The authors would like to acknowledge the technical assistance of Alfred Gunasekaran in electron microscopy studies at the Institute of Micromanufacturing at Louisiana Tech University, and Dr. Jim McNamara for assistance with additional microscopy studies. The work described was supported in part by Louisiana board of Regents PKSFI Contract No. LEQSF (2007-12)-ENH-PKSFI-PRS-04 and the James E. Wyche III Endowed Professorship from Louisiana Tech University (to M.D.).

1. תכנון של ניסויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את עוצמת הקול של nanocomposites הנחושת נחוץ לסינתזה. על בסיס זה, לבחור מספר צלוחיות הקטנות נפח (25 סנטימטר 2), או צלוחיות גדולות יותר כמפורט להלן בהכנת חומרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסינתזה זו, השתמש 37 ° C חממה עם 5% CO 2 ולפחות 40% לחות. ודא שחממה כזה יהיה זמינה ושזה לא יפריע שוב ושוב על פני תקופה של סינתזה (כ 24 שעות). זהירות: פתיחה חוזרת וסגירה של החממה תהיה בהחלט לגרום לתנודות טמפרטורה שעלולה לגרום לסינתזת שינה של מבני nanocomposite. </li></ol> 2. הכנת חומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל החומרים טריים לפני תחילת ניסוי, על ידי הוספת חומרים מוצקים לממסים ממש לפני הסינתזה היא להתחיל. שמירה על פתרונות מניות של חומרי ציסטין והתחלת נחושת בנוזל לפעמים ב ארוכהefore הניסוי אינו מומלץ ועלולים להוביל לתוצאות משתנים. פתח פעם אחת מהספק, ממשיך מתחיל חומרים יבשים על ידי עטיפה העליונה של המכל עם Parafilm. הערה: הפרוטוקול הבא משמש כדוגמא לתגובה בבקבוק תרבות 2 תא 25 סנטימטר באמצעות 7 μl של ציסטין, 6,643 μl של מים סטריליים, ו -350 μl של CNPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 2 מ&quot;ג / מיליליטר של חלקיקי נחושת על ידי שקילה החוצה לפחות 2 מ&quot;ג של CNPs. ללבוש כפפות חד פעמיות בשלב זה כדי למנוע מגע אפשרי של CNPs עם עור. מניחים את חלקיקים בבקבוקון זכוכית ריק מיליליטר 16 סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבקבוקון המכיל CNPs, להוסיף מים ללא יונים סטרילי בנפח המתאים לעשות 2 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון ומערבולת הפתרון במשך 20 שניות כדי לספק פיזור של חלקיקים לפני תחילת סינתזה (נפח כולל לפחות 1 מיליליטר מומלץ). אין למלא יותר ממחצית דרך הבקבוקון עם מים כמו זה לעכב ערבוב על ידי vortexing. Wil CNPsl להתיישב במהירות לתחתית של הבקבוקון ויופיע בצבע כהה (אפור לשחור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate פתרון CNP במשך 17 דקות ב RT לספק פיזור מקסימאלי של CNPs לפני תחילת הסינתזה. מעת לעת לבדוק כדי לוודא שCNPs ערבוב בשל sonication. לאחר sonication מוצלח, CNPs להישאר תלוי בפתרון לפחות 30 דק &#39;והפתרון יהיה כהה בצבע. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את מסה מספקת של ציסטין לעשות פתרון / מיליליטר 72.9 מ&quot;ג לסינתזה. מאז ציסטין הוא לא ישירות מסיס במים, הנח את ציסטין שקל בכלי במשקל אנטי-סטטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לציסטין כלי במשקל המכיל, להוסיף נפח מספיק של סטרילי, 1 M NaOH, כך שציסטין מתמוסס לחלוטין. לדוגמא, לפזר 7.29 מ&quot;ג של ציסטין לחלוטין בשל 1 M NaOH 100 μl, כדי להפוך את פתרון 72.9 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על תנאים סטריליים, לבצע צעד זה במנדף תרבות זרימת רקמות סטריליים. זהירות: NaOHבריכוז 1 M הוא קאוסטית, כך ללבוש כפפות חד פעמיות בשלב זה כדי למנוע מגע של NaOH המרוכז עם עור </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבודה בברדס רקמת סטרילית תרבות, להוסיף 7 μl של ציסטין עם 6,643 μl של מים סטריליים לבקבוק סטרילי הסינתזה הראשונה, ולתת דגירה במשך 30 דקות בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם כובע הבקבוק פרק (רופף) כדי לספק יעיל ערבוב. Resuspend 2 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון CNP ידי vortexing למשך 30 שניות, מאז CNPs יהיה התיישב אחרי צעד sonication. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פתרון CNP מספיק כדי בקבוק הסינתזה (באמצעות טכניקה סטרילית) כדי לשמור על יחסי הרכיב הבאים: לשלב ציסטין 1 חלקים, 50 חלקים CNPs, וחלקי 949 מים סטריליים בבקבוק תרבות 2 תא 25 סנטימטר להתחיל הסינתזה. לדוגמא, עבור 7 מיליליטר סינתזת נפח, לשלב 7 μl של פתרון מניות ציסטין, 350 μl של CNPs, ו6,643 μl של מים סטריליים. החלף את הכובע על הבקבוק ולהדק כך שזה securדואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שילוב כל הרכיבים לסינתזה, לערבב בעדינות בבקבוק על ידי מתערבל 4-5 פעמים. הנח בקבוק בחממת CO 2 ולפרוק את הבקבוק על ידי שחרור הכובע כדי שיהיה חילוף גזים ובמתוך הבקבוק במהלך סינתזה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר סינתזה לרוץ בחממה במשך כ 24 שעות. במהלך סינתזה, ניתן לראות, עם מיקרוסקופ ועל ידי עין, היווצרות של חומרים מרוכבים ליניארי מאוד. הערה: תהליך ההיווצרות של המבנים עלול לקרות פתאום במובן זה שהם מבנים בתחילה קשה לזהות, אז ההופעה ממשיכה במהירות להגדלת צפיפות. היווצרות לכן עשויה להתרחש לפני 24 שעות. התהליך יכול גם להיות שנצפה על ידי העין פעם המבנים הפכו גדולים יותר והעלייה בצפיפות שלהם. בעוד דור של המבנים ניתן לראות לאורך זמן מתחת למיקרוסקופ ולפי העין בנקודות זמן מאוחר יותר, ברציפות להפריע תנאי הסינתזה וטמפרטורה תוביל לענייםתוצאות סינתזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים סינתזה של biocomposites ידי חוזקה מכסת בקבוק הסינתזה ואחסון הכלי במקרר (4 מעלות צלזיוס). המבנים, שנוצרו פעם אחת, יישארו יציבים בצורה זו לשנה לפחות. תווית הבקבוק עם תנאי סינתזה, כוללים רכיבים מנוצלים, תאריך של הסינתזה, וזמן דגירה של הסינתזה לפני הסיום. </li></ol> 3. סינתזה באמצעות נחושת גופרתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סינתזת הרכבה עצמית על ידי החלפת CNPs עם מלח נחושת גופרתי. באמצעות טכניקה סטרילית, לפזר לפחות 2 מ&quot;ג של נחושת גופרתית בנפח מספק של מים ללא יונים סטרילי כדי להפוך את פתרון 2 מ&quot;ג / מיליליטר. גבישי נחושת גופרתי בקלות ללכת לפתרון בריכוז זה, אבל מערבולת הבקבוקון במידת צורך, ולבדוק על ידי העין על מנת להבטיח את כל הגבישים מתמוססים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההכנה של הנחושת גופרתית, לבצע סינתזה כפי שתואר לעיל, אך החלפת CNPs עם הנחושת גופרתית. הערה: nanocomposites התאסף עצמי באמצעות נחושת גופרתית כחומר מוצא נמצאו להיות הרבה יותר עקבי בצורה סופית מאשר למבנים מסונתזים מCNPs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים את הסינתזה של biocomposites נחושת גופרתי כלרוכבי CNP (שלב 2.6) ולאחסן אותם לטווח ארוך על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. אפיון וטיפול בbiocomposites פוסט-סינתזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין biocomposites נגזר מCNPs ומנחושת גופרתית על ידי מיקרוסקופ אור הלבנה 9 ועל ידי מיקרוסקופי אלקטרונים 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיון ובדיקה של biocomposites פוסט-סינתזה ידי מיקרוסקופ אור הלבנה, להשתמש מיקרוסקופ הפוכה כחומרים מרוכבים יישבו למשטח התחתון של הבקבוק תוך כמה של הנחת הבקבוק שטוח דקות, ולאחר מכן ניתן הביא אל מוקד. השתמש בהגדרת השדה בהירה במיקרוסקופ כדי למקסם את הניגוד בין biocomposites והמדיום הנוזלי. חומרים מרוכבים הנגזרים מCNPs ושוטרלסולפט שניהם מופיעים ברורים לאטום בצבע, אבל אגרגטים CNP unreacted יופיעו כהים מאוד בצבע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצלמה דיגיטלית המחוברת למיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות של חומרים מרוכבים. מגוון של אורכים למבנים הבודדים יקויימו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיון ובדיקה של biocomposites הודעה סינתזה ולאחר האחסון ב 4 ° C, לאפשר צלוחיות להגיע לRT לפחות 15 דק &#39;כצלוחיות יהוו עיבוי תחילה על ההסרה ממקרר, שלטשטש יעיל תוך התמקדות בעת ביצוע הדמיה מיקרוסקופית. לאחר מאפשר איזון לRT, לנגב את המשטחים העליונים ותחתונים של הבקבוק עם מגבת נייר נקייה על מנת למקסם את איכות הדמיה מיקרוסקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עובדים עם או הדמיה מרוכבים שאוחסנו לטווח ארוך, מערבולת הבקבוק למשך 30 שניות כדי לנתק גושים של חומרים מרוכבים היוצרים בזמן במקרר. לאחר vortexing, לבדוק את המבנים עם מיקרופון הפוךroscope כדי להבטיח שאגרגטים שניתקו, וחזור vortexing צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ אור הלבנה הפוכה כדי להעריך את היעילות של הסינתזה לניסוי נתון באמצעות CNPs. לדוגמא, לתעד את הנוכחות או עדר של CNPs unreacted בצלוחיות סינתזה המשמשות לbiocomposites נגזר CNP מצלוחיות עם פרמטרים שונים כגון זמן של סינתזה. הערה: פרט CNPs הם קטנים מדי כדי לצפות במיקרוסקופ אור, אבל CNP unreacted צובר יופיע כעגולה צורה וחפצים כהים, בניגוד לCNP-מרוכבים מסונתזים בהצלחה שיש יחס גבוה היבט, טופס ליניארי, ו יהיה מגוון של אורכים שונים. להתחמק מביצוע סינתזה במשך זמן רב מדי של זמן לפני הסיום, כמו זה יגרום מסועף מאוד מבנים מסוג &quot;קיפודים&quot;, שהם קשים לפיזור למבנים בודדים יצרו פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ אור הלבן הפוכה להעריך את היעילותשל הסינתזה לניסוי נתון באמצעות נחושת גופרתית. מאז נחושת גופרתית הולך באופן מלא לפתרון באמצעות פרוטוקול זה, הפתרון יופיע פחות כהה מאשר הפתרון מסינתזה באמצעות CNPs. לתעד את הגודל ומידה של חומרים מרוכבים נחושת גופרתית על ידי השוואת צלוחיות עם תנאי סינתזה שונים כגון זמן של סינתזה לפני הסיום. הערה: חומרים מרוכבים מסונתזים בהצלחה יציגו מגוון של אורכים שונים. להתחמק מביצוע סינתזה במשך זמן רב מדי של זמן לפני הסיום, כמו זה יגרום באגרגטים מסועפים מאוד של חומרים מרוכבים, שחלקם יהיו &quot;כמו קיפודים-&quot; במבנה, ואשר קשים לפיזור למבנים בודדים שנוצרו ברגע ש . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז biocomposites הודעה סינתזה-, פתרונות צנטריפוגות של חומרים מרוכבים בצינור צנטריפוגות. הוסף 6 מיליליטר של או מבנים נגזר CNP או מבנים הנגזרים נחושת גופרתית לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. צנטריפוגה למשך 10 דקותב XG 500 ב RT לצורה כדורית. עבור אמצעי אחסון קטן יותר, להוסיף 500 μl של מבנים בפתרון 0.6 מיליליטר צינורות בגודל. צנטריפוגה XG ב 2000 ב RT לפחות 10 דקות כדי ליצור גלולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה למספיק זמן (לפחות 10 דקות לmicrofuges), להציל את הכדור לצפייה בחלק התחתון של הצינור שבו המבנים מרוכזים על ידי הסרת נוזל supernatant מעל גלולה בזהירות. מבני biocomposite נגזרים מנחושת גופרתית מופיעים בצבע כחול ומבנים הנגזרים מCNPs כהים (אפורים לשחור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עוד חומרים מרוכבים לצינור זה ולחזור על התהליך באותו הצינור להתרכז מבנים אם תרצה בכך. כדי לפזר את כדורים מרוכזים, להוסיף נפח הרצוי של פתרון לצינור, ומערבולת למשך 10-30 שניות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבני Sonicate יצרו פעם אחת, כדי להעביר את הגודל הממוצע אוכלוסייה (אורכים) של המבנים להורדת ערכים. מבני מקום במים סטריליים deionized וsonicate בleAST 10 דקות. באמצעות תהליך זה, לאורך זמן, המבנים הופכים למפוצלים וקטנים יותר באורך ממוצע (ראה איור 6 של הטקסט). שינויים במסמך בגדלים מורכבים עם פעמים sonication שונות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה אור לבנה ומצלמה דיגיטלית. </li></ol>

<ol>
	<li>Klinman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+copper-enzyme+family+of+dopamine+beta-monooxygenase+and+peptidylglycine+alpha-hydroxylating+monooxygenase:+resolving+the+chemical+pathway+for+substrate+hydroxylation.">The copper-enzyme family of dopamine beta-monooxygenase and peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase: resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation.</a> The Journal of biological chemistry. 281, 3013-3016 (2006).</li><li>Uauy, R., Olivares, M., Gonzalez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentiality+of+copper+in+humans.">Essentiality of copper in humans.</a> The American journal of clinical nutrition. 67, 952S-959S (1998).</li><li>Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., Copper Moller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=oxide+nanoparticles+are+highly+toxic:+a+comparison+between+metal+oxide+nanoparticles+and+carbon+nanotubes.">oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes.</a> Chemical research in toxicology. 21, 1726-1732 (2008).</li><li>Parekh, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer+nanoencapsulation+of+camptothecin+with+improved+activity.">Layer-by-layer nanoencapsulation of camptothecin with improved activity.</a> International journal of pharmaceutics. 465, 218-227 (2014).</li><li>Harrington, M. J., Masic, A., Holten-Andersen, N., Waite, J. H., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron-clad+fibers:+a+metal-based+biological+strategy+for+hard+flexible+coatings.">Iron-clad fibers: a metal-based biological strategy for hard flexible coatings.</a> Science. 328, 216-220 (2010).</li><li>Keyson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CuO+urchin-nanostructures+synthesized+from+a+domestic+hydrothermal+microwave+method.">CuO urchin-nanostructures synthesized from a domestic hydrothermal microwave method.</a> Materials Research Bulletin. 43, 771-775 (2008).</li><li>Liu, B., Zeng, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoscale+organization+of+CuO+nanoribbons:+formation+of+'dandelions'.">Mesoscale organization of CuO nanoribbons: formation of 'dandelions'.</a> J Am Chem Soc. 126, 8124-8125 (2004).</li><li>Peng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controllable+synthesis+of+self-assembled+Cu2S+nanostructures+through+a+template-free+polyol+process+for+the+degradation+of+organic+pollutant+under+visible+light.">Controllable synthesis of self-assembled Cu2S nanostructures through a template-free polyol process for the degradation of organic pollutant under visible light.</a> Materials Research Bulletin. 44, 1834-1841 (2009).</li><li>Deodhar, S., Huckaby, J., Delahoussaye, M., DeCoster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Aspect+Ratio+Bio-Metallic+Nanocomposites+for+Cellular+Interactions.">High-Aspect Ratio Bio-Metallic Nanocomposites for Cellular Interactions.</a> IOP Conference Series: Materials Science and Engineering. 64, 012014 (2014).</li><li>Montes-Burgos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+nanoparticle+size+and+state+prior+to+nanotoxicological+studies.">Characterisation of nanoparticle size and state prior to nanotoxicological studies.</a> Journal of Nanoparticle Research. 12, 47-53 (2010).</li><li>Wiogo, H. T., Lim, M., Bulmus, V., Yun, J., Amal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+in+biological+media+by+fetal+bovine+serum+(FBS).">Stabilization of magnetic iron oxide nanoparticles in biological media by fetal bovine serum (FBS).</a> Langmuir. 27, 843-850 (2011).</li><li>Yunker, P. J., Still, T., Lohr, M. A., Yodh, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+the+coffee-ring+effect+by+shape-dependent+capillary+interactions.">Suppression of the coffee-ring effect by shape-dependent capillary interactions.</a> Nature. 476, 308-311 (2011).</li><li>Kahler, H., Lloyd Jr, B., Eden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopic+and+Other+Studies+on+a+Copper&#8211;Cystine+Complex.">Electron Microscopic and Other Studies on a Copper&#8211;Cystine Complex.</a> The Journal of Physical Chemistry. 56, 768-770 (1952).</li><li>Furia, E., Sindona, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexation+of+L-cystine+with+metal+cations.">Complexation of L-cystine with metal cations.</a> Journal of Chemical &amp; Engineering Data. 55, 2985-2989 (2010).</li><li>Hawkins, C., Perrin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polynuclear+Complex+Formation.+II.+Copper+(II)+with+Cystine+and+Related+Ligands.">Polynuclear Complex Formation. II. Copper (II) with Cystine and Related Ligands.</a> Inorganic Chemistry. 2, 843-849 (1963).</li><li>Hallman, P., Perrin, D., Watt, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+computed+distribution+of+copper+(II)+and+zinc+(II)+ions+among+seventeen+amino+acids+present+in+human+blood+plasma.">The computed distribution of copper (II) and zinc (II) ions among seventeen amino acids present in human blood plasma.</a> Biochem. J. 121, 549-555 (1971).</li><li>Jensen, L. S., Maurice, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+sulfur+amino+acids+on+copper+toxicity+in+chicks.">Influence of sulfur amino acids on copper toxicity in chicks.</a> The Journal of nutrition. 109, 91-97 (1979).</li><li>Lee, Y., Choi, J. R., Lee, K. J., Stott, N. E., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+synthesis+of+copper+nanoparticles+by+chemically+controlled+reduction+for+applications+of+inkjet-printed+electronics.">Large-scale synthesis of copper nanoparticles by chemically controlled reduction for applications of inkjet-printed electronics.</a> Nanotechnology. 19, 415604 (2008).</li><li>Hume, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+coiled-coil+protein+microfibers.">Engineered coiled-coil protein microfibers.</a> Biomacromolecules. 15, 3503-3510 (2014).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

תוך הערכת השפעות רעילות פוטנציאליות של ננו כולל CNPs, זה היה ציין כי בטווח הארוך, CNPs הפכו מהפצת חלקיקים בתחילה יותר מפוזרת לצורה גדולה יותר, מצטברת (איור 2). במקרים מסוימים, תצורות מצטברות מאוד אלה שיוצרו בצלחת תרבית תאים, בתנאים ביולוגיים, יצרו תחזיות ליניארי ב?...

Copper is a highly reactive metal that in the biological world is essential in some enzyme functions 1,2, but in higher concentrations is potently toxic including in the nanoparticulate form 3,4. Concern over copper toxicity has become more relevant as CNPs and other copper-based nanomaterials are utilized, due to the increased surface area/mass for nanostructures. Thus, even a small mass of copper, in nanoparticle form, could cause local toxicity due to its ability to penetrate the cell and be broken down into reactive forms. Some biological species can complex with and chelate metal ions, and even incorporate them into biological structures as has been described in marine mussels 5. In studying the potential toxic effects of nanomaterials 4, it was discovered that over time, and under biological conditions used for typical cell culturing (37 &#176;C and 5% CO2), stable copper biocomposites could be formed with a high-aspect ratio (linear) structure.
By a process of elimination, the initial discovery of these linear biocomposites, which occurred in complete cell culture media, was simplified to a defined protocol of essential elements needed for the biocomposites to self-assemble. Self-assembly of two types of highly linear biocomposites was discovered to be possible with two starting metal components: 1) CNPs and 2) copper sulfate, with the common biological component being cystine. Although more complex, so called &#8220;urchin&#8221; and &#8220;nanoflower&#8221; type copper-containing structures with nanoscale and microscale features have been previously reported, these were produced under non-biological conditions, such as temperatures of 100 &#176;C or greater 6-8. To our knowledge, synthesis of individual, linear copper-containing nanostructures that are scalable in liquid phase under biological conditions has not been previously described. 
One of the starting materials utilized for synthesis of nanocomposites, namely CNPs, has been reported previously to be very toxic to cells 4. It has recently been reported that after the nanocomposites are formed, these structures are less toxic on a per mass basis than the starting NPs 9. Thus, the synthesis described here may be derived from a biological and biochemical reaction that has utility in stabilizing reactive copper species, both in the sense of transforming the NP form into larger structures and in producing composites less toxic to cells. 
In contrast to many other nanomaterial forms which are known to aggregate or clump upon interaction with biological liquid media 10,11, once formed, the highly linear composites described here avoid aggregation, possibly due to a redistribution of charge which has been previously reported 9. As detailed in the current work, this avoidance of aggregation is convenient for the purposes of working with the structures once formed for at least 3 reasons: 1) composite structures once formed may be concentrated using centrifugation and then easily dispersed again using vortex mixing; 2) formed structures can be decreased in average size by sonication for different periods of time; and 3) the formed linear structures may provide an additional tool for avoiding the recently described &#8220;coffee ring effect&#8221; 12 and thus provide a dopant for creating more evenly distributed coatings of materials, especially those containing spherical particulates.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mini Vortexer</td>
			<td>VWR (https://us.vwr.com)</td>
			<td>58816-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator Model # 2425-2</td>
			<td>VWR (https://us.vwr.com)</td>
			<td>Contact vendor</td>
			<td>Current model calalog # 98000-360</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge (Refrigerated Microcentrifuge)</td>
			<td>Labnet (http://labnetinternational.com/)</td>
			<td>C2500-R</td>
			<td>Model Prism R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Centrifuge Model Z323K</td>
			<td>Labnet (http://labnetinternational.com/)</td>
			<td>Contact vendor</td>
			<td>Current model Z206A catalog # C0206-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator (Ultrasonic Cleaner)</td>
			<td>Branson Ultrasonics Corporation (http://www.bransonic.com/)</td>
			<td>1510R-MTH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius (http://dataweigh.com)</td>
			<td></td>
			<td>Model CP225D similar model CPA225D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX51 Inverted Light Microscope</td>
			<td>Olympus (http://olympusamerica.com</td>
			<td>Contact vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus DP71 microscope digital camera</td>
			<td>Olympus (http://olympusamerica.com</td>
			<td>Contact vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>external power supply unit- white light for Olympus microscope</td>
			<td>Olympus (http://olympusamerica.com</td>
			<td>TH4-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x, 20, and 40x microscope objectives</td>
			<td>Olympus (http://olympusamerica.com</td>
			<td>Contact vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscope</td>
			<td>Hitachi (http://hitachi-hitec.com/global/em/sem/sem_index.html)</td>
			<td>model S-4800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Zeiss (http://zeiss.com/microscopy/en_de/products.html)</td>
			<td>model Libra 120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Work Station Unidirectional Flow Clean Bench</td>
			<td>Envirco (http://envirco-hvac.com)</td>
			<td>model PNG62675</td>
			<td>Used for sterile cell culture technique</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of scalable, metallic high-aspect ratio nanocomposites in a biological liquid medium

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את הסינתזה של שני biocomposites רומן עם מבני יחס גבוה היבט. Biocomposites מורכב מנחושת וציסטין, גם עם חלקיקי נחושת (CNPs) או נחושת גופרתית תורם הרכיב המתכתי. הסינתזה מתבצעת בנוזל בתנאים ביולוגיים (37 מעלות צלזיוס) וצורת מרוכבים עצמיים התאספו לאחר 24 שעות. ברגע שנוצר, חומרים מרוכבים אלה הם מאוד יציבים בשתי תקשורת הנוזלית ובצורה יבשה. חומרים מרוכבים בקנה מידה מננו למייקרו טווח אורך, ומכמה מיקרונים עד 25 ננומטר בקוטר. מיקרוסקופ אלקטרונים סורקים פליטת שדה עם ספקטרוסקופיה רנטגן נפיצה אנרגיה (EDX) הוכיח כי הגופרית הייתה נוכחת במבנים ליניארי נגזר-NP, בזמן שהוא נעדר מחומר CNP מתחיל, ובכך אישר ציסטין כמקור של גופרית בnanocomposites הסופי . במהלך סינתזה של ננו ומיקרו-חומרים מרוכבים ליניארי אלה, במגוון הרחב של אורכים של structures נוצר בכלי הסינתזה. Sonication של התערובת הנוזלית לאחר הסינתזה הודגם לסייע בשליטה בגודל ממוצע של המבנים על ידי צמצום האורך הממוצע עם זמן מוגבר של sonication. מאז המבנים נוצרו הם מאוד יציבים, לא מצבר, ונוצרים בשלב נוזלי, צנטריפוגה עשויה לשמש גם כדי לסייע בריכוז והפרדת חומרים מרוכבים נוצרו.

איור 1 מציג תרשים זרימה סכמטי של הצעדים כדי ליצור סינתזת biocomposites יניארי המתואר בעבודה זו. CNPs או נחושת גופרתית כמתחיל חומרים בשילוב עם מים סטריליים כדי ליצור פתרון 2 מ&quot;ג / מיליליטר, פתרון זה הוא מעורב וsonicated לספק אפילו תערובת, ופתרון נחושת זה הוא מעורב אז ביחס ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium at JoVE.com

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

כאן אנו מציגים פרוטוקול לסנתז רומן, biocomposites יחס גבוה היבט בתנאים ביולוגיים ובתקשורת נוזלית. Biocomposites קנה מידה מננומטרים למיקרומטר בקוטר ואורך, בהתאמה. חלקיקי נחושת (CNPs) ונחושת גופרתית בשילוב עם ציסטין הם המרכיבים העיקריים לסינתזה.

דור של, Nanocomposites יחס Scalable מתכתי גבוהה היבט בביולוגי נוזלי בינוני

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

generation-scalable-metallic-high-aspect-ratio-nanocomposites

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.0K Views.  Centenary College of Louisiana.  כאן אנו מציגים פרוטוקול לסנתז רומן, biocomposites יחס גבוה היבט בתנאים ביולוגיים ובתקשורת נוזלית. Biocomposites קנה מידה מננומטרים למיקרומטר בקוטר ואורך, בהתאמה. חלקיקי נחושת (CNPs) ונחושת גופרתית בשילוב עם ציסטין הם המרכיבים העיקריים לסינתזה. 

Video: Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, each offering its own advantages and shortcomings5,6. Most prominently, due to the microscale device dimensions, a high modulus is required to facilitate implantation into living tissue. Conversely, the stiffness of the device should match the surrounding tissue to minimize induced local strain7-9. Therefore, we recently developed a new class of bio-inspired materials to meet these requirements by responding to environmental stimuli with a change in mechanical properties10-14. Specifically, our poly(vinyl acetate)-based nanocomposite (PVAc-NC) displays a reduction in stiffness when exposed to water and elevated temperatures (e.g. body temperature). Unfortunately, few methods exist to quantify the stiffness of materials in vivo15, and mechanical testing outside of the physiological environment often requires large samples inappropriate for implantation. Further, stimuli-responsive materials may quickly recover their initial stiffness after explantation. Therefore, we have developed a method by which the mechanical properties of implanted microsamples can be measured ex vivo, with simulated physiological conditions maintained using moisture and temperature control13,16,17. 
To this end, a custom microtensile tester was designed to accommodate microscale samples13,17 with widely-varying Young's moduli (range of 10 MPa to 5 GPa). As our interests are in the application of PVAc-NC as a biologically-adaptable neural probe substrate, a tool capable of mechanical characterization of samples at the microscale was necessary. This tool was adapted to provide humidity and temperature control, which minimized sample drying and cooling17. As a result, the mechanical characteristics of the explanted sample closely reflect those of the sample just prior to explantation.
The overall goal of this method is to quantitatively assess the in vivo mechanical properties, specifically the Young's modulus, of stimuli-responsive, mechanically-adaptive polymer-based materials. This is accomplished by first establishing the environmental conditions that will minimize a change in sample mechanical properties after explantation without contributing to a reduction in stiffness independent of that resulting from implantation. Samples are then prepared for implantation, handling, and testing (Figure 1A). Each sample is implanted into the cerebral cortex of rats, which is represented here as an explanted rat brain, for a specified duration (Figure 1B). At this point, the sample is explanted and immediately loaded into the microtensile tester, and then subjected to tensile testing (Figure 1C). Subsequent data analysis provides insight into the mechanical behavior of these innovative materials in the environment of the cerebral cortex.

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

A method is discussed by which the in vivo mechanical behavior of stimuli-responsive materials is monitored as a function of time. Samples are tested ex vivo using a microtensile tester with environmental controls to simulate the physiological environment. This work further promotes understanding the in vivo behavior of our material.

בדיקת Microtensile לסביבה מבוקרת של nanocomposites הפולימר מכאני-מסתגל ל<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; אפיון

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an additional application for these instruments- viewing viral assemblies in a liquid environment. This exciting and novel method of visualizing biological structures utilizes a recently developed microfluidic-based specimen holder. Our video article demonstrates how to assemble and use a microfluidic holder to image liquid specimens within a TEM. In particular, we use simian rotavirus double-layered particles (DLPs) as our model system. We also describe steps to coat the surface of the liquid chamber with affinity biofilms that tether DLPs to the viewing window. This permits us to image assemblies in a manner that is suitable for 3D structure determination. Thus, we present a first glimpse of subviral particles in a native liquid environment.

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Here we describe a procedure to image viral complexes in liquid at nanometer resolution using a transmission electron microscope.

במקום TEM של מכלולים ביולוגיים בנוזל

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

סינתזה של nanofiber קראטין מבוסס על הנדסה ביו רפואית

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of smart soft devices for biomedical applications. Although a number of magnetically-responsive drug delivery systems have demonstrated efficacies through either in vitro proof of concept studies or in vivo preclinical applications, their use in clinical settings is still limited by their insufficient biocompatibility or biodegradability. Additionally, many of the existing platforms rely on sophisticated techniques for their fabrications. We recently demonstrated the fabrication of biodegradable, gelatin-based thermo-responsive microgel by physically entrapping poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) chains as a minor component within a three-dimensional gelatin network. In this study, we present a facile method to fabricate a biodegradable drug release platform that enables a magneto-thermally triggered drug release. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and thermo-responsive polymers within gelatin-based colloidal microgels, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

We present a facile method to fabricate a biodegradable gelatin-based drug release platform that is magneto-thermally responsive. This was achieved by incorporating superparamagnetic iron oxide nanoparticles and poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamide) within a spherical gelatin micro-network crosslinked by genipin, in conjunction with an alternating magnetic field application system.

מוני Microgels לטין היברידי שדה-Responsive המגנטי לשחרור סמים מבוקר

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Preparation of Monodomain Liquid Crystal Elastomers and Liquid Crystal Elastomer Nanocomposites

LCEs are shape-responsive materials with fully reversible shape change and potential applications in medicine, tissue engineering, artificial muscles, and as soft robots. Here, we demonstrate the preparation of shape-responsive liquid crystal elastomers (LCEs) and LCE nanocomposites along with characterization of their shape-responsiveness, mechanical properties, and microstructure. Two types of LCEs &#8212; polysiloxane-based and epoxy-based &#8212; are synthesized, aligned, and characterized. Polysiloxane-based LCEs are prepared through two crosslinking steps, the second under an applied load, resulting in monodomain LCEs. Polysiloxane LCE nanocomposites are prepared through the addition of conductive carbon black nanoparticles, both throughout the bulk of the LCE and to the LCE surface. Epoxy-based LCEs are prepared through a reversible esterification reaction. Epoxy-based LCEs are aligned through the application of a uniaxial load at elevated (160 &#176;C) temperatures. Aligned LCEs and LCE nanocomposites are characterized with respect to reversible strain, mechanical stiffness, and liquid crystal ordering using a combination of imaging, two-dimensional X-ray diffraction measurements, differential scanning calorimetry, and dynamic mechanical analysis. LCEs and LCE nanocomposites can be stimulated with heat and/or electrical potential to controllably generate strains in cell culture media, and we demonstrate the application of LCEs as shape-responsive substrates for cell culture using a custom-made apparatus.

We demonstrate the preparation of siloxane-based and epoxy-based liquid crystal elastomers (LCEs) and LCE nanocomposites. The LCEs are characterized with respect to reversible strain, liquid crystal ordering, and stiffness. As a potential application, we demonstrate their use as shape-responsive substrates in a custom device for active cell culture.

הכנת Monodomain Liquid Crystal אלסטומרים גביש נוזלי Nanocomposites אלסטומר

LCEs are shape-responsive materials with fully reversible shape change and potential applications in medicine, tissue engineering, artificial muscles, and ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

שיטה חדשנית עבור chemiluminescence יצירה וההתבוננות בסביבה ביולוגית

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block co-polymers featuring cholesterol units as side-chain pendant groups, resulting in smectic-A (SmA) liquid crystal elastomers (LCEs). Foam-like scaffolds, prepared using metal templates, feature interconnected microchannels, making them suitable as 3D cell culture scaffolds. The combined properties of the regular structure of the metal foam and of the elastomer result in a 3D cell scaffold that promotes not only higher cell proliferation compared to conventional porous templated films, but also better management of mass transport (i.e., nutrients, gases, waste, etc.). The nature of the metal template allows for the easy manipulation of foam shapes (i.e., rolls or films) and for the preparation of scaffolds of different pore sizes for different cell studies while preserving the interconnected porous nature of the template. The etching process does not affect the chemistry of the elastomers, preserving their biocompatible and biodegradable nature. We show that these smectic LCEs, when grown for extensive time periods, enable the study of clinically relevant and complex tissue constructs while promoting the growth and proliferation of cells.

This study presents a methodology to prepare 3D, biodegradable, foam-like cell scaffolds based on biocompatible side-chain liquid crystal elastomers (LCEs). Confocal microscopy experiments show that foam-like LCEs allow for cell attachment, proliferation, and the spontaneous alignment of C2C12s myoblasts.

סינתזה של ביולוגית Liquid Crystal אלסטומר קצף כמו פיגומים Cell עבור תא תרבויות מרחבי 3D

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and cancer biology. An in vitro cell culture assay is often used to learn about the contribution of different tryptophan catabolites in a disease mechanism and for testing therapeutic strategies. Cell culture medium that is rich in secreted metabolites and signaling molecules reflects the status of tryptophan metabolism and other cellular events. New protocols for the reliable quantification of multiple kynurenines in the complex cell culture medium are desired to allow for a reliable and quick analysis of multiple samples. This can be accomplished with liquid chromatography coupled with mass spectrometry. This powerful technique is employed in many clinical and research laboratories for the quantification of metabolites and can be used for measuring kynurenines.
Presented here is the use of liquid chromatography coupled with single quadrupole mass spectrometry (LC-SQ) for the simultaneous determination of four kynurenines, i.e., kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, and xanthurenic acid in the medium collected from in vitro cultured cancer cells. SQ detector is simple to use and less expensive compared to other mass spectrometers. In the SQ-MS analysis, multiple ions from the sample are generated and separated according to their specific mass-to-charge ratio (m/z), followed by the detection using a Single Ion Monitoring (SIM) mode.
This paper draws the attention on the advantages of the reported method and indicates some weak points. It is focused on critical elements of LC-SQ analysis including sample preparation along with chromatography and mass spectrometry analysis. The quality control, method calibration conditions and matrix effect issues are also discussed. We described a simple application of 3-nitrotyrosine as one analog standard for all target analytes. As confirmed by experiments with human ovary and breast cancer cells, the proposed LC-SQ method&#160;generates reliable results and can be further applied to other in vitro cellular models.

Described here is a protocol for the determination of four different tryptophan metabolites generated in the kynurenine pathway (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, xanthurenic acid, 3-hydroxyanthranilic acid) in the medium collected from cancer cell cultures analyzed by liquid chromatography coupled with a single quadrupole mass spectrometry.

כימות בו זמני של קינורנינים נבחרים שנותחו על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית במדיום שנאסף מתרביות תאים סרטניים

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...