Name: instillation and fixation methods useful in mouse lung cancer research
Uploaded: 2015-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research at JoVE.com

הפרוטוקול הבא מתאר מערכת שעובדת היטב בעכברים גרם 20-35. השיטה יכולה בקלות להיות להתאמה לעכברים גדולים יותר או קטנים יותר פשוט על ידי שינוי גודל קטטר. כל פרוטוקולי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת בעלי החיים באוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס הטיפול ושימוש. 1. ריאות החדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר צינורית מסחרית אינץ &#39;אחד ארוכת 20 גרם תוך ורידי לשימוש עבור אינטובציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את קצה צנתר כיפוף ידני בו כדי ליצור עקמומיות קלה בקצה כפי שמודגם באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בתערובת של קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (15 מ&quot;ג / קילוגרם) שהוחדר IP, ולאשר הרדמה על ידי היעדר תנועת רפלקס. החל משחה וטרינרים בעיניים מייד לאחר הרדמה. מייד לאחר ההרדמה להחיל משחה וטרינרים בעיניים ולתת carprofen (5-10 מ&quot;ג / קילוגרם SQ) לשיכוך כאבים לאחר ניתוח והחדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את mouפרקדן se על פלטפורמה משופעת. כפי שניתן לראות באיור 2, קלסר המשרדי גדול עם לולאות תפר הדביק על עבודות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את החלק הגחוני של הצוואר ולנקות ולחטא את אזור הצוואר עם אלכוהול 70%. עם כפפות חופשיות latex- והפודרה חדשות, להשתמש במכשירי ניתוח לחטא עם אלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מספריים חדים לעשות חתך ניתוחי קטן בצוואר כ -12 מ&quot;מ מתחת לשן החותכת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים משוך בעדינות את העור בצוואר caudally עד קיר הגחון של קנה הנשימה שניתן לראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לחזור בי הלשון ולהכניס את הצינורית עם הקצה המכופף המוטה לכיוון פני השטח הגחון של העכבר. כמו ב1.4, למשוך בעדינות על העור בצוואר, והכנס את הצינורית לקנה הנשימה. הערה: עם קצת תרגול, קטטר תהיה גלויה נעה כלפי מטה את קנה הנשימה. אם זה הולך בוושט, אז לא תהיה תצפית חזותית של התנועה של קטטר. אין חתכיםנעשים בקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהצנתר ראה בקנה הנשימה בצוואר, מתקדם זה כ -5 מ&quot;מ להיות מהימן עבר מיתרי קול, אבל עדיין הרבה מעל קארינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן להנחיל עד 50 μl של נוזל על ידי הזרקה באמצעות הצנתר עם קצה פיפטה טעינת ג&#39;ל. הנח את הקצה ברכזת luer, אבל לפני הזרקת מבט זהירות להתבונן תנועה של הנוזל בקצה סינכרוני עם הנשימה של העכבר. אז להזריק instillate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מזרק 1 מיליליטר, לעשות מייד אינפלציה מהירה יחסית של 0.6 מיליליטר של אוויר לריאות דרך קטטר כדי לעזור להפיץ עמוק נוזל לריאות. הסר את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכמות קטנה של דבק cyanoacrylate כדי לסגור את פצע הניתוח הקטן לפי הוראות עלון לVetBond. מניחים עכברים בכלובים בודדים וחזותיים לפקח עליהם עד שהם מתעוררים ומתנהגים כרגיל ללא כל אינדיקציה discomfאורט. </li></ol> 2. ריאות קיבוע הערה: לאחר שכל הליכי הניסוי נעשים בעכבר, ניתן הכינו הריאות לעיבוד היסטולוגית על ידי קיבוע עם פורמלדהיד (או כל מקבע רצוי אחרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר עם הליך מקובל IACUC. לעכבר הנציג מוצג בסרטון, משמש נקע בצוואר הרחם של עכבר הרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הנשמה (אם לא עשה) על ידי ניתוח חושף את הצד הגחוני של קנה הנשימה, מה שהופך אותו חתך קטן, והחדרת קצה מחט בדל 18 G לתוך קנה הנשימה, ולקשור אותו עם חוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בזהירות את בית החזה עם חתך קו האמצע, לחתוך את הסרעפת, ולהסיר את קירות חזה לרוחב כדי לחשוף את הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את קצה luer של המחט למאגר על דוכן טבעת המכיל פורמלדהיד. ראה איור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המשטח העליון של פורמלדהיד 25 סנטימטרים מעל לרמה של mouSE. ראה איור 3. הבא לוודא שאין אוויר בצינור הקיבעון על ידי הפעלת נוזל החוצה סוף ברזלים. חבר את קצה luer של הצינורית לקנה הנשימה לצינורות המאגר. פתח את השסתום כדי לנפח את הריאות עם פורמלדהיד. השאר את הריאות תחת לחץ לפחות 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את השסתום כדי לנפח את הריאות עם פורמלדהיד. השאר את הריאות תחת לחץ לפחות 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לקשור את קנה הנשימה מעבר לקצה של מחט הבדל. זה עשוי לעזור למשוך בחזרה לאט על המחט לחשוף יותר של קנה הנשימה uncannulated. כשקשור באופן מאובטח, להסיר את ברזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לנתח את הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הריאות בפורמלדהיד הלילה. פעמים יותר בסדר, וכמה כתמים או לנהלים עלולים לציין שעות מסוימות. כמו כן כל fixatives נוזל אחר, כגון Z-תיקון יכול לשמש להחדרה והטבילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני עיבוד היסטולוגית נוסף, למדודקבוע הריאה כפי שתואר הבא הנפח. </li></ol> 3. מדידה של נפח הריאות הקבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את השימוש בעיקרון ארכימדס כפי שמודגם באיור 4 נפח הריאות. הסר את הריאות קבועות מפורמלדהיד ולנתח את הלב ואת כל רקמה הלא-ריאה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במכשיר שנבנה בעבר פשוט תוצרת בית תמיכת תיל המשמש כדי לשמור על הריאות מתחת למים באופן מלא. הערה: מכשיר זה צריך להיעשות בקנה אחד עם לפי המאזן נמצא בשימוש. מכשיר טיפוסי מוצג באיור 5 עשוי מהפלסטיק וטפטפות חוט הדק (20 G). מערכת זו פועלת היטב עם האיזון בשימוש בוידאו, אבל יכולה בקלות להיות מותאמת למרבית מאזני המעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס עם ≈200 מיליליטר של מים על האיזון וטרה עם הכלוב תומך במקום במים. ראה איור 6 הסר את כלוב המתכת.; למקם את הריאות על פני המים ולחצו מתחת למיםעם הכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המשקל על היתרה. מספר זה משקף את נפח מים שנעקרו ולכן מדידה ישירה של נפח הריאות. להיות זהיר כדי לוודא ריאות או תפר או בכל חלק של כלוב התיל לא נוגע בצדדים או בתחתית של הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדיוק, לחזור על מדידה זו. הסר את הריאות מהמים, ויבשות ברקמה. הטרה הכוס עם כלוב במקום שוב ולחזור על מדידת נפח ריאות. שתי מדידות הנפח אמורים להיות בממוצע. הערה: אם הריאות נשארות בפורמלין ליותר משבוע על, האוויר לריאות יפורק בנוזל. כאשר זה קורה, הריאות ישקעו, כך שזה כבר לא צורך להשתמש בכל מכשיר כמו באיור 5 כדי לשמור על הריאות שקועות. במקרה כזה הנפח ניתן למדוד על ידי פשוט על ידי לחיצה על הריאות על ידי אחד ממייתרי התפר עד שהוא שקוע לחלוטין כפי שמודגם באיור 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice.">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li><li>Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cellular+profile+and+lung+function+with+repeated+bronchoalveolar+lavage+in+individual+mice.">Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice.</a> Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).</li><li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation:+description,+evaluation+and+comparison+with+transillumination.">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).</li><li>Spoelstra, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+endotracheal+intubation+of+mice.">A novel and simple method for endotracheal intubation of mice.</a> Laboratory. 41, 128-135 (2007).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technique+for+retrograde+intubation+in+mice.">A technique for retrograde intubation in mice.</a> Lab animal. 35, 39-42 (2006).</li><li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies.">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).</li><li>Vergari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+of+orotracheal+intubation+in+mice.">A new method of orotracheal intubation in mice.</a> European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).</li><li>Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-assisted+orotracheal+intubation+in+mice.">Video-assisted orotracheal intubation in mice.</a> Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).</li><li>Hastings, R. H., Summers-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Laryngoscopy+in+Mice.">Direct Laryngoscopy in Mice.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).</li><li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society/European+Respiratory+Society:+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure.">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).</li><li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy.">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).</li><li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung.">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601 (2013).</li><li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">A simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li><li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation.">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).</li><li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+10%+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage.">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage.</a> American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).</li><li>Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Mouse+Lung+Volumes+Inflated+with+Air+and+Instilled+Fixatives.">Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, A549 (2006).</li><li>Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+measurement+of+lung+volumes+in+mice.">In vivo measurement of lung volumes in mice.</a> Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).</li></ol>

יש הנהלים שתוארו כאן יש מספר יתרונות. ראשון הציוד הנדרש הוא פשוט וזול. שנית, אינטובציה יכולה להיעשות במהירות עם כמה טעויות. שלישית, את היכולת לתקן את הריאות בלחץ מתמיד, ולאחר מכן למדוד את נפח ריאות הקבוע מאפשרת כימות נכונה של מבנים או תאים בריאה 10. <p class="jove_content" ...

למספר הסיבות, סרטן הריאות לא נחקר באופן נרחב בעכבר. אחת סיבות לכך היא שגישה לריאות קשה מאוד in vivo, וניתוח כמותי של ריאות קבועים לא נעשה בדרך כלל. השיטות שתוארו במאמר זה נועדו לתקן את המצב. המטרות הן מסמך לתאר שיטות פשוטות שיסייעו מאוד בהגדרה והניתוח של ריאות עכבר עם סרטן ריאות או פתולוגיות אחרות. למרות שאף אחד של גישות אלה הם חדשים לגמרי, הם לא הוצגו יחד כשיטות עצמאיות באופן פשוטים כפי שמתואר כאן. יש כבר מספר כתבי היד שתארו שיטות לאינטובציה של ריאות העכבר בעיקר לצורך עושה תפקוד הריאתי חוזר או שטיפה ברונכואלוואולרית בעכברים בודדים במחקרים ארוכי טווח. מאז שנייר מקורי, היו כמה עיתונים אחרים שתארו גישות שונות לmousאינטובציה דואר 1 -9. בעוד שכל אחת מהשיטות הללו יכולים לשמש בהצלחה, הם בדרך כלל דורשים הכשרה רבה, ולעתים קרובות הם לא בלי שיעור כישלון טריוויאלי. בנוסף, על מנת לבצע מדידות תפקוד הריאתי, הצינורית צריכה להתאים את קנה הנשימה חזק מספיק כך שאין דליפת אוויר. עם זאת, עוד שימוש מעשי לאינטובציה הוא לספק סוכנים ספציפיים (תאים סרטניים או עלבונות אחרים) או תרופות טיפוליות ישירות לריאות. הליך כזה אינו דורש צינורית הולמת הדוקה ולא כל ציוד תפקוד הריאתי מתוחכם. התכונה החדשנית של שיטה זו המוצגת כאן כרוכה הליך כירורגי קטין שמאפשר אינטובציה, ללא כל אפשרות של צינורית הזנת הוושט. גישה פשוטה זו מאפשרת אינטובציה מוצלחת עם הכשרה או ניסיון מועט יחסית. כ -30 עכברים / שעה ניתן לטפל באמצעות גישה זו עם שיעור כישלון מתקרב לאפס. ברגע שלאהוא העכברים מוכנים להקריב, הריאות נפצעו או סרטניים אז יכולות להיות הוסרו להיסטולוגית וניתוח פתולוגי. עם זאת, על מנת לכמת כראוי כל משתנים היסטולוגית להשוואה עם ריאות אחרות, זה חיוני כדי לתקנן את נהלי הקיבעון ולכמת את נפח ריאות הקבוע 10 כראוי. מאמר זה מתאר בפירוט את הנהלים הפשוטים שיאפשר נהלי קיבעון סטנדרטיים, כמו גם דרך למדוד קבוע נפח הריאות. הנפח הוא מדד חיוני בכימות של היסטולוגיה, שכן ללא קביעה כאמור נפח, ניתן למדוד רק צפיפות היחסית 10. ברגע שנפח הריאות ידוע, עם זאת, מדידות מוחלטות של תאים ומדידות מבניות אחרות בריאות אז יכולות להיות לכימות.

<table><tbody><tr><td>Laboratory Balance</td><td>Ohaus</td><td>Adventurer Pro Model AV 313&amp;nbsp;</td><td>Other balances can be used if they have a range of 1-300 g</td></tr><tr><td>20 g Luer intravenous catheter</td><td>Insylte</td><td></td><td>Several other possible vendors, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Jelco Optiva</td></tr><tr><td>500 ml laboratory bottle</td><td>Various</td><td></td><td>Several other possible vendors</td></tr></tbody></table>

instillation and fixation methods useful in mouse lung cancer research

היכולת להחדיר סוכנים חיים, תאים, או כימיקלים ישירות לתוך הריאות מבלי לפגוע או להרוג את העכברים היא כלי חשוב בחקר סרטן הריאה. אמנם יש מספר השיטות שפורסמו מראים כיצד לצנתר את העכברים למדידות תפקוד הריאתי, אף אחד מהם ללא בעיות פוטנציאליות להחדרה לקנה הנשימה מהירה בקבוצות גדולות של עכברים. בעבודה הנוכחית, שיטה פשוטה ומהירה מתוארת המאפשרת חוקר לבצע instillations כזה בצורה יעילה. השיטה אינה דורשת כל כלים או תאורה מיוחדים וניתן ללמוד עם תרגול מעט מאוד. היא כרוכה בהרדמת עכבר, ביצוע חתך קטן בצוואר כדי להמחיש את קנה הנשימה, ולאחר מכן החדרת צנתר לוריד ישירות. החתך הקטן סגור במהירות עם דבק רקמות, והעכברים אפשרו להתאושש. סטודנט או טכנאי מיומן יכול לעשות instillations בשיעור ממוצע של 2 דקות / עכבר. ברגע שלאהוא הסרטן שהוקם, יש לעתים קרובות צורך בניתוח הכמותי היסטולוגית של הריאות. באופן מסורתי פתולוגים בדרך כלל לא טורח לתקן אינפלציה ריאות במהלך קיבעון, וניתוחים מבוססים לעתים קרובות על שיטת ניקוד שיכול להיות די סובייקטיבי. אמנם זה עשוי להיות מתישהו מספיק הולם לאומדנים גולמי של הגודל של גידול ריאה, כל כימות stereological נכון של מבנה ריאות או תאים דורש הליך קיבעון לשחזור ומדידת נפח ריאות שלאחר מכן. כאן אנו מתארים נהלים אמינות פשוטים עבור שני תיקון הריאות תחת לחץ ולאחר מכן מדידה מדויקת הקבוע נפח הריאות. הדרישה היחידה היא משקל למעבדה כי הוא מדויק על פני טווח של G-300 מ&quot;ג 1. הנהלים שהוצגו כאן ובכך יכולים לשפר באופן משמעותי את היכולת ליצור, לטפל, ולנתח סרטן הריאות בעכברים.

ההליך לתאר בפרוטוקול הראשון אינו בעצמו הביא לשום תוצאות כלליות. זה רק מתאר אמצעי אמין מאוד להחדיר חומרים ישירות לקנה הנשימה. איור 7 מציג דוגמא של ריאות בי trypan הכחול הוחדרה עם השיטה המתוארת כאן. יש הפצה נרחבת של הצבע, דומה למה שכבר ראה עם צבעים אחרים או קליעים נ...

Watch this Scientific Journal Video about Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research at JoVE.com

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

המטרה של מאמר זה היא לתאר שיטות פשוטות שיסייעו מאוד בהגדרה והניתוח של ריאות עכבר עם סרטן ריאות או פתולוגיות אחרות. אנו מציגים 3 פרוטוקולים פשוט ואמין לביצוע instillations ריאות, קיבעון, ומדידות נפח ריאות.

שיטות החדרה וקיבוע שימושיות בחקר סרטן ריאות עכבר

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

instillation-and-fixation-methods-useful-in-mouse-lung-cancer-research

Research

JoVE Journal

Medicine

28.2K Views.  Johns Hopkins University.  המטרה של מאמר זה היא לתאר שיטות פשוטות שיסייעו מאוד בהגדרה והניתוח של ריאות עכבר עם סרטן ריאות או פתולוגיות אחרות. אנו מציגים 3 פרוטוקולים פשוט ואמין לביצוע instillations ריאות, קיבעון, ומדידות נפח ריאות. 

Video: Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Perfusion and Inflation of the Mouse Lung for Tumor Histology

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform necropsies rapidly and efficiently from studies without sacrificing the quality of the tissues procured. The goal of this protocol is to present a method to rapidly perfuse, inflate, and fix mouse lungs for downstream histological analysis. This method does not standardize lung inflation; thus, it does not require any special procedures or equipment and instead simply instills fixative directly through the trachea following perfusion through the heart. This allows for sufficient estimation of tumor size, histology, and scoring. This also allows for the collection of frozen tissue prior to lung tissue fixation. This method is limited in that it does not allow for later morphometric quantification of the lung; however, it is more than sufficient for lung tumor analysis from genetically engineered mouse models (GEMMs), syngeneic models, as well as xenograft tumor and metastasis studies.

The purpose of this method is to present a simple and efficient method for the perfusion, inflation, and fixation of mouse lungs for the examination of lung tumor pathology and evaluation of metastases to the lung.

זלוף ואינפלציה של ריאת העכבר עבור היסטולוגיה גידול

The ability to evaluate lung histology is critical for the fields of lung cancer research and cancer metastasis. It is equally important to perform ...

Cancer Research

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice. Using this approach, one can target delivery of test solutes or solids (such as lung therapeutics, surfactants, viruses, and small oligonucleotides) into the distal lung. Tracheal instillations may be the preferred methodology, over inhalation protocols that may primarily target the upper respiratory tract and possibly expose the investigator to potentially hazardous substances. Additionally, in using the tracheal instillation protocol, animals can fully recover from the non-invasive procedure. This allows for making subsequent physiological measurements on test animals, or reinstallation using the same animal. The amount of instillate introduced into the lung must be carefully determined and osmotically balanced to ensure animal recovery. Typically, 30-75 &mu;L instillate volume can be introduced into mouse lung.

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice.

החדרה ישירה של קנה הנשימה אל הריאות מומסים עכבר

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs.  This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the ...

Biology

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

הזרקה של תאים syngeneic Murine מלנומה מנת לקבוע את פוטנציאל גרורתי שלהם בתוך הריאות

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם Bleomycin מגדיל את היעילות של Orthotopic ריאות סרטן תא Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Lung Fixation under Constant Pressure for Evaluation of Emphysema in Mice

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung fixation to produce reliable histological specimens of the lung. Due to the nature of the lung&rsquo;s structural composition, which consists largely of air and tissue, there is a risk that it collapses or deflates during the fixation process. Various lung fixation methods exist, each of which has its own advantages and disadvantages. The lung fixation method presented here utilizes constant pressure to enable optimal tissue evaluation for studies using an emphysematous mouse lung model. The main advantage is that it can fix many lungs with the same condition at one time. Lung specimens are obtained from chronic cigarette smoke-exposed mice. Lung fixation is performed using specialized equipment that enables the production of constant pressure. This constant pressure maintains the lung in a reasonably inflated state. Thus, this method generates a histological specimen of the lung that is suitable to evaluate cigarette smoke-induced mild emphysema.

Presented here is a useful protocol for lung fixation that creates a stable condition for histological evaluate of lung specimens from a mouse model of emphysema. The main advantage of this model is that it can fix many lungs with the same constant pressure without lung collapse or deflation.

קיבעון ריאה תחת לחץ מתמיד על הערכה של אמפיזמה בעכברים

Emphysema is a significant feature of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Studies involving an emphysematous mouse model require optimal lung ...

<meta charset="utf8"></head><body>שימור לוקליזציה של נבגים פטרייתיים בריאות לניתוח מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and bronchioles, branch until terminating in the alveolar airspace where gas exchange occurs. Infections originating in the bronchioles or alveoli elicit distinct host responses and disease manifestations. Therefore, understanding precisely where spores naturally localize in the lungs, particularly soon after infection, expands opportunities for investigation of host-pathogen interactions. Herein, we detail an in-situ analysis of lungs from mice infected with Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&#916; arthroconidia. Conventional methods for histological preservation involve liquid inflation of the airways with a fixative solution, which displaces the natural location of aspirated fungal particles, pushing spores from proximal bronchioles to terminal airspaces.
Conversely, this method of air-inflation with blood vasculature perfusion-fixation preserves the physiologic position of fungal spores within the bronchioles. Moreover, we describe a simple approach to cryopreserving, embedding, and imaging lung specimens. We also share high-throughput computational techniques via the open-source QuPath program to analyze the spatial distribution of fungal spores within the lung. The method presented here is simple and quick, requires minimal equipment to perform, and can be easily adapted for use with many respiratory fungal infection models.

<meta charset="utf8"></head><body>שיטה יעילה להדמיית ריאות עכברים המשמרת דינמיקה מרחבית של נבגי פטריות בדרכי הנשימה

We present a method for a fungal pathogenesis model that preserves the natural positioning of fungal spores in the lung airways for analysis via fluorescent microscopy.

שיטה יעילה להדמיית ריאות עכברים המשמרת דינמיקה מרחבית של נבגי פטריות בדרכי הנשימה

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

Immunology and Infection

Using Nicotine in a Silica-Exposed Mouse Model to Promote Lung Epithelial-Mesenchymal Transition

Smoking and exposure to silica are common among occupational workers, and silica is more likely to injure the lungs of smokers than non-smokers. The role of nicotine, the primary addictive ingredient in cigarettes, in silicosis development is unclear. The mouse model employed in this study was simple and easily controlled, and it effectively simulated the effects of chronic nicotine ingestion and repeated exposure to silica on lung fibrosis through epithelial-mesenchymal transition in human beings. In addition, this model can help in the direct study of the effects of nicotine on silicosis while avoiding the effects of other components in cigarette smoke.
After environmental adaptation, mice were injected subcutaneously with 0.25 mg/kg nicotine solution into the loose skin over the neck every morning and evening at 12 h intervals over 40 days. Additionally, crystalline silica powder (1-5 &#181;m) was suspended in normal saline, diluted to a suspension of 20 mg/mL, and dispersed evenly using an ultrasonic water bath. The isoflurane-anesthetized mice inhaled 50 &#181;L of this silica dust suspension through the nose and were awoken via chest massage. Silica exposure was administrated daily on days 5-19.
The double-exposed mouse model was exposed to nicotine and then silica, which matches the exposure history of workers who are exposed to both harmful factors. In addition, nicotine promoted pulmonary fibrosis through epithelial-mesenchymal transformation (EMT) in mice. This animal model can be used to study the effects of multiple factors on the development of silicosis.

This study describes a mouse model to study the synergistic effect of nicotine on the progression of pulmonary fibrosis in experimental silicosis mice. The dual-exposure mouse model simulates the pathological progression in the lung after simultaneous exposure to nicotine and silica. The methods described are simple and highly reproducible.

שימוש בניקוטין במודל עכבר שנחשף לסיליקה לקידום מעבר אפיתל-מזנכימלי של הריאות

Smoking and exposure to silica are common among occupational workers, and silica is more likely to injure the lungs of smokers than non-smokers. The role ...

שיטות החדרה וקיבוע שימושיות בחקר סרטן ריאות עכבר

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST