Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran&#8217;s work partially fulfills the requirements for a master&#8217;s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo&#8217;s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.

הנהלים לשימוש בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) של אוניברסיטת טולדו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים במכון הלאומי לבריאות והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. 1. הפקת מוח, הכנת חתך ורקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב C57BL זן עכבר wild-type / 6 על ידי עמוק והרדמת חסד עם CO 2 מחנק במשך 5 דקות. הבטח מוות על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את ראש העכבר עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע craniectomy באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליות על ידי משיכת הראשונה את העור, החל בחלק העליון של הראש כדי לחשוף את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, כאשר הגולגולת חשופה, להסיר את הגולגולת על ידי קילוף פיסה-ידי חלקים העצם, החל מהצד האחורי ונע לעבר הצד הקדמי. היה זהיר כדי לא להרוס את החדרים במוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לאסוף את כל המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המוח בצלחת פטרי 100 מ&quot;מ המכילה DMEM / גבוהה גלוקוז בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS) ו 1% פתרון פניצילין / סטרפטומיצין המכיל 10,000 / מיליליטר יחידות של פניצילין ו10,000 מיקרוגרם / מיליליטר של סטרפטומיצין ומחומם מראש עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את המוח על מטוס sagittal החציוני ביד עם סכין חד, ולקבל את סעיף 100-200 מ&quot;מ הראשון מכל מחצית באמצעות vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את רקמת המוח עם פתרון פוספט C מראש חימם 37 מעלות נאגרו מלוח (1X PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד למקם את סעיף המוח בDMEM / תקשורת גבוהה גלוקוז מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2. בשידור חי הדמיה תצורה והתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חלקי רקמת המוח בתרבות מנות 30 מ&quot;מ זכוכית תחתונה המכילות 1 מיליליטר של תקשורת גבוהה גלוקוז DMEM /. התאם סביבת התא הסגורה של מיקרוסקופ כדי 37 מעלות צלזיוס, 95% / 5% 2 / CO תוכן 2 O (איור 1 </strאונג&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעדשת טבילת שמן אובייקטיבית 60x, לאסוף את תאי ependymal / תמונות cilia על ידי הנחת ראשון טיפת שמן על העדשה האובייקטיבית 60x ומתמקד בתאים עם דסק&quot;ש הרגיל מועבר אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, בצע את הכיוון של תנועת בועת DMEM כמדריך למיקום של cilia ependymal ניע כמכות הריסים ליצור סוג של תנועת בועה באזור. בחר אזור המכיל תאים בריאים עם cilia ניע בחדר לרוחב של המוח באמצעות מסנן דסק&quot;ש. ברגע שcilia ependymal נמצא, להתאים את האור ולהתמקד כדי להשיג תמונת משביעת רצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים ההדמיה לחיות לפי מטרה ספציפית באמצעות תוכנת הדמיה Metamorph. בהפגנה הנוכחית, לרכוש עשרים תמונות ארבעה סיביות עם סט binning מצלמה עד 1 x 1 בשילוב עם 60x האובייקטיבי ו5-10 זמן חשיפת msec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את תמונות דסק&quot;ש על ידי פתיחת צמצם מיקרוסקופ לרמה אופטימלית על מנת לקבל Exp מינימוםזמן osure. שים לב זרם תמונות בזמן אמת למצלמה כדי לספק רכישת תמונה מהירה ומיידית ללא דיחוי. לחשב את המהירות של מכות cilia מבוסס על הדרישה של זמני חשיפה מינימאליים להשגה לעומת תמונה מספיק. </li></ol> נתונים להדמיה 3. וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר מכות ריסים על ידי ספירת מספר המכות בדקות 1. עושה זאת על ידי הפחתת המהירות של הווידאו ולספור את מספר הפעימות באמצעות דלפק תא או כלי דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את התדירות של מכות, להכפיל את זמן החשיפה שבווידאו שהוקלט במספר המסגרות או תמונות זמן לשגות רכשו כדי לקבל את מספר שניות. (לדוגמא: זמן חשיפה 5 אלפיות שניים 200 מסגרות = 1,000 אלפיות שני או 1 שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר המכות בשנייה אחת כדי לקבל את התדר שמתבטא במספר מכות לשניות אחד. עושה זאת על ידי חלוקת מספר מכות ריסים מעל השאר זמן של שנייה אחתval (לדוגמא: cilia פעימות 50 פעמים בוידאו 200 מסגרות נרשמו בזמן חשיפה של 5 אלפיות השני כלומר 5 אלפיות השני x 200 מסגרות = 1 שניות; החברה תחלק 50 פעימות בשנייה 1 = 50 הרץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את זווית מכות הריסים על ידי הערכת הדרך שננקטה על ידי cilia ependymal במהלך שתי פעימות הכח והתאוששות. בצע זאת על פי שיטה שתוארה קודם לכן, עם שינויים קלים 11. התנועה המדויקת של cilia הבודד הוא ציין במהלך מחזור הפעימה המלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגיליון אצטט הונח על הצג, למתוח קו אופקי לאורך קצה ependymal וקו אנכי דרך עמדת קו האמצע של cilia בתחילת שבץ הכח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלילה המיקום המדויק של מסגרת cilium ידי מסגרת כפי שהוא נע קדימה בשבץ הכח. באופן דומה, העלילה התנועה של cilia בשבץ ההתאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את זווית מכות הריסים מסטיית המרבית של cilium מקו האמצע בtהוא שבץ כוח, כמו גם שבץ ההתאוששות. </li></ol> 4. סידן איתותים הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חיתוך המוח, לשטוף בקצרה את פרוסת המוח עם 1x PBS או PBS של Dulbecco (pH 7.0). הכן Fluo-2 טריים, כדי למנוע מרווה הקרינה ולקבל יחס אות לרעש טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 פתרון מניות מ&quot;מ של Fluo-2 פתרון בdimethylsulfoxide (DMSO), לערבב ומערבולת הפתרון לפחות 5 דקות כדי להבטיח שFluo-2 הוא מומס homogenously בDMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את פתרון Fluo-2 מניות ב 500 מיליליטר של DMEM / גבוהה גלוקוז בתוספת 2% B27 מראש חימם עד 37 ° C לריכוז סופי של 20 מ&quot;ג / מיליליטר. הערה: B-27 היא תוספת סרום ללא מותאמת המכילה ויטמין A, קוקטייל נוגד חמצון ואינסולין המשמש לתמיכת כדאיות קצרה או לטווח ארוך של היפוקמפוס ונוירונים במערכת העצבים המרכזית אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד דגירה פרוסת המוח עם 20 מ&quot;ג / מיליליטר Fluo-2 למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בצלחת זכוכית תחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע את ריכוז הטעינה האופטימלי של סידן fluorophore Fluo-2 ולהימנע מרעילות צבע סידן תא, תאי אתגר עם ATP, ולבדוק את כדאיות תא על ידי קביעת כמובן הזמן וגודל שיא של אותות סידן בתגובה ל- ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט את הווידאו לתנודת סידן בשיעור של 5 אלפיות שניים לכידה למינימום של 1 שניות (200 מסגרות לשנייה), עם אורכי גל עירור ופליטה של 488 ננומטר ו515 ננומטר, בהתאמה (סרט 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבדיל את אות Fluo-2 סידן מחפצי autofluorescence או תנועה, להבטיח כי את העוצמות הנפלטות ב515 ננומטר היא פיקוח בנפרד. הערה: Fluo-2 הוא לא fluoremetric סידן המתאים לכמת סידן תוך תאי. עם זאת, זה צבע סידן דינמי מצוין כדי לזהות שינויים בסידן במהירות, כגון תנודות סידן. לכימות מדויק יותר סידן, פורע-2 מומלץ. עם זאת, השינויים הדינמיים של הפורע-2 מוגבלים על ידי ratiometricהטבע של הצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את נוסחות הניתנות על ידי היצרן כדי לחשב את ערכי סידן המדויקים חופשיים תאיים. דוגמא [Ca 2 +] = ד K × (R - R דקות) (מקסימום R - R) /. איפה ד K הוא קבוע דיסוציאציה של הצבע מסידן שוחרר, R הוא הקרינה שנמדדה ב 488, ודקות R ומקסימום R הם יחס הקרינה במינימום ומקסימום ריכוז יון 12. </li></ol> 5. Immunofluorescence מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן את החלקים במוח עם תמיסת מלח שנאגרו פוספט המכילה paraformaldehyde 4% (PFA) וסוכרוז 2% למשך 10 דקות. לחלופין, לתקן את כל המוח עם 4% סעיף PFA ולאחר מכן לתוך 50 חלקי מ&quot;מ באמצעות cryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 5 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פרוסת המוח עם solutiעל של 0.1% Triton-X ב1x PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 5 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פרוסת המוח עם נוגדן ראשוני עכבר, antiacetylated טובולין, המשמש בדילול של 1: 5000 ב 10% FBS ב1x PBS לשעה אחת בטמפרטורת חדר (RT) או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 5 דקות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפרוסה המוח בנוגדנים משני, אנטי עכבר IgG והעמסת בדילול של 1: 500 FBS ב 10% בפתרון PBS 1x עבור שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני התצפית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, counterstain הסעיף 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) במשך 5 דקות כדי להכתים את הגרעין (או DNA) 13. כדי למזער photobleaching, תמונת החלקים מייד עם זמן חשיפה מינימאלי אפשרי. </li></ol>

<ol>
	<li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia:+Highly+sophisticated+biological+sensors.">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Satir, P., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+structure+and+function+of+mammalian+cilia.">Overview of structure and function of mammalian cilia.</a> Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).</li><li>Delbigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ependyma+-+a+protective+barrier+between+brain+and+cerebrospinal-fluid.">The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid.</a> Glia. 14 (1), 1-13 (1995).</li><li>Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bordey+A.+Ependymal+cells+along+the+lateral+ventricle+express+functional+p2x(7)+receptors.">Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li><li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus.">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li><li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+(New+York,+N.Y.).">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li><li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function,+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus.">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li><li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation.">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476 (2012).</li><li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties.">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors.">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation.">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li><li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium.">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li><li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency.">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5 (2013).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שתואר כאן הוא פרוטוקול להכנת רקמת מוח עכבר עבור שתי חיות-הדמיה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי המספק תצפית קרובה מהירה ורגישה של cilia ependymal בתוך החדרים במוח. טכניקה זו אינה מוגבלת לחדר לרוחב בלבד; זה יכול להיות מנוצל כדי לבחון את הריסים בחדרים במוח אחרים. טכניקת הדמיה זה מספקת ?...

Cilia הם אברונים המבוסס על microtubule חושיים הנמשכים מתא השטח לסביבה תאית. בהתאם לארגון microtubule, cilia יכול להיות מסווג לשני סוגים - &quot;9 + 0&quot; או &quot;9 + 2&quot;. מבחינה תפקודית, המבוסס על התנועה שלהם, אלה יכולים להיות מסווגים כריסי ניע או אי-ניע 1. cilia העיקרי הוא מונח נפוץ לציון &quot;9 + 0&quot; cilia לא ניע. אלה שיש לי תשעה microtubules מקביל כפיל (כונה על ידי &#39;9&#39;) וזוג microtubules מרכזי נעדר בתוך הנדן המרכזי (כונה על ידי &#39;0&#39;). עם זאת, כמה ריסי &quot;9 + 0&quot;, כגון cilia קטרי, המסדירים בין צדדים, עובר הם ניעתי 2. מצד השני, cilia ניע מתאפיינים, בנוסף לתשע כפילויות microtubule המקבילות, על ידי זוג מרכזי נוסף של כפילויות microtubule וקשורות לחלבוני מנוע dynein כדי להקל על תנועתיות. בנוסף, כמה &quot;9+2 &quot;Cilia כגון cilia חוש הריח הוא לא ניע 3. תאים המצפים את Ependymal חדרים במוח והתעלה של חוט השדרה המרכזית מאופיינים בריסי ניע המניעים את הנוזל השדרתי (CSF) לאורך 4 חדרים במוח. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להקל לומדת את דינמיקת cilia ומומים מבניים ניע. בריאות המוח ופיתוח תלויה במידה רבה על זרימה יעילה של CSF בתוך החדרים במוח. לדוגמא, זרימת CSF רגילה ומאזן נוזלים דורשים מכות רגילות וcilia הפונקציונלי ependymal 5,6, אשר בתורו לשחק תפקידים קריטיים בויסות התנועה כיוונית של תאים עצביים ותאי גזע הגירת 7. ככזה, תפקוד לא תקין ependymal cilia או מבנה יכול להוביל לזרימת CSF חריגה, אשר מזוהה עם הידרוצפלוס, מצב רפואי שבו יש הצטברות חריגה של CSF בחדרי הלב של bגשם. זה עשוי כתוצאה מכך לגרום להגברת לחץ תוך גולגולתי וגדלה הדרגתית של הראש, עווית, ראיית מנהרה, ונכות נפשית 8. היתרונות של שיטה זו על פני שיטות קיימות הוא שזה אפשר בפעם הראשונה לדווח שלושה סוגי תאים שונים ependymal: I, II ו- III, המבוסס על התדר שלהם ייחודי מכות הריסים ולהכות זווית. תאי ependymal אלה מקומיים באזורים מסוימים בחדרים במוח. יתר על כן, את ההשפעות של גיל וסוכנים תרופתיים כגון אלכוהול וcilostazol על שינוי סוגי תאי ependymal או המגויר ניתן להדגים, שלא היה אפשרי לפני סיווג זה של תאי ependymal. Cilostazol הוא מעכב של phosphodiesterase-3, אנזים שחילוף חומרי cAMP לAMP וזה גם מסדיר סידן תוך תאי 9. באמצעות ניתוח הדמיה הקרינה במהירות גבוהה מאפשר הדמיה וכימות של תאית הייחודימאפייני תנודת סידן של תאי ependymal. לדוגמא, האלכוהול וcilostazol שינו באופן משמעותי את תדירות ependymal מכות הריסים כמו גם את מאפייני תנודות סידן תוך תאי, אשר בתורו, יכול להוביל לשינוי בהחלפת נפח הנוזל השדרתי ידי cilia ependymal 10. לסיכום, טכניקה זו הייתה מפתח כדי לספק את העדות הראשונה משלושה סוגים שונים של תאי ependymal עם מאפייני תנודת סידן שונים. בסעיף הבא, סקירת צעד-אחר-צעד מפורטת של ההליך מסופקת, הקדשת תשומת לב להכנה וטיפול ברקמות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH GLUCOSE</td>
			<td>Cellgro Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30088-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-2395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-2&#160;</td>
			<td>TEF Labs</td>
			<td>#0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451&#160;</td>
			<td>clone 6-11B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse antibody</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture plate</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>30-2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip (18x18)</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004.326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>Nikon TE2000</td>
			<td>60X oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 24x60mm</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI filter cube</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain

תאי ependymal Multiciliated שורת חדרי הלב במוח הבוגר. פונקציה או מבנה של cilia ependymal חריגים קשור עם גירעונות נוירולוגיות שונים. הדמיה החיה vivo לשעבר של טכניקת cilia ependymal ניע הנוכחי מאפשר למחקר מפורט של דינמיקת הריסים לאחר מספר צעדים. צעדים אלה כוללים: עכברי המתת חסד עם פחמן דו חמצני על פי פרוטוקולים של האוניברסיטה המוסדית הטיפול בבעלי חיים של טולדו וועדת שימוש (IACUC); craniectomy ואחריו הסרת מוח ונתיחת מוח sagittal עם vibratome או להב חד להשיג חלקים דקים מאוד בחדרים לרוחב המוח, שבו cilia ependymal ניתן דמיינו. דגירה של פרוסות של המוח בצלחת זכוכית תחתונה מותאמת אישית המכילה בינוני של הנשר (DMEM) / גבוהה גלוקוז השתנה Dulbecco על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 95% O / 5% 2 / CO תערובת 2 היא חיונית כדי לשמור על רקמת חיים במהלךהניסוי. וידאו של מכות cilia אז נרשם באמצעות מיקרוסקופ התערבות ההפרש לעומת זאת ברזולוציה גבוהה. הווידאו לאחר מכן נותח על ידי מסגרת מסגרת לחשב את תדירות פעימות הריסים. זה מאפשר סיווג שונה של תאי ependymal לשלוש קטגוריות או סוגים מבוססים על התדירות וזווית מכות הריסים שלהם. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת שימוש בניתוח הדמיה הקרינה במהירות גבוהה כדי לאפיין את המאפיינים הייחודיים תאיים תנודת סיד של תאי ependymal כמו גם את ההשפעה של סוכנים תרופתיים על תנודות סידן ותדירות מכות הריסים. בנוסף, טכניקה זו היא מתאימה להדמיה immunofluorescence ללימודי מבנה הריסים ולוקליזציה חלבון הריסים. הדבר חשוב במיוחד במחקרי אבחון המחלה ופנוטיפ. המגבלה העיקרית של הטכניקה מיוחסת לירידה בתנועת ריסי ניע לחיות כמו רקמת המוח מתחילה למות.

מדידת פונקצית cilia ependymal במוח עכבר החי השיטה המתוארת בפרוטוקול זה משמשת כדי לפקח פונקצית ependymal cilia ומבנה ברקמה הטרי גזור ממוח העכבר, כמו גם לפקח וללמוד תדירות מכות cilia. הצעדים אחריו כדי להשיג ניסוי שלם מתוארים בתרשים זרימה סכמטי <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain at JoVE.com

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), תצפית vivo לשעבר של המכות של cilia ependymal ניע ממוקם בתוך החדרים במוח העכבר באה לידי ביטוי בחי הדמיה. הטכניקה מאפשרת הקלטה של ​​תדר מכות הריסים הייחודי וזווית מכות וכן נכסי צעדה תנודת סידן תוך תאי שלהם.

הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

live-imaging-ependymal-cilia-lateral-ventricles-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences.  באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), תצפית vivo לשעבר של המכות של cilia ependymal ניע ממוקם בתוך החדרים במוח העכבר באה לידי ביטוי בחי הדמיה. הטכניקה מאפשרת הקלטה של ​​תדר מכות הריסים הייחודי וזווית מכות וכן נכסי צעדה ...

Video: Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Cerebrospinal fluid (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is present during early vertebrate embryonic development and persists throughout life. Adult CSF is thought to cushion the brain, remove waste, and carry secreted molecules1,2. In the adult and older embryo, the majority of CSF is made by the choroid plexus, a series of highly vascularized secretory regions located adjacent to the brain ventricles3-5. In zebrafish, the choroid plexus is fully formed at 144 hours post fertilization (hpf)6. Prior to this, in both zebrafish and other vertebrate embryos including mouse, a significant amount of embryonic CSF (eCSF) is present . These data and studies in chick suggest that the neuroepithelium is secretory early in development and may be the major source of eCSF prior to choroid plexus development7.
eCSF contains about three times more protein than adult CSF, suggesting that it may have an important role during development8,9. Studies in chick and mouse demonstrate that secreted factors in the eCSF, fluid pressure, or a combination of these, are important for neurogenesis, gene expression, cell proliferation, and cell survival in the neuroepithelium10-20. Proteomic analyses of human, rat, mouse, and chick eCSF have identified many proteins that may be necessary for CSF function. These include extracellular matrix components, apolipoproteins, osmotic pressure regulating proteins, and proteins involved in cell death and proliferation21-24. However, the complex functions of the eCSF are largely unknown.
We have developed a method for removing eCSF from zebrafish brain ventricles, thus allowing for identification of eCSF components and for analysis of the eCSF requirement during development. Although more eCSF can be collected from other vertebrate systems with larger embryos, eCSF can be collected from the earliest stages of zebrafish development, and under genetic or environmental conditions that lead to abnormal brain ventricle volume or morphology. Removal and collection of eCSF allows for mass spectrometric analysis, investigation of eCSF function, and reintroduction of select factors into the ventricles to assay their function. Thus the accessibility of the early zebrafish embryo allows for detailed analysis of eCSF function during development.

We present a method to collect cerebrospinal fluid (CSF) and to create a system which lacks CSF within the embryonic zebrafish brain ventricular system. This allows for further examination of CSF composition and its requirement during embryonic brain development.

ניקוז ידני של חדרי המוח העוברי דג הזברה

Cerebrospinal fluid  (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is  present during early vertebrate embryonic development and ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

פעילות telomerase באזורים שונים של מוח עכבר: הטלומרז לא רדיואקטיבי חזור הגברה פרוטוקול Assay (TRAP)

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

3D דוגמנות של רוחב החדרים והיסטולוגית אפיון רקמות סביב חדרי מוח בבני אדם ועכבר

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

הדמית סיבי serotonergic בחוט שדרת עכבר שימוש CLARITY / טכניקה מעוקבת

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

הקלטה הפלסטיות הסינפטית בפרוסות בהיפוקמפוס חריפה, בהשתתפות של מיחזור - בנפח מצומצם, זלוף- ומערכת ועלייתו-סוג תא

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Exploring Deep Space - Uncovering the Anatomy of Periventricular Structures to Reveal the Lateral Ventricles of the Human Brain

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this challenging. Because the ventricles are negative spaces located deep within the brain, the only way to understand their anatomy is by appreciating their boundaries formed by related structures. Looking at a 2D representation of these spaces, in any of the cardinal planes, will not enable visualisation of all of the structures that form the boundaries of the ventricles. Thus, using 2D sections alone requires students to compute their own mental image of the 3D ventricular spaces. The aim of this study was to develop a reproducible method for dissecting the human brain to create an educational resource to enhance student understanding of the intricate relationships between the ventricles and periventricular structures. To achieve this, we created a video resource that features a step-by-step guide using a fiber dissection method to reveal the lateral and third ventricles together with the closely related limbic system and basal ganglia structures. One of the advantages of this method is that it enables delineation of the white matter tracts that are difficult to distinguish using other dissection techniques. This video is accompanied by a written protocol that provides a systematic description of the process to aid in the reproduction of the brain dissection. This package offers a valuable anatomy teaching resource for educators and students alike. By following these instructions educators can create teaching resources and students can be guided to produce their own brain dissection as a hands-on practical activity. We recommend that this video guide be incorporated into neuroanatomy teaching to enhance student understanding of the morphology and clinical relevance of the ventricles.

This paper demonstrates the effective use of a fiber dissection method to reveal the superficial white matter tracts and periventricular structures of the human brain, in three-dimensional space, to aid student comprehension of ventricular morphology.

חקר החלל העמוק - לחשוף את האנטומיה של מבנים Periventricular כדי לחשוף את החדרים הצדדיים של המוח האנושי

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.