שיטה זו מאפשרת לחוקרים לקבוע תנאי פעימת אלקטרופורציה אופטימליים עבור סוג התא הרצוי, תוך מזעור הצורך בגישה הניסויית האמפירית המסורתית. שיטה זו משתמשת בטכניקות מיקרו-אלקטרופורציה כדי לייצר מכשיר הפעלה מיקרופלואידי הניתן להרחבה, המסוגל לנטר באופן חשמלי את מידת החדירה של קרום התא לאורך כל תהליך האלקטרופורציה. מי שידגים את ההליך יהיה קישנקומאר בושה, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, הצמידו את פרוסת הסיליקון לצ'אק של מעיל הספין של הוופל באמצעות מערכת הוואקום של מעיל הספין. ואז לתכנת את ספינר. לאחר מכן, לחלק ארבעה מיליליטר של SU-8 2010 תמונה להתנגד על מרכז פרוסת סיליקון ולהפעיל את התוכנית.
ברגע שהמערכת נעצרת, כבו את הוואקום. לאחר מכן אבטחו את מסכת הצילום עם עיצובי התעלה המיקרופלואידית הדו-ממדית על מחזיק המסכה והכניסו את פרוסת הסיליקון עם ציפוי SU-8 הפונה כלפי מעלה על צ'אק הוופל. קבע את הגדרות החשיפה עבור 150 מילי-ג'ול לסנטימטר מרובע והפעל את המכונה.
לאחר החשיפה לקרינת UV, טבלו את פרוסת הסיליקון בתמיסת המפתחים של SU-8 בתסיסה עדינה למשך שלוש עד ארבע דקות. לאחר מכן להסיר את רקיק מן התמיסה ולשטוף את פני השטח עם isopropanol. לאחר מכן, מכניסים את פרוסת הסיליקון לתנור של 150 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לאפייה קשה.
לאחר מכן אפשרו לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתשתמשו בפרופילומטריה של חרט כדי למדוד את הגובה והשיפוע המדויקים של הקירות הצדדיים של התעלה. לאחר מכן, לפזר מיליליטר אחד של התנגדות תמונה על פני השטח של שקופית זכוכית ולהפעיל את התוכנית שוב. לאחר שהמערכת נעצרת, כבו את השואב והסירו את מגלשת הזכוכית.
לאחר הידוק מסכת הצילום עם עיצובי האלקטרודה הדו-ממדית על מחזיק המסכה, הכנס ויישר את פרוסת הזכוכית עם ציפוי S-1818 הפונה כלפי מעלה על צ'אק הוופל. קבע את הגדרות החשיפה עבור 215 מילי-ג'ול לסנטימטר מרובע והפעל את המכונה. לאחר החשיפה, הטביע את שקופית הזכוכית בפתרון המפתחים MF-319 למשך שתי דקות, תוך הפעלת תסיסה עדינה.
לאחר מכן הסר את רקיק הזכוכית ושטוף את פני השטח שלו במים שעברו דה-יוניזציה. לבסוף, הכניסו את מגלשת הזכוכית לתנור של 150 מעלות צלזיוס לאפייה קשה, והבטיחו שמשטח המצעים של העניין פונה כלפי מעלה. לאחר 30 דקות, הסר את המגלשה מהתנור והגן עליה מפני אור.
כדי לחרוט את שקופית הזכוכית לטבול אותו בתמיסת חומצה הידרופלואורית חצוצרה של 10 עד 1 למשך דקה אחת במיכל polytetrafluoroethylene. לאחר מכן להעביר ולשטוף את שקופיות הזכוכית במים deionized שלוש פעמים. לאחר מכן, באמצעות מערכת תצהיר אדים פיזית מפזרים טיטניום במשך שמונה דקות בקצב של 100 אנגסטרומים לדקה ופלטינה למשך 10 דקות במהירות של 200 אנגסטרומים לדקה.
לאחר מכן, כדי להרים את התנגדות הצילום, טבלו את שקופיות הזכוכית המצופות במתכת באמבט אצטון למשך 10 דקות ופתחו את האמבטיה כדי להציג תסיסה. במידת הצורך יש להשתמש במגבון מושרה באצטון כדי להסיר שאריות. הבא עבור פולידימתילסילוקסן העתק יציקה עושה את בסיס אלסטומר PDMS עם מתקשה ביחס של 10 ל 1 משקל במיכל חד פעמי ממוקם על גבי איזון אלקטרוני.
לאחר מכן, שפכו את תמיסת ה-PDMS על פרוסת הסיליקון והניחו את התערובת מתחת לוואקום כדי להסיר בועות אוויר. לאחר ריפוי התערובת בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות, השתמש בקצה של סכין גילוח כדי לחתוך את PDMS יצוק ולקלף אותו מתוך פרוסת הסיליקון. לאחר מכן באמצעות אגרוף ביופסיה מחודד, הסר את ה- PDMS מהכניסה והשקעים של המכשיר.
לאחר מכן, תכנת את מחולל הפלזמה להדבקת PDMS. לאחר מכן הנח את שקופית ה- PDMS וזכוכית האלקטרודה לתוך המערכת כאשר התכונות פונות כלפי מעלה ומפעילות את התוכנית. לאחר השלמת התוכנית, הסר את המכשירים והשתמש בסטריאוסקופ כדי ליישר במהירות את תכונות הערוץ לאלקטרודות.
הפעל בחוזקה לחץ ממרכז ה- PDMS לכיוון הצדדים כדי להסיר בועות אוויר לא רצויות בממשק המליטה. קצירת תאי HEK293, צנטריפוגה שלהם, והשעיית הכדור במאגר אלקטרופורציה בכחמישה מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן, הוסף קידוד DNA פלזמה עבור GFP לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם למיליליטר וערבב בעדינות.
לאחר מכן מעבירים את תרחיף תאי הפלזמה-DNA למזרק של סנטימטר מעוקב אחד לצורך ניסויים. הניחו את המיקרו-מכשיר על במת המיקרוסקופ באמצעות מחזיק שקופיות. לאחר מכן הפעל את ההתקן המצומד הטעון, מצלמת CCD, והבא את הערוץ המיקרופלואידי למיקוד.
הבא עבור אלקטרופורציה של תא בודד, הגדר את קצב זרימת משאבת המזרק ל-0.1 עד 0.3 מיקרוליטר לדקה כדי להבטיח זרימה של תאים בודדים דרך ערכת האלקטרודות. לאחר מכן הגדר את פרמטרי הפולס עבור פולס האלקטרופורציה הראשונית והנמוכה ביותר של אנרגיה חשמלית. עקוב אחר מספר קבוע מראש של זיהויי תאים לכל יישום פולס.
בסוף כל מצב שנבדק, שאפו תאים משקע המיקרו-מכשיר ומלאו את השקע במדיית התאוששות. חזור למצב הבא של פולס אלקטרופורציה וחזור על הפעולה עד לבדיקת כל תנאי פולס האלקטרופורציה. לאחר מכן, קבע את הפרמטרים של פולס האלקטרופורציה עבור משוב מבוסס אוכלוסייה בתפוקה גבוהה.
עבור אלקטרופורציה מבוקרת משוב מבוססת אוכלוסייה, הגדר את קצב זרימת משאבת המזרק לאחד עד שלושה מיקרוליטרים לדקה והגדר את משרעת הדופק למצב האופטימלי. לאחר מכן כבה את מצב ההדק והגדר את רוחב הדופק כך שיתאים לזמן המעבר של התא. לאחר שמספר התאים הרצוי עבר אלקטרופוזה כבה הן את משאבת המזרק והן את מחולל הפונקציות.
לאחר מכן העבירו את התאים ממאגר היציאה לתוך בקבוק תרבית תאים בגודל מתאים או צלחת מלאה במדיית התאוששות שחוממה מראש והעבירו את בקבוק התרבית או הצלחת לאינקובטור. לניתוח נתונים, טען את הנתונים לתוכנת ניתוח וצור תרשים של זרם לעומת זמן עבור כל מצב פועם. לאחר מכן לקבוע את מידת החדירות של קרום התא, ליצור את מפת החדירה של קרום התא על פני כל תנאי הדופק שנבדקו, ולאמת את מצב הפעימה האופטימלי.
לאחר הדגירה, צלם תמונות אפי-פלואורסצנציה באמצעות FITC ומסננים אדומים רחוקים, ונתח את ערכות התמונות באופן ידני או באמצעות אלגוריתם. עקרונות הפעולה מאחורי זיהוי חלחול ברמת התא הבודד עבור משרעת פעימה בודדת מודגשים כאן. לאחר כל פרמטר של פולס אלקטרופורציה, נבדק פולס האלקטרופורציה באנרגיה הגבוהה ביותר.
מפת החדירה של קרום התא עבור תאי HEK293 הראתה מתאם מובהק בין האנרגיה החשמלית המופעלת לבין מידת החדירה של קרום התא. בניסוי זה, עוצמת שדה חשמלי של 1.8 קילו-וולט לסנטימטר ופולס של 670 מיקרו-שניות נקבעה כאופטימלית. בערכים אלה הושגה יעילות אלקטרו-טרנספקציה של 70%.
בניגוד לחוזק שדה חשמלי של 0.4 קילו-וולט לסנטימטר ומשך פעימה של שלוש אלפיות השנייה, יעילות האלקטרו-טרנספקציה ב-24 שעות הייתה פחות מ-5% המונח מתכון, המשמש לעתים קרובות כאשר מתארים את הספציפי של תהליך הייצור הזעיר הוסף את החשיבות של מעקב או אופטימיזציה של כל שלב כדי לייצר בהצלחה מכשיר מתפקד. ניתן להשתמש בטכנולוגיית אלקטרופורציה זו בפרויקטים נוספים של מחקר ביו-רפואי כגון ייצור ובדיקה של תאי CAR T או אופטימיזציה ובדיקה של טכניקות עריכת גנים של CRISPR-Cas9. טכנולוגיית מיקרו-אלקטרופורציה זו מאפשרת חקירה חשמלית של תגובות של סוגי תאים שונים כדי ליישם את תנאי הפעימה החשמלית ולתאם מידע זה למסירת מטען מולקולרי רלוונטי מבחינה קלינית.
