיצוניים. גישת EPG להחיל אלקטרופיזיולוגיה תאית של SES יכולה להיות מיושמת למגוון רחב של מיני צמחים, במספר רב של שילובי צמחים / חרקים, ועבור רבים מחקר המטרה.

במחקר קודם, שיישמנו את טכניקת EPG-אלקטרודה במטרה לאפיין את האותות החשמליים המיוצרים בSEs של midvein במהלך התקפת זחל 1. Midvein הוא אתר מועדף להחדרת אלקטרודות זכוכית קונבנציונליות, כמו גם עבור אלקטרודות הזכוכית stylet, כי זה SE-צפוף, וחזק יחסית, ולכן ניתנים לקיבוע הדרוש ליישום ...

Watch this Scientific Journal Video about A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements at JoVE.com

A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants.

יישום חדש של החשמל חדירה הגרף (EPG) לרכישה ומדידת אותות חשמליים שביפים מסננת אלמנטים

Electrophysiological properties of cells are often studied in vitro, after dissociating them from their native environments. However, the study of ...

a-new-application-electrical-penetration-graph-epg-for-acquiring

Research

JoVE Journal

Environment

A New Application of the Electrical Penetration Graph (EPG) for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

14.7K Views.  University of Würzburg. Electrical Penetration Graph (EPG) is a well-established technique for studying the feeding behavior of stylet-bearing insects. Here we show a new application of EPG as a non-invasive tool for the acquisition of intracellular electrophysiology recordings of sieve elements (SEs), the cells that form the phloem vasculature in plants. 

Video: A New Application of the Electrical Penetration Graph EPG for Acquiring and Measuring Electrical Signals in Phloem Sieve Elements

Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. For example, they play an important role in directing cell migration during wound healing. Here we describe the manufacture and use of ultrasensitive vibrating probes for measuring extracellular electric currents. The probe is an insulated, sharpened metal wire with a small platinum-black tip (30-35 &mu;m), which can detect ionic currents in the &mu;A/cm2 range in physiological saline. The probe is vibrated at about 200 Hz by a piezoelectric bender. In the presence of an ionic current, the probe detects a voltage difference between the extremes of its movement. A lock-in amplifier filters out extraneous noise by locking on to the probe's frequency of vibration. Data are recorded onto computer. The probe is calibrated at the start and end of experiments in appropriate saline, using a chamber which applies a current of exactly 1.5 &mu;A/cm2. We describe how to make the probes, set up the system and calibrate. We also demonstrate the technique of cornea measurement, and show some representative results from different specimens (cornea, skin, brain).

The manufacture, calibration and use of non-invasive vibrating probes to measure bioelectric current in various biological systems is described.

מדידת נוכחי Bioelectric עם בדיקה רטט

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

Bioengineering

Development of a 3D Graphene Electrode Dielectrophoretic Device

The design and fabrication of a novel 3D electrode microdevice using 50 &#181;m thick graphene paper and 100 &#181;m double sided tape is described. The protocol details the procedures to construct a versatile, reusable, multiple layer, laminated dielectrophoresis chamber. Specifically, six layers of 50 &#181;m x&#160;0.7 cm x&#160;2 cm graphene paper and five layers of double sided tape were alternately stacked together, then clamped to a glass slide. Then a 700 &#956;m diameter micro-well was drilled through the laminated structure using a computer-controlled micro drilling machine. Insulating properties of the tape layer between adjacent graphene layers were assured by resistance tests. Silver conductive epoxy connected alternate layers of graphene paper and formed stable connections between the graphene paper and external copper wire electrodes. The finished device was then clamped and sealed to a glass slide. The electric field gradient was modeled within the multi-layer device. Dielectrophoretic behaviors of 6 &#956;m polystyrene beads were demonstrated in the 1 mm deep micro-well, with medium conductivities ranging from 0.0001 S/m to 1.3 S/m, and applied signal frequencies from 100 Hz to 10 MHz. Negative dielectrophoretic responses were observed in three dimensions over most of the conductivity-frequency space and cross-over frequency values are consistent with previously reported literature values. The device did not prevent AC electroosmosis and electrothermal flows, which occurred in the low and high frequency regions, respectively. The graphene paper utilized in this device is versatile and could subsequently function as a biosensor after dielectrophoretic characterizations are complete.

A microdevice with high throughput potential is used to demonstrate three-dimensional (3D) dielectrophoresis (DEP) with novel materials. Graphene nanoplatelet paper and double sided tape were alternately stacked; a 700 &#956;m micro-well was drilled transverse to the layers. DEP behavior of polystyrene beads was demonstrated in the micro-well.

פיתוח של התקנים 3D גראפן אלקטרודה dielectrophoretic

The design and fabrication of a novel 3D electrode microdevice using 50 &#181;m thick graphene paper and 100 &#181;m double sided tape is described. The ...

Engineering

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under physiologically relevant conditions.1 These measurements are performed on living biofilms in aqueous medium using source and drain electrodes patterned on a glass surface in a specialized configuration referred to as an interdigitated electrode (IDA) array. A biofilm is grown that extends across the gap connecting the source and drain. Potentials are applied to the electrodes (ES and ED) generating a source-drain current (ISD) through the biofilm between the electrodes. The dependency of electrical conductivity on gate potential (the average of the source and drain potentials, EG = [ED + ES]/2) is determined by systematically changing the gate potential and measuring the resulting source-drain current. The dependency of conductivity on gate potential provides mechanistic information about the extracellular electron transport process underlying the electrical conductivity of the specific biofilm under investigation. The electrochemical gating measurement method described here is based directly on that used by M. S. Wrighton2,3 and colleagues and R. W. Murray4,5,6 and colleagues in the 1980&#39;s to investigate thin film conductive polymers.

A protocol for measuring electrical conductivity of living microbial biofilms under physiologically relevant conditions is presented.

אפיון תחבורה אלקטרון דרך חיים Biofilms

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

Chemistry

Interfacing Microfluidics with Microelectrode Arrays for Studying Neuronal Communication and Axonal Signal Propagation

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of electrophysiological activity for long periods. However, the property of sensing signals from all sources around every microelectrode can become unfavorable when trying to understand communication and signal propagation in neuronal circuits. In a neuronal network, several neurons can be simultaneously activated and can generate overlapping action potentials, making it difficult to discriminate and track signal propagation. Considering this limitation, we have established an in vitro setup focused on assessing electrophysiological communication, which is able to isolate and amplify axonal signals with high spatial and temporal resolution. By interfacing microfluidic devices and MEAs, we are able to compartmentalize neuronal cultures with a well-controlled alignment of the axons and microelectrodes. This setup allows recordings of spike propagation with a high signal-to-noise ratio over the course of several weeks. Combined with specialized data analysis algorithms, it provides detailed quantification of several communication related properties such as propagation velocity, conduction failure, firing rate, anterograde spikes, and coding mechanisms.
This protocol demonstrates how to create a compartmentalized neuronal culture setup over substrate-integrated MEAs, how to culture neurons in this setup, and how to successfully record, analyze and interpret the results from such experiments. Here, we show how the established setup simplifies the understanding of neuronal communication and axonal signal propagation. These platforms pave the way for new in vitro models with engineered and controllable neuronal network topographies. They can be used in the context of homogeneous neuronal cultures, or with co-culture configurations where, for example, communication between sensory neurons and other cell types is monitored and assessed. This setup provides very interesting conditions to study, for example, neurodevelopment, neuronal circuits, information coding, neurodegeneration and neuroregeneration approaches.

This protocol aims to demonstrate how to combine in vitro microelectrode arrays with microfluidic devices for studying action potential transmission in neuronal cultures. Data analysis, namely the detection and characterization of propagating action potentials, is performed using a new advanced, yet user-friendly and freely available, computational tool.

התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב

Microelectrode arrays (MEAs) are widely used to study neuronal function in vitro. These devices allow concurrent non-invasive recording/stimulation of ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Neuroscience

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

ייצור והפעלה של זרימה רציפה, מערכת מיקרו-אלקטרופורציה עם זיהוי חלחול

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת השפעות אלקטרופורציה על תאי HEK מהונדסים גנטית

Monitoring Electroporation-Induced Changes in Action Potential Generation in Genetically Engineered Tet-On Spiking HEK cells

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be affected by electric pulses even in therapies where they are not the primary targets, and this can cause adverse side effects. Therefore, to optimize the electroporation-based treatments of excitable and non-excitable tissues, there is a need to study the effects of electric pulses on excitable cells, their ion channels, and excitability in vitro. For this purpose, a protocol was developed for optical monitoring of changes in action potential generation due to electroporation on a simple excitable cell model of genetically engineered tet-on spiking HEK cells. With the use of a fluorescent potentiometric dye, the changes in transmembrane voltage were monitored under a fluorescence microscope, and relevant parameters of cell responses were extracted automatically with a MATLAB application. This way, the excitable cell responses to different electric pulses and the interplay between excitation and electroporation could&#160;be efficiently evaluated.

<meta charset="utf8"></head><body>ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

For studying responses of excitable cells in vitro, the protocol describes optical monitoring of changes in action potential generation due to electroporation on a simple excitable cell model of genetically engineered tet-on spiking HEK cells as well as changes in transmembrane voltage with automated extraction of relevant parameters.

ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be ...

<meta charset="utf8"></head><body>שיטת TEEI לניתוח אלקטרופורציה וחיזוי מסירה בתאי A431

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other types of intracellular delivery, PSEP relies heavily on fluorescent markers and fluorescent microscopy to determine successful delivery. To gain insight into the intermediate steps of the electroporation process, a PSEP platform with integrated transepithelial electrical impedance (TEEI) monitoring was developed. Cells are cultured in commercially available inserts with porous membranes. After a 12 h incubation period to allow for the formation of a fully confluent cell monolayer, the inserts are placed in transfection media located in the wells of the PSEP device. The cell monolayers are then subjected to a user-defined waveform, and delivery efficiency is confirmed through fluorescent microscopy. This workflow can be significantly enhanced with TEEI measurements between pulsing and fluorescent microscopy to collect additional data on the PSEP process, and this additional TEEI data is correlated with delivery metrics such as delivery efficiency and viability. This article describes a protocol for performing PSEP with TEEI measurements.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: אופטימיזציה של אלקטרופורציה של מצע נקבובי באמצעות מיקרו וננו-ערוצים לניטור משופר ואפיון שלב ביניים

Porous substrate electroporation (PSEP) pairs consistent, high throughput delivery with high cell viability. Introduction of transepithelial electrical impedance (TEEI) measurements provides insight into the intermediate processes of PSEP and allows for label-free delivery. This article discusses a method for performing PSEP delivery experiments and TEEI measurement analysis simultaneously.

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other ...

יישום חדש של החשמל חדירה הגרף (EPG) לרכישה ומדידת אותות חשמליים שביפים מסננת אלמנטים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מדידת נוכחי Bioelectric עם בדיקה רטט

פיתוח של התקנים 3D גראפן אלקטרודה dielectrophoretic

אפיון תחבורה אלקטרון דרך חיים Biofilms

התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא

ייצור והפעלה של זרימה רציפה, מערכת מיקרו-אלקטרופורציה עם זיהוי חלחול

ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל