Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran&#8217;s work partially fulfills the requirements for a master&#8217;s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo&#8217;s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.

Die Verfahren für Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) der University of Toledo in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an den National Institutes of Health und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung zugelassen von Labortieren. 1. Gehirn Extraction, Schnitte und Gewebepräparation <ol><li> Opfern Wildtyp-Maus-Stamm C57BL / 6 durch tief euthanizing mit CO 2 Ersticken für 5 min. Versichern Tod durch zervikale Dislokation. </li><li> Reinigen Sie die Mauskopf mit 70% Ethanol. </li><li> Führen Kraniektomie mit sterilen Schere und Pinzette, indem zuerst die Haut abziehen, beginnend mit der Spitze des Kopfes, um den Schädel freizulegen. </li><li> Dann, wenn der Schädel freiliegt, Entfernen des Schädels durch Abziehen der Knochen Stück für Stück ausgehend von der hinteren Seite, und sich in Richtung der vorderen Seite. Seien Sie vorsichtig, nicht die Hirnkammern zu zerstören. </li><li>Sammeln Sie die ganze Gehirn. </li><li> Platzieren das Gehirn in einer 100 mm Petrischale mit DMEM / Hoch Glucose mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin-Lösung, die 10.000 Einheiten / ml Penicillin und 10.000 &amp; mgr; g / ml Streptomycin und vorgewärmtem auf 37 ° C. </li><li> Schneiden Sie das Gehirn auf der medianen Sagittalebene von Hand mit einer scharfen Klinge, und erhalten die ersten 100 bis 200 mm Abschnitt von jeder Hälfte mit einem Vibratom. </li><li> Spülen Sie das Hirngewebe mit vorgewärmter 37ºC phosphatgepufferter Salzlösung (1 × PBS) -Lösung. </li><li> Ab sofort stellen das Gehirn Abschnitt in DMEM / Hoch Glucose Medien auf 37 ° C vorgewärmt. </li></ol> 2. Live-Imaging Konfiguration und Setup <ol><li> Zeigen die Gehirngewebeschnitte in 30 mm Glasbodenkulturschalen, die 1 ml DMEM / Hochglucosemedien. Passen des Mikroskops geschlossene Kammer Umgebung bis 37 ° C, 95% / 5% O 2 / CO 2 -Gehalt (Abbildung 1 </strong&gt;). </li><li> Unter Verwendung eines 60X Ziel Ölimmersion, sammeln die Ependymzellen / Cilien Bilder, indem zunächst ein Öltropfen auf dem 60X Objektiv und Fokussierung auf die Zellen, die mit regelmäßigen Durchlicht DIC. </li><li> Dann folgen Sie die Richtung des DMEM Blasenbewegung als Leitfaden für die Position des beweglichen ependymaler Zilien als ciliary Schläge schaffen eine Art von Blasenbewegung in der Gegend. Wählen Sie einen Bereich enthält, gesunde Zellen mit beweglichen Zilien in lateralen Ventrikel des Gehirns mit Hilfe der DIC-Filter. Sobald die ependymaler Zilien gefunden werden, stellen Sie die Licht und konzentrieren, um ein zufriedenstellendes Bild zu erhalten. </li><li> Stellen Sie die Live-Bildaufnahmeparameter nach einem bestimmten Zweck mit Metamorph-Imaging-Software. In der vorliegenden Demonstration, zu erwerben vierundzwanzig-Bit-Bilder mit der Kamera Binning auf 1 x 1 in Verbindung mit 60X Ziel und 5-10 ms Belichtungszeit. </li><li> Sammeln Sie die DIC Bilder durch Öffnen des Mikroskopöffnung auf ein optimales Niveau, um eine Mindest exp habenosure Zeit. Beachten Sie Live-Bilder-Stream der Kamera, um schnelle und sofortige Bildaufnahme unverzüglich bereitzustellen. Berechnen der Geschwindigkeit der Zilien Schlagen basierend auf der Anforderung der minimalen Belichtungszeiten zur ausreichenden Bildkontrast zu erhalten. </li></ol> 3. Datenvisualisierung und -analyse <ol><li> Berechnung der Anzahl der Zilien Schläge durch Zählen der Anzahl von Schlägen in 1 min. Dies geschieht durch Verringerung der Geschwindigkeit der Video- und Zählen der Anzahl von Schlägen mit einem Zellzähler oder ein ähnliches Werkzeug. </li><li> Um die Frequenz der Schläge zu berechnen, multiplizieren Sie die Belichtungszeit, bei der das Video wird durch die Anzahl der Frames oder Zeitraffer-Bilder erworben, um die Anzahl der Sekunden bekommen aufgezeichnet. (Beispiel: Belichtungszeit 5 ms 200 Frames = 1.000 ms oder 1 s). </li><li> Berechnung der Anzahl der Schläge in einer Sekunde, um die Frequenz, die als Anzahl der schlag pro sec ausgedrückt wird erhalten. Tun Sie dies, indem die Anzahl der Zilien Schläge über einen Ein-Sekunden-Zeit interval (Beispiel: Zilien schlägt 50 Mal in einem 200 Bilder Video bei Belichtungszeit von 5 ms, dh 5 ms x 200 Frames = 1 Sekunde aufgenommen, jetzt teilen 50 Schläge um 1 Sek = 50 Hz). </li><li> Die Zilienschlag Winkel zu berechnen durch die Auswertung der Weg durch die ependymaler Zilien genommen während sowohl die Leistung und Erholung Schlaganfälle. Ausführen dieser nach einem vorher beschriebenen Verfahren mit geringen Modifikationen 11. Die genaue Bewegung einzelner Zilien wird während der gesamten Schlagzyklus beobachtet. </li><li> Auf ein Acetat Blatt über dem Monitor platziert, ziehen Sie eine horizontale Linie entlang der ependymaler Kante und einer vertikalen Linie durch die Mittellinie Position der Zilien zu Beginn des Arbeitstaktes. </li><li> Zeichnen Sie die genaue Position des cilium Rahmen für Rahmen, wie sie während des Arbeitshubs nach vorne bewegt. In ähnlicher Weise zeichnen die Bewegung der Flimmerhärchen in der Erholungs Schlaganfall. </li><li> Berechnen Sie die Zilienschlag Winkel von der maximalen Abweichung der cilium von der Mittellinie in ter Arbeitstakt als auch die Erholung Schlaganfall. </li></ol> 4. Calcium Signalaufzeichnung <ol><li> Nach dem Schneiden des Gehirns, kurz abspülen Hirnschnitt mit 1x PBS oder Dulbeccos PBS (pH 7,0). Frisch Fluo-2 Bereiten Sie Fluoreszenzlöschung zu vermeiden und gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten. </li><li> Vorbereitung 1 mM Stammlösung von Fluo-2-Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO), zu vermischen und verwirbeln die Lösung für mindestens 5 min, damit Fluo-2 homogen in DMSO gelöst. </li><li> Verdünne das Fluo-2-Stammlösung in 500 ml DMEM / Hoch Glucose mit 2% B27 ergänzt auf 37 ° C vorgewärmt, um eine Endkonzentration von 20 mg / ml. HINWEIS: B-27 ist ein optimierter Serum-freien Ergänzungsmittel mit Vitamin A, Antioxidantien Cocktail und Insulin verwendet werden, um kurz- oder langfristige Lebensfähigkeit des Hippocampus und anderen ZNS-Neuronen zu unterstützen. </li><li> Unmittelbar inkubieren Sie die Hirnschnitt mit 20 mg / ml Fluo-2 für 30 min bei 37 ° C in einem Glasbodenplatte. </li><li> Zur Bestimmung der optimalen Beladungskonzentration von Calcium Fluorophor Fluo-2 und Calcium Farbstoff Zelltoxizität, challenge Zellen mit ATP zu vermeiden, und überprüfen die Lebensfähigkeit der Zellen durch Bestimmung der Zeitverlauf und die Spitzengröße des Calciumsignale in Antwort auf ATP. </li><li> Aufzeichnung der Video für Calcium Oszillation bei einer Erfassungsrate von 5 ms für ein Minimum von 1 sec (200 Einzelbilder pro Sekunde) mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von 488 nm und 515 nm (Film 2). </li><li> Um die Fluo-2 Calcium-Signal von Autofluoreszenz oder Bewegungsartefakten zu unterscheiden, sicherzustellen, dass die bei 515 nm emittiert Intensitäten wird separat überwacht. HINWEIS: Fluo-2 nicht die Calcium fluoremetric geeignet intrazellulärem Calcium zu quantifizieren. Jedoch ist es eine ausgezeichnete dynamische Calcium-Farbstoff zum schnellen Calcium-Veränderungen, wie Calcium Schwingungen erfassen. Für eine genauere Quantifizierung Calcium, Fura-2 ist zu empfehlen. Jedoch sind die dynamischen Änderungen der Fura-2 durch seine ratiometrisch begrenztBeschaffenheit des Farbstoffs. </li><li> Folgen Sie den Formeln des Herstellers um die genauen freien intrazellulären Calcium-Werte zu berechnen. Beispiel [Ca 2+] i = Kd x (R - R min) / (R max - R). Wobei K d die Dissoziationskonstante des Farbstoffs aus dem freigesetzten Calciums, R ist die gemessene Fluoreszenz bei 488 und R min und R max sind die Fluoreszenzverhältnisse bei minimaler und maximaler Ionenkonzentration 12. </li></ol> 5. Immunfluoreszenzmikroskopie <ol><li> Fixieren die Gehirnschnitte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und 2% Saccharose für 10 min. Alternativ zu beheben das gesamte Gehirn mit 4% PFA und dann in Abschnitt 50 mm Abschnitte mit einem Kryostaten. </li><li> Dreimal Waschen des Gewebes mit 1x PBS für jeweils 5 min. </li><li> Inkubieren Sie die Hirnschnitt mit einem solutiauf 0,1% Triton-X in 1 × PBS für 5 min, dann dreimal mit 1x PBS spülen für jeweils 5 min. </li><li> Inkubieren Hirnschnitt mit primären Maus-Antikörper, antiacetylated a-Tubulin bei einer Verdünnung von 1: 5000 in 10% FBS in 1 × PBS für eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Dreimal Waschen des Gewebes mit 1x PBS für jeweils 5 min. </li><li> Inkubieren Hirnschnitt in sekundären Antikörper, Fluorescein-Antimaus-IgG in einer Verdünnung von 1: 500 in 10% FBS in 1x PBS-Lösung für 1 h bei RT. </li><li> Vor Betrachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop, Gegenfärbung mit dem Abschnitt 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 5 min, um den Kern (oder DNA) 13 zu färben. Um Photobleaching, Bild die Abschnitte unmittelbar mit minimale Belichtungszeit möglich zu minimieren. </li></ol>

<ol>
	<li>AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia:+Highly+sophisticated+biological+sensors.">Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors.</a> Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).</li><li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+kif3b+motor+protein.">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li><li>Satir, P., Christensen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+structure+and+function+of+mammalian+cilia.">Overview of structure and function of mammalian cilia.</a> Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).</li><li>Delbigio, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ependyma+-+a+protective+barrier+between+brain+and+cerebrospinal-fluid.">The ependyma - a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid.</a> Glia. 14 (1), 1-13 (1995).</li><li>Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bordey+A.+Ependymal+cells+along+the+lateral+ventricle+express+functional+p2x(7)+receptors.">Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors.</a> Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).</li><li>Appelbe, O. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+mouse+jhy+gene+causes+abnormal+ciliary+microtubule+patterning+and+juvenile+hydrocephalus.">Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus.</a> Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).</li><li>Sawamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+follow+the+flow+of+cerebrospinal+fluid+in+the+adult+brain+(New+York,+N.Y.).">New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.).</a> Science. 311 (5761), 629-632 (2006).</li><li>Banizs, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+cilia+lead+to+altered+ependyma+and+choroid+plexus+function,+and+result+in+the+formation+of+hydrocephalus.">Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus.</a> Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).</li><li>Kawanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilostazol+prevents+endothelin-induced+smooth+muscle+constriction+and+proliferation.">Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation.</a> PloS one. 7 (9), e44476 (2012).</li><li>Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+types+of+ependymal+cells+with+intracellular+calcium+oscillation+are+characterized+by+distinct+cilia+beating+properties.">Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties.</a> J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).</li><li>Chilvers, M. A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+ciliary+beat+pattern+and+beat+frequency+using+digital+high+speed+imaging:+Comparison+with+the+photomultiplier+and+photodiode+methods.">Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods.</a> Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).</li><li>Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motile+primary+cilia+as+fluid+shear+stress+mechanosensors.">Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors.</a> Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivin-induced+abnormal+ploidy+contributes+to+cystic+kidney+and+aneurysm+formation.">Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation.</a> Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).</li><li>AbouAlaiwi, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades.">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).</li><li>Praetorius, H. A., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bending+the+mdck+cell+primary+cilium+increases+intracellular+calcium.">Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium.</a> The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).</li><li>Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+ethanol+and+acetaldehyde+on+brain+ependymal+and+respiratory+ciliary+beat+frequency.">The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency.</a> Cilia. 2 (1), 5 (2013).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Beschrieben wird ein Protokoll für die Herstellung von Maus-Gehirngewebe sowohl Live-Bildgebung und die Fluoreszenzmikroskopie, die eine schnelle und empfindliche genauer Betrachtung der ependymalen Zilien in den Hirnkammern liefert. Diese Technik ist nicht nur auf den lateralen Ventrikel beschränkt; es könnte verwendet, um die Zilien in anderen Hirnkammern beobachten. Diese Bildgebungstechnik bietet einen Live-Stream, die die Bewegung des CSF von Zilienschlag in einem ex vivo-Einstellung ähnelt. Darüber h...

Cilien sensorischen Mikrotubulus-basierten Organellen, die von der Zelloberfläche an die extrazelluläre Umgebung zu verlängern. &quot;9 + 0&quot; oder &quot;9 + 2&quot; - je nach ihrer Mikrotubuliorganisationszentrum kann Zilien in zwei Typen eingeteilt werden. Funktionell bezogen auf ihre Beweglichkeit, so können diese als bewegliche oder unbewegliche Zilien 1 eingestuft werden. Primäre Zilien ist ein Begriff allgemein verwendet, bezeichnen &quot;9 + 0&quot; unbewegliche Zilien. Diese haben neun parallelen Dublett Mikrotubuli (hergestellt von &quot;9&quot; bezeichnet) und einer zentralen Paar von Mikrotubuli abwesend innerhalb der zentralen Hülse (durch &quot;0&quot; bezeichnet). , Einige &quot;9 + 0&quot; Zilien, wie Knoten Zilien, die Lateralität Embryo regulieren sind jedoch beweglich 2. Auf der anderen Seite, motile Cilien gekennzeichnet, daß zusätzlich zu den neun parallelen Mikrotubuli Dubletts, durch einen zusätzlichen zentralen Paar Mikrotubuli Dubletts und Dynein Motorproteinen assoziiert Motilität erleichtern. Darüber hinaus sind einige &quot;9+2 &quot;Cilien wie olfaktorische Zilien sind unbewegliche 3. Ependymzellen entlang der Hirnkammern und den Zentralkanal des Rückenmarks durch bewegliche Zilien, die den Liquor (CSF) entlang der Hirnkammern 4 zu treiben ist. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Erleichterung der Untersuchung der bewegliche Zilien Dynamik und strukturelle Anomalien. Gesundheit und Entwicklung des Gehirns stark von effizienten Verkehr von CSF in die Hirnkammern. Zum Beispiel normaler CSF Strömung und Flüssigkeitshaushalt erfordern normale Schläge und funktionellen ependymal Zilien 5,6, was wiederum eine entscheidende Rolle spielen bei der Regulierung der Bewegungsrichtung des neuronalen Zellen und Stammzellmigration 7. Als solche abnormale ependymal Zilien Funktion oder Struktur können zu abnorm CSF Strömung, die mit Hydrocephalus ist Blei, ein medizinischer Zustand, in dem es eine abnormale Ansammlung von CSF in den Ventrikeln des bregen. Dies kann folglich erhöhtem Hirndruck und progressive Erweiterung der Kopf, Krämpfe, Tunnelblick und geistige Behinderung 8 verursachen. Die Vorteile dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Verfahren ist, dass es zum ersten Mal, um drei verschiedene ependymalen Zelltypen zu melden gestattet: I, II und III, auf der Grundlage ihrer einzigartigen Zilienschlag Frequenz und Schlagwinkel. Diese Ependymzellen innerhalb bestimmter Regionen in die Hirnkammern lokalisiert. Weiterhin können die Wirkungen des Alters und pharmakologischen Mitteln wie Alkohol und Cilostazol auf die Änderung der ependymalen Zelltypen oder ihrer Lokalisierungen nachgewiesen werden, was nicht vor dieser Klassifizierung von Ependymalzellen war möglich. Cilostazol ist ein Inhibitor der Phosphodiesterase-3, ein Enzym, das cAMP zu AMP metabolisiert wird, und regelt intrazellulärem Calcium 9. Mit High-Speed-Fluoreszenz-Imaging-Analyse ermöglicht die Abbildung und Quantifizierung der einzigartigen intrazellulärenCalcium Schwingungseigenschaften der Ependymzellen. Zum Beispiel werden sowohl Alkohol und Cilostazol deutlich die ependymaler Zilienschlag Frequenz sowie die intrazellulären Calcium-Oszillationen Eigenschaften, die wiederum könnte zu einer Veränderung in der Zerebrospinalflüssigkeit Volumenersatz von ependymaler Zilien 10 führen verändert. Zusammengefasst war diese Technik Schlüssel, um den ersten Beweis von drei verschiedenen Arten von ependymalen Zellen mit unterschiedlichen Calciumschwingungseigenschaften bereitzustellen. Im folgenden Abschnitt wird eine ausführliche Schritt-für-Schritt-Überblick über das Verfahren zur Verfügung gestellt, aufmerksam auf Gewebe Herstellung und Handhabung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/HIGH GLUCOSE</td>
			<td>Cellgro Mediatech Inc.</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30088-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30256-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-SP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S-2395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-2&#160;</td>
			<td>TEF Labs</td>
			<td>#0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-acetylated a-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7451&#160;</td>
			<td>clone 6-11B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse antibody</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>FI-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture plate</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>30-2041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip (18x18)</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004.326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica CM1860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>Nikon TE2000</td>
			<td>60X oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass 24x60mm</td>
			<td>VWR Vista Vision</td>
			<td>16004-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI filter cube</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of the ependymal cilia in the lateral ventricles of the mouse brain

Multiciliated Ependymzellen säumen die Ventrikel im erwachsenen Gehirn. Abnormale Funktion oder Struktur ependymaler Zilien ist mit verschiedenen neurologischen Defiziten assoziiert. Die aktuelle ex vivo Echtzeit-Bildgebung von beweglichen ependymaler Zilien Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der Dynamik ciliary folgenden mehreren Schritten. Diese Schritte umfassen: Mäuse Euthanasie mit Kohlendioxid nach Protokollen der University of Toledo Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC); Kraniektomie gefolgt von Gehirnentfernung und sagittal Gehirn Dissektion mit einem Vibratom oder scharfe Klinge sehr dünne Schnitte durch die Hirn Seitenventrikel, wo die ependymaler Zilien visualisiert werden können erhalten. Inkubation der Scheiben des Gehirns in einem angepassten Glasbodenplatte, die Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) / Hoch Glucose bei 37 ° C in Gegenwart von 95% / 5% O 2 / CO 2 -Gemisch ist wichtig, um das Gewebe am Leben zu halten währenddas Experiment. Ein Video der Zilien schlagen wird dann mit Hilfe eines hochauflösenden Differentialinterferenzkontrastmikroskop erfasst. Das Video wird dann Bild für Bild analysiert, um die Zilienschlag Frequenz zu berechnen. Auf diese Weise können unterschiedliche Einstufung der Ependymzellen in drei Kategorien oder Arten auf der Grundlage ihrer Zilienschlag Frequenz und Winkel. Weiterhin ermöglicht diese Technik die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzbildanalyse, um die einzigartigen intrazellulären Calciumschwingungseigenschaften Ependymalzellen sowie die Wirkung von pharmakologischen Mitteln auf den Calcium Schwingungen und Zilienschlag Frequenz charakterisieren. Außerdem eignet sich dieses Verfahren für Immunfluoreszenz-Bildgebung zum ziliaren Struktur und ciliary Proteinlokalisationsstudien. Dies ist besonders wichtig bei der Krankheitsdiagnose und Phänotyp Studien. Die Hauptbeschränkung der Technik wird auf die Abnahme in lebenden motile Zilien Bewegung zurückzuführen, wie das Hirngewebe und sterben ab.

Mess ependymaler Zilien Funktion in Live-Maushirn Die in diesem Protokoll beschriebene Verfahren wird verwendet, um ependymal Zilien Funktion und Struktur in der frischen Gewebe aus dem Gehirn der Maus als auch für die Überwachung und studieren Zilien Schlagfrequenz seziert überwachen. Die Schritte befolgt, um eine vollständige Experiment erreichen werden in einer schematischen Ablaufplan (Figur 1) dargestellt. Es wird dringend empfohlen, dass das Experiment innerhalb ei...

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Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Mit hochauflösenden Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie wird eine ex vivo Beobachtung des schlagenden motiler ependymaler Zilien innerhalb der Maus Hirnkammern entfernt von Live-Bildgebung nachgewiesen. Die Technik ermöglicht eine Aufnahme von der einzigartigen Zilienschlag Frequenz und Schlagwinkel sowie deren intrazellulären Calcium-Oszillation Stimulationseigenschaften.

Live-Imaging des Ependymale Cilia in der Seitenventrikel des Maus-Gehirn-

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

live-imaging-ependymal-cilia-lateral-ventricles-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Aufrufe.  University of Toledo, College of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences.  Mit hochauflösenden Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie wird eine ex vivo Beobachtung des schlagenden motiler ependymaler Zilien innerhalb der Maus Hirnkammern entfernt von Live-Bildgebung nachgewiesen. Die Technik ermöglicht eine Aufnahme von der einzigartigen Zilienschlag Frequenz und Schlagwinkel sowie deren intrazellulären Calcium-Oszillation Stimulationseigenschaften. 

Serie: Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation und Mitochondriale Transport: Live Imaging in Hippocampus-Neuronen über lange Zeiträume

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Forschung

Neurowissenschaften

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

Cerebrospinal fluid (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is present during early vertebrate embryonic development and persists throughout life. Adult CSF is thought to cushion the brain, remove waste, and carry secreted molecules1,2. In the adult and older embryo, the majority of CSF is made by the choroid plexus, a series of highly vascularized secretory regions located adjacent to the brain ventricles3-5. In zebrafish, the choroid plexus is fully formed at 144 hours post fertilization (hpf)6. Prior to this, in both zebrafish and other vertebrate embryos including mouse, a significant amount of embryonic CSF (eCSF) is present . These data and studies in chick suggest that the neuroepithelium is secretory early in development and may be the major source of eCSF prior to choroid plexus development7.
eCSF contains about three times more protein than adult CSF, suggesting that it may have an important role during development8,9. Studies in chick and mouse demonstrate that secreted factors in the eCSF, fluid pressure, or a combination of these, are important for neurogenesis, gene expression, cell proliferation, and cell survival in the neuroepithelium10-20. Proteomic analyses of human, rat, mouse, and chick eCSF have identified many proteins that may be necessary for CSF function. These include extracellular matrix components, apolipoproteins, osmotic pressure regulating proteins, and proteins involved in cell death and proliferation21-24. However, the complex functions of the eCSF are largely unknown.
We have developed a method for removing eCSF from zebrafish brain ventricles, thus allowing for identification of eCSF components and for analysis of the eCSF requirement during development. Although more eCSF can be collected from other vertebrate systems with larger embryos, eCSF can be collected from the earliest stages of zebrafish development, and under genetic or environmental conditions that lead to abnormal brain ventricle volume or morphology. Removal and collection of eCSF allows for mass spectrometric analysis, investigation of eCSF function, and reintroduction of select factors into the ventricles to assay their function. Thus the accessibility of the early zebrafish embryo allows for detailed analysis of eCSF function during development.

We present a method to collect cerebrospinal fluid (CSF) and to create a system which lacks CSF within the embryonic zebrafish brain ventricular system. This allows for further examination of CSF composition and its requirement during embryonic brain development.

Manuelle Drainage der Zebrafisch Embryonale Hirnkammern

Cerebrospinal fluid  (CSF) is a protein rich fluid contained within the brain ventricles. It is  present during early vertebrate embryonic development and ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

3D-Modellierung der Seitenventrikel und histologische Charakterisierung Periventrikuläre Tissue in Mensch und Maus

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Bildgebung des primären Hirnrinde Zellen unter Verwendung einer 2D Kultursystem zu leben

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Exploring Deep Space - Uncovering the Anatomy of Periventricular Structures to Reveal the Lateral Ventricles of the Human Brain

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this challenging. Because the ventricles are negative spaces located deep within the brain, the only way to understand their anatomy is by appreciating their boundaries formed by related structures. Looking at a 2D representation of these spaces, in any of the cardinal planes, will not enable visualisation of all of the structures that form the boundaries of the ventricles. Thus, using 2D sections alone requires students to compute their own mental image of the 3D ventricular spaces. The aim of this study was to develop a reproducible method for dissecting the human brain to create an educational resource to enhance student understanding of the intricate relationships between the ventricles and periventricular structures. To achieve this, we created a video resource that features a step-by-step guide using a fiber dissection method to reveal the lateral and third ventricles together with the closely related limbic system and basal ganglia structures. One of the advantages of this method is that it enables delineation of the white matter tracts that are difficult to distinguish using other dissection techniques. This video is accompanied by a written protocol that provides a systematic description of the process to aid in the reproduction of the brain dissection. This package offers a valuable anatomy teaching resource for educators and students alike. By following these instructions educators can create teaching resources and students can be guided to produce their own brain dissection as a hands-on practical activity. We recommend that this video guide be incorporated into neuroanatomy teaching to enhance student understanding of the morphology and clinical relevance of the ventricles.

This paper demonstrates the effective use of a fiber dissection method to reveal the superficial white matter tracts and periventricular structures of the human brain, in three-dimensional space, to aid student comprehension of ventricular morphology.

Erkunden Deep Space - Aufdeckung der Anatomie der periventrikulären Strukturen, die seitlichen Ventrikel des menschlichen Gehirns zu offenbaren

Anatomy students are typically provided with two-dimensional (2D) sections and images when studying cerebral ventricular anatomy and students find this ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional abnormalities of LC impact several brain regions including cortex, hippocampus, and cerebellum and may contribute to depression, bipolar disorder, anxiety, as well as Parkinson disease and Alzheimer disease. These disorders are often associated with metal misbalance, but the role of metals in LC is only partially understood. Morphologic and functional studies of LC are needed to better understand the human pathologies and contribution of metals. Mice are a widely used experimental model, but the mouse LC is small (~0.3 mm diameter) and hard to identify for a non-expert. Here, we describe a step-by-step immunohistochemistry-based protocol to localize the LC in the mouse brain. Dopamine-&#946;-hydroxylase (DBH), and alternatively, tyrosine hydroxylase (TH), both enzymes highly expressed in the LC, are used as immunohistochemical markers in brain slices. Sections adjacent to LC-containing sections can be used for further analysis, including histology for morphological studies, metabolic testing, as well as metal imaging by X-ray fluorescence microscopy (XFM).

The locus coeruleus is a small cluster of neurons involved in a variety of physiological processes. Here, we describe a protocol to prepare mouse brain sections for studies of proteins and metals in this nucleus.

Lokalisierung von Locus Coeruleus im Gehirn Maus

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...